Memoire Online - Production de domaines recombinants PRODH en vue de l'analyse structurale & Caractérisation de la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine par RMN et Modélisation Moléculaire

Commercialisée par la société Invitrogen, la technologie Gateway s`appuie sur les propriétés de recombinaison homologue du bactériophage lambda au niveau des sites spécifiques att, qu'il utilise naturellement pour s'intégrer dans le génome d'E. coli (Landy,

1989). Ce mécanisme naturel a été détourné pour en faire un système de recombinaison in vitro simple et efficace. Le système de clonage Gateway présente de nombreux avantages et permet notamment de s'affranchir des étapes de restriction-ligation obligatoires lors d'un clonage classique. L'insertion d'un insert d'ADN est spécifique et directionnelle (conservation du cadre de lecture), et le moyen de sélection est rapide. Il est alors facile d'obtenir différents plasmides d'expression à partir d'un seul plasmide d'entrée.

Le principe de la méthodologie de construction des différents vecteurs d'expression à partir de la technique Gateway est représenté dans la Figure A1. La première étape consiste à adjoindre aux gènes encodant les domaines PRODH les 2 sites de recombinaison spécifique, attB1 en amont, et attB2 en aval du gène, par PCR d'assemblage. Un site de clivage reconnu

par la protéase TEV (Tobacco Etch Virus) est également incorporé en amont du gène d'intérêt. Les amplicons de PCR, flanqués des sites attB, sont alors clonés dans le vecteur donneur pDONR221 (Invitrogen) possédant les sites attP1 et attP2 par réaction de BP clonase. Ce vecteur donneur contient également un gène de résistance à la kanamycine (Km^R), ainsi qu'un second au chloramphénicol (Cm^R) inséré entre les 2 sites attP. Les enzymes de la

BP clonase reconnaissent de manière spécifique les sites attB et attP, ce qui conduit à l'insertion du gène d'intérêt dans le vecteur donneur. Il se forme alors par cette réaction un vecteur d'entrée possédant le gène de résistance à la kanamycine (Km^R), les sites de recombinaison homologue AttL1 et AttL2, et le gène d'intérêt.

Le vecteur d'entrée est utilisé pour obtenir l'ensemble des vecteurs d'expression à partir de vecteurs pDEST, qui contiennent un gène encodant un des 6 partenaires de fusion,

un gène de résistance à l'ampicilline (Amp^R), et les sites de recombinaison attR1 et attR2. Le

gène d'intérêt est « transféré » du vecteur d'entrée au vecteur d'expression de manière unidirectionnelle grâce aux enzymes de la LR clonase qui reconnaissent les sites attL et attR

de manière spécifique. Au final, ces plasmides d'expression comportent, un gène de

résistance à l'ampicilline (Amp^R), une étiquette 6xHis, un gène encodant un des 6 partenaires

de fusion, le gène d'intérêt, et un site de clivage par la TEV inséré entre le partenaire et le gène d'intérêt.

Figure A1 : Résumé des principales étapes de la construction des vecteurs d'expression à

Outre l'amplification des gènes d'intérêt, la PCR d'assemblage a pour objectif d'adjoindre, un site de reconnaissance AttB1 et un site de clivage reconnu par la TEV en amont du gène, et un site de reconnaissance AttB2 et une étiquette Tag-S en aval du gène. Le Tag-S encode un fragment protéique qui permet de détecter l'expression des protéines de fusion par un test de fluorescence. Dans le cas des domaines PRODH, ce test, qui était en cours de mise au point, n'a pas été utilisé et l'expression des protéines hétérologues a été uniquement analysée sur gel SDS-PAGE.

L'introduction de longues séquences de nucléotides non spécifiques du gène en amont

et en aval des gènes d'intérêt (respectivement 57 et 60 bp) nécessite de réaliser 2 réactions de PCR successives. La première PCR (PCR1) fait intervenir une amorce sens spécifique du gène contenant le site de clivage par la TEV et une partie du site attB1, ainsi qu'une amorce anti-sens complémentaire à la fin du gène comportant l'étiquette Tag-S. L'ensemble des amorces utilisées pour amplifier les gènes encodant les domaines PRODH est reporté dans le Tableau A1.

