3) Conclusions
De manière générale, la deuxième
phase de production et purification du processus d'expression du
programme 3PM n'a pas permis de valider les meilleures conditions issues
du criblage en microplaques.
En ce qui concerne les domaines PROcatal et PROinser, bien que
la transposition à grande échelle soit favorable, la
tendance à l'agrégation constatée de ces 2 domaines
a considérablement compliqué leur purification. De plus,
malgré la réussite de la coupure enzymatique en solution par
la protéase TEV, nous n'avons pas été en mesure de les
séparer
de leur partenaire de fusion. Ces résultats
mettent ainsi en évidence le rôle complexe et ambigu du
partenaire de fusion qui semble, dans certains cas, capable
d'augmenter la solubilité générale d'une protéine
en fusion, sans pour autant favoriser son repliement natif et stable, et par
conséquent, indépendant. De manière intéressante,
les profils de stabilité et de purification de ces 2 domaines, de taille
très différente, sont tout à fait identiques. Ceci laisse
supposer que l'instabilité du domaine catalytique (PROcatal) pourrait
être due à la présence
de l'insertion (PROinser) dans sa région N-terminale.
Le caractère toxique du domaine PROter,
révélé à l'issu du criblage en microplaques,
a été confirmé lors de la
production à grande échelle : le vecteur d'expression
PROter en fusion avec NusA induit d'une part, une expression très
faible de protéine soluble et d'autre part, une diminution de la
vitesse de croissance bactérienne. De plus, l'analyse de cette
expression fait apparaître une protéolyse partielle de la
protéine de fusion. Au vu de ces résultats, la production
de ce domaine n'est donc pas adaptée chez l'organisme E.
coli.
Dans le cas de la protéine entière, la
stratégie d'expression du domaine PROentier en fusion avec le
partenaire MBP est à première vue une réussite.
Les différentes étapes de purification de la protéine
de fusion, de clivage par la TEV, et de séparation du partenaire, ont
globalement rempli leur objectif. Le seul désagrément se situe au
niveau de la transposition à grande échelle qui, conduisant
à une expression très faible de protéine, constitue un
véritable obstacle dans le cas d'une étude structurale.
4) Matériels et Méthodes
4.1) Production à grande échelle et
extraction des protéines
4.1.1) Production à grande
échelle
La production à grand volume est réalisée en
culture de 300 mL dans un erlenmeyer
de 3L, ou en fernbach de 1 L, à partir des meilleures
conditions définies à l'issue du criblage. Pour chaque
construction, 50 uL de bactéries thermocompétentes Rosetta
pLysS sont préalablement transformées par 20 ng de
vecteur d'expression par choc thermique à 42°C
pendant 45 secondes. Le produit de transformation est ensuite
mélangé avec 200 uL de SOC, incubé 1 heure à
37°C, puis étalé sur boîte LB/agar contenant
100 ug/mL d'ampicilline et
35 ug/mL de chloramphénicol. Après une nuit
d'incubation à 37°C, une préculture de 30 mL contenant les
mêmes concentrations d'antibiotiques est inoculée avec plusieurs
colonies, puis placée sous une agitation de 250 rpm à 37°C.
Les cultures de bactéries Rosetta contenant les 2 antibiotiques sont
ensemencées avec un volume de préculture de manière
à obtenir une DO600 initiale de 0.05, puis incubées à
37°C sous une agitation de 250 rpm. Après induction avec
1 mM d'IPTG lorsque la DO600 atteint 1.2, les cultures sont
placées à 20°C pendant 14 heures sous une agitation de 250
rpm. A l'issu de ce délai, la croissance bactérienne est
stoppée par centrifugation à 2830xg pendant 20 minutes et
à 4°C.
4.1.2) Lyse des bactéries et séparation des
fractions soluble et insoluble
Les culots bactériens sont congelés dans
l'azote liquide, repris au 1/20e dans un tampon de lyse (100
mM de Tris-HCl pH 8.0, 150 mM de NaCl, 5 % de glycérol, 1 uM de
phosphoramidon, et 1 mM de PMSF), puis cassés à la
presse d'Eaton (technique de lyse mécanique par application d'une
pression de 6 tonnes sur des cellules congelées à
-80°C, dirigées vers un orifice de petit diamètre). 0.5 U/mL
de benzonase et 10 mM de MgCl2 sont ajoutés au broyat. Après une
incubation de 15 minutes à 30°C, une centrifugation à
40000xg pendant 30 minutes à 4°C permet de séparer les
fractions soluble et insoluble. Le culot est repris dans le même
volume que le surnageant avec du SDS 2%. Les protocoles d'analyse
SDS-PAGE et Western-blot sont identiques à ceux
présentés dans la partie Matériels et Méthodes
du chapitre 2 (cf. § 4.2.3).
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