Aspects génétiques et moléculaires de la réponse générale aux stress chez Escherichia coli : le régulon RpoS

I) Identification des gènes régulés par RpoS

L'approche la plus ancienne visant à déterminer quels gènes sont sous le contrôle de RpoS consisterait à cribler une banque de bactéries contenant des fusions lacZ aléatoires en y mutant le gène rpoS. Les fusions lacZ sont une bonne méthode de mesure de l'expression des gènes puisque la â-galactosidase est stable et très facile à doser, et particulièrement pour l'étude des gènes en phase stationnaire, où la stabilité des ARN et protéines étudiés est inconnue. (3. VIJAYAKUMAR, et al, 2004)

Une approche plus récente et plus globale est celle des puces à ADN, comparant le transcriptome de bactéries possédant ou non un gène rpoS fonctionnel soumises à des stress. On observera donc des profils d'expression différents, correspondant aux gènes régulés directement ou indirectement par óS. (2. WEBER, et al, 2005)

Matériels et méthodes

Souches bactériennes et conditions de croissance (pour l'études des fusions lacZ). Les auteurs (3. VIJAYAKUMAR, et al, 2004) ont utilisé des souches dérivées de K12 : HS1002-HS1100 (ÄlacU169) et portant des fusions lacZ aléatoires construites comme indiqué par Schellhorn et al., 1998, cité par 3. VIJAYAKUMAR, et al, 2004), GC122 (ÄlacU169 rpoS::Tn10, Schellhorn et al., 1988, cité par 3. VIJAYAKUMAR, et al, 2004). HS1002-HS1100 (les souches de la banque de fusions lacZ) ont été conjuguées avec une GC122 Hfr (rpoS::Tn10 est transféré quelques minutes après l'origine de transfert). L'allèle sauvage de rpoS est inactivé par recombinaison homologue de rpoS::Tn10 chez les souches portant les fusions : cette recombinaison est sélectionnée par une diminution de la coloration bleutée des cellules sur LB lactose + Xgal, et la dépendance à óS des gènes affectés par la fusion a été vérifiée par complémentation avec le plasmide pMMkatF3, portant l'allèle sauvage de rpoS (Muvey et al. 1988). (figure 1)

Test enzymatique. L'activité â-galactosidase a été testé avec de l'ONPG (o-nitrophényl-â-D-galactopyranoside), et calculée ainsi : (1000 x DO_420nm)/(temps d'incubation en minutes x volume en mL x DO_600nm). (3. VIJAYAKUMAR, et al, 2004) Le test a été effectué sur des cellules en phase stationnaire ou exponentielle.

Identification des gènes en fusion avec lacZ. Les zones proximales à l'insertion de lacZ ont été séquencées comme indiqué par Roy et al., 1995, (cité par 3. VIJAYAKUMAR, et al, 2004) et identifiées grâce au logiciel BLASTN. Les fonctions de ces gènes ont été prédites grâce aux logiciel SWISSPROT. (3. VIJAYAKUMAR, et al, 2004)

Souches bactériennes et conditions de croissance (pour les puces à ADN). Les auteurs (2. WEBER, et al, 2005) ont utilisé un dérivé de la souche MC4100, portant la mutation rpoS::Tn10 ou non (souches MC4100 et RH90). Les souches sont cultivées en LB (milieu de Luria Bertani) à 37°C sous agitation. Pour l'expérience de choc hyperosmotique, on transfère les cellules en milieu minimum M9 avec glycérol (0,4%) pendant au moins 3 générations avant d'ajouter du NaCl à 0,3M. Pour l'expérience de choc acide (chute du pH), on cultive les cellules pendant au moins 4 générations en LB avant d'ajouter 170mM d'acide 4-morpholine-methasulfonique (MES), ce qui acidifie le milieu à pH=5. Les croissances sont mesurées par densité optique à 578nm. (2. WEBER, et al, 2005)

Origine des puces à ADN de E. coli K12. Les puces génomiques ont été fabriquées en spottant avec un robot des produits de PCR obtenus avec des amorces permettant l'extension d'ORF (cadres de lectures). On obtient donc toutes les ORF doubles brins du génome. (détails de la procédure utilisée : Polen et al., 2006, cité par 2. WEBER, et al, 2005)

Préparation de L'ARN et marquage des ADNc. Les bactéries recueillies ont été cultivées selon trois conditions différentes, qui permettent une forte production de RpoS et une forte induction des gènes contrôlés par RpoS : (i) durant la transition entre la phase exponentielle et stationnaire de croissance en LB (DO_578nm=4.0),(ii) 20 minutes après ajout de 0.3M de NaCl (ajouté à DO_578nm=0.3) en milieu M9+glycérol 0.4%, et (iii) 40 min après chute du pH à 5 en LB (ajout de MES à DO_578nm=0.4). Les cellules sont centrifugées 2 min à 4500g à 4°C, et le culot est resuspendu dans 700ìL de tampon RLT (RNeasy, QIAGEN, Allemagne) et lysées par choc grâce à un appareil de lyse à microbilles (Mini-Bead Beater, Biospec products). Après centrifugation, 500ìL d'éthanol est ajouté au lysat, et le lysat est séparé en 2 lots. Les ARN totaux sont extraits sur colonne RNeasy (QIAGEN) selon les instructions du fabriquant. Les ARN isolés sont traités à la DNAse I (pour éliminer l'ADN qui pourrait contaminer la solution) pendant 20min à 37°C, puis incubés à 70°C pendant 10min pour inactiver la DNAse I, et enfin extraits avec de l'alcool phénol-chlorformisoamyl et de l'alcool chloroformisoamyl, puis par précipitation à l'éthanol. (Polen et al., 2006, cité par 2. WEBER, et al, 2005) Des quantités équivalentes d'ARN de chaque lots ont été utilisés pour générer des ADNc marqués au Cy3-dUTP et au Cy5-dUTP comme décrit par Polen et al., 2006. (cité par 2. WEBER, et al, 2005)

Expérimentation avec les puces à ADN et analyse des résultats. L'hybridation sur les puces est réalisées comme indiquée par Polen et al., 2006, (cité par 2. WEBER, et al, 2005) et la fluorescence à 532nm (Cy3-dUTP) et à 635nm (Cy5-dUTP) a été déterminée avec le scanner GenePix 4000 (Axon Inc.) et analysée avec le logiciel GenePixPro 3.0. Chaque expérience a été réalisée en triplicat. Les gènes ont été considéré comme s'exprimant différentiellement si (i) le ration signal/bruit excédait 3, (ii) le signal été présent sur au moins 2 des triplicats, (iii) un test de Student montre que le taux d'ARN relatif aux contrôles (ADN génomique) est significatif, (iv) les taux moyens de variation étaient supérieurs à 3 sur chaque réplicat. Les gènes ont été regroupés en groupes fonctionnelles à l'aide des logiciels GenProtEC (http://genprotect.mbl.edu), MEME (http://meme.sdsc.edu) et BioProspector (http://robotics.standford.edu/~xliu/BioProspector/) (Liu et al., 2001, cité par 2. WEBER, et al, 2005).