PCR

Amorces

Séquences

PCR1

^PROentierAS

5'-GGCTTCGAGAATCTTTATTTTCAGGGCGGACATTTTGTAGCCGGGGAG-3'

5'-TTAGCTGTCCATGTGTTGGCGTTCGAATTTAGCAGCAGCGGTTTCTTTCTAGGC AGGGCGATGGAAGAGGTT-3'

^PROcatalAS

5'-GGCTTCGAGAATCTTTATTTTCAGGGCGGACATTTTGTAGCCGGGGAG-3'

5'-TTAGCTGTCCATGTGTTGGCGTTCGAATTTAGCAGCAGCGGTTTCTTTCTAGGC AGGGCGATGGAAGAGGTT-3'

^ProterAS

5'-GGCTTCGAGAATCTTTATTTTCAGGGCGGAGGAGGGTCGGCAACGGCAGTG-3'

5'-TTAGCTGTCCATGTGTTGGCGTTCGAATTTAGCAGCAGCGGTTTCTTTCTAGGA CTCGTGGTCTTCCCCGGC-3'

^ProinserAS

5'-GGCTTCGAGAATCTTTATTTTCAGGGCGGGAGACCACAGTTTCTGCTGCAG-3'

5'-TTAGCTGTCCATGTGTTGGCGTTCGAATTTAGCAGCAGCGGTTTCTTTCTACTC CTCCTCCTCAGTGAACCCGGA-3'

PCR2

AttB1-TEV-S

^{5'-GGGGGGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAGAATCTTTATTTTCAG}

GGC-3'

AttB2-TagS-AS

^{5'-GGGGGGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTTAACTGTCCATGTGCTG}

GCGTTCGAA-3'

Tableau A1 : Amorces sens (S) et anti-sens (AS) utilisées pour les PCR d'assemblage. Les

oligonucléotides qui apparaissent en orange correspondent au site de recombinaison AttB1,

en bleu au site de clivage par la TEV, en violet au Tag-S, et en rouge au site de reconnaissance AttB2.

Les mélanges réactionnels se composent de 12 ng de vecteur de départ contenant le gène d'intérêt, 0.1 mM de dNTP, 0.4 uM d'amorce sens, 0.4 uM d'amorce anti-sens, 4.5 unités de polymérase, et 5uL de tampon Pfu 10X dans un volume final de 50 uL complété avec de l'eau milliQ. L'enzyme utilisée est la Pfu DNA polymerase commercialisée par Promega. Ces mélanges sont introduits dans des barrettes de 16 tubes PCR de 250 uL (Promega) et traités en parallèle avec des pipettes multicanaux. Les conditions de PCR utilisées sont : un cycle de dénaturation thermique (2 min à 94°C), suivi de 30 cycles de PCR (45 sec à 94°C, 45 sec à

50°C, et 4 min 30 à 72°C), puis 10 min d'élongation finale à 72°C. Les produits de PCR1 sont purifiés sur gel avec le kit QIAquick purification (Qiagen), et quantifiés sur gel d'agarose.

La seconde PCR (PCR2) utilise une amorce sens non spécifique du gène qui adjoint la région

N-terminale du site attB1 en amont du site de clivage par la TEV. L'amorce anti-sens est également non spécifique du gène et permet d'insérer le site de reconnaissance attB2 en aval

du Tag-S. La composition des mélanges réactionnels et les conditions de PCR sont identiques

à celles utilisées pour la PCR1. Environ 5 ng de produit de PCR1 purifié servent de matrice.

