4.2) Purification des protéines de fusion et des
protéines d'intérêt
4.2.1) Purification sur résine
d'amylose
La purification des protéines en fusion avec le partenaire
protéique MBP est réalisée
sur résine d'amylose Amylose Resin
(Biolabs) de capacité théorique 3 milligramme par
millilitre de résine. Le volume de résine introduit dans la
colonne est choisi en fonction de la quantité de protéine de
fusion estimée dans les surnageants de lyse. La colonne est
préalablement équilibrée avec 10 volumes de tampon
d'équilibration contenant, 30 mM de Tris-HCl (pH 7.8), 200 mM de
NaCl, 1 mM de PMSF, et 2 mM de â-mercapto-éthanol. Le débit
est de 1 mL/min pour toute la purification. Après chargement des
surnageants de lyse, la résine est lavée avec le tampon
d'équilibration jusqu'à retour de l'absorbance mesurée
à 280
nm à la ligne de base (LKP Control Unit
UV-1, Pharmacia). L'élution est réalisée avec
ce même tampon contenant 10 mM de maltose. Le volume des fractions
recueillies est de 5 mL
ou 10 mL. Elles sont analysées par SDS-PAGE et
quantifiées par mesure de la DO280.
4.2.2) Purification sur résine de
nickel
Des colonnes HisTrap HP (Amersham) de 1 mL ou 5 mL,
pré-chargées en résine de nickel, et de capacité
théorique 12 mg/mL, sont utilisées pour séparer le
partenaire de fusion après clivage ou purifier la protéine
hétérologue NusA-PROter. Après équilibration de
la colonne, à un débit de 1 mL/min, avec 10 volumes de tampon de
fixation contenant, 100 mM
de Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM de NaCl, 1 mM de PMSF, 2 mM de
â-mercapto-éthanol, et 20 mM d'imidazole (pour limiter les
interactions non spécifiques), les échantillons sont
introduits à un débit de 0.5 mL/min. La valeur du débit
est ensuite portée à 1 mL/min jusqu'à
la fin de la purification. La résine est lavée
avec du tampon de fixation jusqu'à retour de la DO600 à la ligne
de base initiale. La composition du tampon d'élution est identique
à celle du tampon de fixation et contient en plus de l'imidazole
à une concentration de 500 mM. L'élution est menée
avec un gradient linéaire d'imidazole de 20 à 200, 300,
ou 400 mM (selon les protéines purifiées) sur 10 volumes
de colonne. Un lavage est finalement réalisé avec un
tampon contenant 1 M d'imidazole sur 5 volumes de colonne. Le volume
des fractions recueillies est de 1 mL ou 2 mL (collecteur
GradiFrac, Pharmacia). Elles sont analysées par SDS-PAGE et
quantifiées par mesure de la DO280. La quantité d'imidazole
dans
les fractions d'élution est vérifiée en
comparant leur absorbance mesurée à 300 nm à celle de
solutions contenant des concentrations d'imidazole connues.
4.3) Clivage du partenaire de fusion par la
protéase TEV
La présente du motif ENLYFQG, reconnu par la
protéase TEV, en aval de la séquence
de la protéine d'intérêt permet le clivage
du partenaire de fusion. Par souci de réduction des coûts, cette
protéase est produire au LMP sous forme recombinante chez E.
coli. Les fractions issues de la première étape de
purification sont soumises à une coupure en solution en
introduisant 8% de TEV, soit 8 mg pour 100 mg de protéine de
fusion. Elles sont ensuite
incubées à 4°C pendant environ 14 heures sous
légère agitation.
Chapitre 5 : Conclusions et Perspectives
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