2.2) Démarche entreprise
La première étape de cette stratégie
a pour objectif de surexprimer la proline déshydrogénase
humaine sauvage sous forme soluble et repliée dans un système
recombinant. Dans l'optique d'une étude par RMN, nous avons
choisi d'utiliser la bactérie E. coli qui présente
l'avantage d'être bien caractérisée, d'avoir une
croissance rapide, et de pouvoir produire des quantités importantes
de protéines marquées en isotopes 15N,
13C, ou 2H. Une fois purifiée par chromatographie
d'affinité, la protéine repliée sera soumise à une
digestion enzymatique ménagée en conditions non
dénaturantes par des endoprotéases clivant
spécifiquement les chaînes polypeptidiques après
certains acides aminés. Les fragments protéiques seront
séparés sur colonne HPLC, puis leur séquence sera
déduite de leur analyse
par spectrométrie de masse MALDI-TOF. En optimisant les
conditions de digestion, il sera possible de limiter la protéolyse aux
sites exposés et non enfouis reconnus par les différentes
endoprotéases, et ainsi d'identifier potentiellement les domaines
structuraux globulaires de la protéine PRODH. Les domaines dont le poids
moléculaire sera compatible avec une analyse
par RMN seront ensuite clonés, puis surexprimés
chez E. coli, dans l'optique de résoudre leur
structure par Résonance Magnétique Nucléaire
et Modélisation Moléculaire.
Chapitre 2 : Expression des protéines PRODH
sauvage et mature chez E. coli
| 