La purification et la quantification des produits de PCR2 se font de la même manière que pour

Les produits de PCR2, contenant les gènes d'intérêt flanqués des sites AttB, sont clonés dans le vecteur donneur pDONR 221 par réaction de BP clonase. Les réactifs utilisés, ainsi que le protocole original, sont fournis par Invitrogen. Le mélange réactionnel est composé de 1 uL de Clonase Reaction Buffer 5X, 150 ng de vecteur pDONR 221 (1 uL),

1 uL de tampon Tris-EDTA (Tris 10mM à pH 8.0 et EDTA 1mM), 1 uL de produit de PCR2,

et 1 uL de mélange enzymatique BP clonase. L'ensemble est incubé 3 heures à 25°C, puis traité à la protéinase K (0.4 ug/uL) pendant 10 min à 37°C afin de stopper la réaction. 50 uL

de bactéries thermocompétentes DH5á sont transformées par le produit de réaction BP clonase par choc thermique à 42°C pendant 45 secondes. Le produit de transformation est étalé sur boîte LB/agar contenant 50 ug/mL de kanamycine, puis incubé à 37°C pendant toute une nuit. Le lendemain, une dizaine de colonies sont repiquées sur milieu LB/agar/kanamycine, puis une PCR sur colonie est réalisée sur chacun des clones en utilisant une amorce sens (M13) s'hybridant sur le plasmide, et une amorce anti-sens s'hybridant sur le gène d'intérêt. Les colonies, conduisant après PCR à une bande unique dont la taille apparente correspond à la taille moléculaire attendue, sont mises en culture dans du LB à 37°C. Les vecteurs d'entrée sont alors extraits et purifiés avec le kit Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (Promega). Les produits de ces minipréparations sont finalement séquencés sur appareil 310 Genetic Analyser (ABI Prism, Applied Biosystems).

Les 7 plasmides de type pDEST possèdent un gène encodant un partenaire de fusion

en aval de l'étiquette 6xHis, à l'exception du vecteur pDEST-17 (Invitrogen) qui ne contient pas de partenaire. La formation des vecteurs d'expression est réalisée en mélangeant 1.8 uL

de vecteur d'entrée (300 ng), 1.2 uL de chacun des vecteurs pDEST (100 à 300 ng), 1 uL de

Clonase Reaction Buffer 5X, et 1 uL de mélange enzymatique LR clonase. L'incubation dure

5 heures à température ambiante, puis la protéinase K est ajoutée (0.4 ug/uL). La transformation des bactéries DH5á thermocompétentes est alors menée comme

précédemment par choc thermique à 42°C pendant 45 secondes. L'analyse des transformants

se fait d'une part, par PCR sur colonie en utilisant une amorce sens spécifique du promoteur T7, et une amorce anti-sens spécifique du site AttB2. D'autre part, un repiquage sur milieu LB/agarose-kanamycine, -chloramphénicol, et -ampicilline, permet de vérifier le profil de résistance des vecteurs d'expression. Seules les colonies qui présentent une résistance unique

à l'ampicilline sont sélectionnées puis stockées à -80°C avec du glycérol.

Le criblage des conditions d'expression des domaines PRODH sur microplaques 96 puits (Falcon) a été réalisé en suivant les protocoles mis au point par les chercheurs du LMP dans le cadre de la plate-forme 3PM (une microplaque par souche et par température).

1.2.1) Transformation des souches d'E. coli et préparation des précultures

Pour chaque puits, 50 uL de bactéries thermocompétentes sont transformées par 20 ng

de vecteur d'expression par choc thermique à 42°C pendant 45 secondes. Après ajout de

200 uL de milieu SOC, les microplaques sont incubées pendant 1 heure à 37°C. Chaque puits

est alors doté des antibiotiques appropriés (Ampicilline à 100 ug/mL pour la sélection des plasmides d'expression, et chloramphénicol à 35 ug/mL uniquement pour la souche Rosetta pLysS), et les plaques sont incubées sur la nuit à 37°C sous une agitation de 250 rpm. On peut ainsi noter que les cultures de transformation servent également de préculture.

Les cultures d'expression, contenant 240 uL de LB et les antibiotiques appropriés, sont ensemencées avec un volume de préculture de manière à obtenir une DO600 initiale de

0.05 (utilisation du lecteur de microplaques ELX 800 Universal Microplate Reader de la

société Bio-Teck Instruments). La croissance est maintenue sous agitation (1000 rpm) à 37°C jusqu'à une DO600 de 1.2 pour une induction à 20°C, et de 0.4 à 0.6 pour une induction à 37°C (0.4 pour les BL21 Star, 0.5 pour les C41, et 0.6 pour les Rosetta). Les souches C41 et Rosetta sont induites avec 1mM d'IPTG, et la souche BL21 Star avec 0.5 mM d'IPTG. L'induction

est alors prolongée pendant 3 heures à 37°C, ou sur la nuit à 20°C sous une agitation de 1000

rpm. La croissance bactérienne est alors stoppée par centrifugation à 2830xg et à 4°C pendant

1.2.3) Lyse des bactéries et séparation des fractions soluble et insoluble

Les culots bactériens sont lysés par reprise dans 50 uL de tampon de lyse contenant,

100 mM de Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM de NaCl, 0.1 % de Triton X-100, 1 uM de phosphoramidon, et 1 mM de PMSF. 0.04 ug/mL de lysozyme (Sigma) sont ensuite ajoutés,

et les microplaques sont mises à incuber sous agitation modérée à 4°C pendant 1 heure. La lyse de l'ADN est initiée en ajoutant 0.125 U/uL de benzonase (Merck) et 10 mM de MgCl2. Les microplaques sont alors incubées à température ambiante pendant 10 minutes sous légère agitation. Les fractions soluble et insoluble sont séparées par centrifugation à 2830xg pendant

1 heure 30 à 4°C. L'expression des protéines de fusion est analysée sur gel SDS-PAGE.

10 uL de chaque échantillon sont dilués dans du « bleu de charge » réducteur 2X [Tris-Hcl

62.5 mM pH 6.8, bleu de bromophénol 0.02 % (w/v), SDS 2 % (v/v), â-mercaptoéthanol 280 mM, glycérol 20 % (v/v)], avant de subir une dénaturation thermique à 100°C pendant 5 minutes. 10 uL sont finalement déposés sur gel de polyacrylamide (8 à 12 %).

Comme je l'ai exposé dans le chapitre 4 de la première partie de ce manuscrit (cf. § 2.2.2), les domaines PROcatal et PROentier ont été exprimés dans 28 conditions expérimentales différentes (7 partenaires de fusion, 2 souches d'expression, et 2 températures), contre 42 conditions pour les domaines PROter et PROinser (7 partenaires, 3 souches, et 2 températures). Pour chaque condition testée, les fractions contenant les protéines solubles et insolubles ont été déposées sur gel SDS-PAGE. L'analyse de l'expression des protéines de fusion à partir de l'interprétation des profils électrophorétiques des gels SDS- PAGE est reportée, domaine par domaine, dans un tableau récapitulatif (Figures A2 à A5).

Que ce soit en souche BL21 Star ou Rosetta, les protéines de fusion PROcatal sont globalement bien exprimées, et ceci avec l'ensemble des partenaires de fusion (Figure A2). Seule la construction avec Gb1 conduit à une expression faible, voire nulle en souche Rosetta

et à 20°C. Cependant, ces bons résultats en terme d'expression ne sont pas associés à de bons profils de solubilité. En effet, on constate que la majorité des protéines hétérologues PROcatal sont exprimées dans la fraction insoluble. C'est le cas notamment pour les constructions avec

ZZ et la GST, ainsi que pour les fusions Gb1, Trx, et His, qui conduisent toutefois dans

Figure A2 : Analyse de l'expression et de la solubilité des protéines de fusion PROcatal dans

Les points rouges sur les gels SDS-PAGE correspondent aux masses attendues des protéines de fusion. Après dépôt des fractions soluble (S) et insoluble (I), chaque bande de surexpression est analysée, et une valeur semi-quantitative est associée à son intensité, de faible (+) à très forte (++++). Les fractions non lisibles sont annotées du sigle NL, et les fractions se confondant aux protéines intrinsèques à E. coli et constituant un doute, sont associées au sigle +/-. Les notations surlignées en couleur mettent en évidence les meilleures conditions d'expression et de solubilité : couleur orange pour la meilleure condition, et couleur jaune pour la deuxième meilleure condition.

De manière plus intéressante, on retrouve ce profil d'expression pour la construction

PROcatal fusionnée avec le partenaire NusA. L'expression dans la fraction insoluble y est très intense, mais contrairement aux autres protéines de fusion, le taux d'expression de protéines solubles est significatif, et notamment en souche Rosetta cultivée à 20°C.

Le meilleur résultat en terme d'expression de protéines solubles PROcatal est obtenu avec le partenaire MBP en souche Rosetta cultivée à 20°C. La combinaison de ces trois conditions permet en effet d'obtenir une bonne expression avec un taux de protéines solubles tout à fait satisfaisant.

Au final, il apparaît que la nature du partenaire de fusion joue un rôle primordial sur la solubilité des protéines hétérologues PROcatal. L'influence de la souche bactérienne et de la température d'expression semble à première vue moins prononcée, mais elle est flagrante lorsque PROcatal est exprimée en fusion avec NusA et MBP. Ainsi, l'association souche Rosetta-température d'expression de 20°C se démarque nettement des autres conditions dans

la mesure où elle permet d'améliorer sensiblement le profil de solubilité des constructions avec NusA et MBP.

PROentier est constitué à 86 % des acides aminés du domaine PROcatal et de manière intéressante, on constate que le profil d'expression des protéines de fusion PROentier est similaire à celui des protéines hétérologues PROcatal, voire identique dans certaines conditions. Ainsi, le meilleur résultat, en termes d'expression et de solubilité, est obtenu avec

Comme le met en évidence la Figure A3, la nature du partenaire de fusion semble jouer un rôle essentiel sur l'expression et la solubilité des protéines hétérologues PROentier :

les constructions avec His, Gb1, ZZ, Trx, et GST conduisent à une expression quasi exclusive

de protéines insolubles ; et même si pour Trx, on retrouve systématiquement une expression très faible dans la fraction soluble, seules les constructions avec MBP et NusA permettent, dans certains cas, d'observer une expression suffisante de protéines solubles.

Figure A3 : Analyse de l'expression et de la solubilité des protéines de fusion PROentier

Comme précédemment, les résultats du criblage des conditions d'expression des

protéines de fusion PROentier ne mettent en évidence aucun effet direct de la souche bactérienne ou de la température d'expression sur l'expression et la solubilité des protéines de fusion recombinantes. Cependant, on retrouve pour les constructions avec MBP et NusA, un effet souche couplé à un effet température qui met une nouvelle fois en valeur le pouvoir de solubilisation de la combinaison souche Rosetta-température d'expression de 20°C.

L'expression des protéines de fusion PROter n'a été initialement testée qu'en souches BL21 Star et Rosetta. Comme le montrent les gels SDS-PAGE et le tableau d'analyse de la Figure A4, la majorité de ces protéines hétérologues ne s'expriment pas dans ces deux souches ; ou l'expression est si faible qu'elle n'est pas décelable sur gel SDS-PAGE. C'est le

cas notamment des constructions avec Gb1, Trx, MBP, et His. Pour PROter en fusion avec le partenaire ZZ, une expression faible est observable dans la fraction insoluble, mais uniquement en souche BL21 Star. Seule la construction avec GST s'exprime dans les deux souches. Cette expression est exclusivement insoluble, sauf en BL21 Star cultivée à 20°C où une bande de faible intensité apparaît dans la fraction soluble.

En ce qui concerne la construction avec NusA, nous avons rencontré des difficultés lors de l'étape de transformation des BL21 Star par le plasmide d'expression. En effet, malgré plusieurs essais, nous n'avons pas été en mesure de transformer cette souche par notre vecteur d'intérêt. Ce problème ne s'est pas posé avec la souche Rosetta, et contrairement aux autres protéines de fusion, les taux d'expression obtenus à 37°C et 20°C avec NusA sont significatifs dans les fractions soluble et insoluble.

De manière intéressante, nous avons constaté que la transformation des souches par les vecteurs d'expression PROter induit une diminution importante de la croissance bactérienne après induction par l'IPTG. Cette baisse de la vitesse de croissance associée à une expression réduite de la plupart des protéines de fusion est tout à fait caractéristique de protéines hétérogènes toxiques. Par conséquent, il nous est apparu nécessaire de tester l'expression des protéines de fusion PROter en souche C41 qui est adaptée à la production de ce type de protéines.

Gb1	ZZ	GST	Trx	MBP	His	NusA
S I	S I	S I	S I	S I	S I	S I
				·		·

+/-

+++

+/-

++(+)

+(+)

+/-

++(+)

+/-

+(+)

++(+)

+/-

++(+)

+/-

+(+)

Figure A4 : Analyse de l'expression et de la solubilité des protéines de fusion PROter dans 42 conditions expérimentales différentes.

Comme le met en évidence la Figure A4, on constate que la souche C41 apporte une

amélioration significative des taux d'expression des protéines hétérologues PROter. Ainsi, alors qu'en souches BL21 Star et Rosetta l'expression des constructions Trx et MBP n'était pas détectable, des bandes de surexpression sont observables en C41 pour ces deux constructions, et notamment pour le partenaire Trx où l'effet souche est assez spectaculaire.

En revanche, la production de PROter en fusion avec Gb1 et His n'est toujours pas détectable

en souche C41. En ce qui concerne les constructions avec ZZ et GST, les profils d'expression obtenus en souche C41 sont comparables à ceux obtenus avec les deux autres souches.

Au vu de l'ensemble de ces résultats, il apparaît que la nature du partenaire de fusion

et de la souche bactérienne est déterminante pour l'expression et la solubilité des protéines hétérologues PROter. En effet, seule la construction avec NusA permet d'obtenir une expression suffisante de protéines solubles en souches Rosetta ou C41. L'influence de la température semble plus limitée, mais comme observé précédemment, l'association souche Rosetta-température de 20°C combinée à un partenaire de fusion efficace conduit aux meilleurs taux d'expression de protéine soluble.

Les protéines hétérologues PROinser présentent un profil d'expression qui ressemble davantage à celui des protéines de fusion PROcatal et PROentier, plutôt qu'à celui des protéines PROter. Ainsi, le meilleur résultat est obtenu avec le partenaire MBP en souche Rosetta cultivée à 20°C avec un taux d'expression de protéines solubles tout à fait satisfaisant.

Comme le montre la Figure A5, les niveaux d'expression obtenus sont très élevés pour l'ensemble des partenaires de fusion, à l'exception de la construction avec Gb1, qui est peu ou non exprimée. Cependant, cette production est majoritairement insoluble pour la plupart des partenaires de fusion : c'est le cas notamment pour His, GST, Trx, et ZZ. Aussi, dans le cas

de GST et Trx, une faible expression est presque systématiquement observable dans la fraction soluble. A l'instar des 3 autres domaines PRODH, seules les constructions avec MBP

Annexe : Criblage des conditions d'expression des protéines PROentier, PROcatal, PROter, et PROinser

Figure A5 : Analyse de l'expression et de la solubilité des protéines de fusion PROinser dans 42 conditions expérimentales différentes.

Annexe : Criblage des conditions d'expression des protéines PROentier, PROcatal, PROter, et PROinser

L'analyse du criblage des conditions d'expression de PROinser met donc une nouvelle

fois en évidence le rôle essentiel du partenaire de fusion sur la solubilité des protéines hétérologues. Aussi, contrairement aux résultats obtenus avec les autres domaines PRODH, il

est plus difficile de mettre en évidence un effet direct de la souche bactérienne ou de la température sur l'expression et la solubilité des protéines de fusion PROinser. Dans le cas de

la construction avec MBP, on constate toutefois que la souche Rosetta donne de meilleurs résultats que les souches BL21 Star et C41. Par ailleurs, même si un effet solubilisant de l'association souche Rosetta-température de 20°C est observé pour la construction avec MBP,

Production de domaines recombinants PRODH en vue de l'analyse structurale & Caractérisation de la région 51-160 de la protéine KIN17 humaine par RMN et Modélisation Moléculaire

ANNEXE

Criblage des conditions d'expression des

protéines PROentier, PROcatal, PROter, et PROinser