2.2.3 Contrôle de qualité
Pour déterminer la qualité de l'huile, des
études ont été faites sur le contrôle de la
qualité microbiologique dans le laboratoire de l'ESTBA (Ecole
Supérieure des Techniques Biologiques et Alimentaires) de
l'Université de Lomé.
2.2.3.1 Echantillonnage et
prélèvement
L'objectif de cette analyse est la détermination de la
qualité microbiologique de l'huile de palmiste prélevée
à la production et au stockage. Les prélèvements à
la production sont faits auprès des productrices de l'huile de palmiste
et ceux au stockage sont réalisés auprès des
commerçantes. Compte tenu des moyens limités de l'étude,
les unités de prélèvement sont faites sur la base d'un
taux de sondage de 20% soit une enquêtée sur cinq.
Ainsi l'on a la répartition numérique suivante pour
les prélèvements : Tableau 3 : Choix de
l'échantillon des transformatrices
|
Préfectures/ville
|
Nombre d'enquêtées
|
Quartier/village
|
Nombre d'enquêtées
sélectionnées
|
Nombre d'unités
prélevées
|
|
Golfe (Lomé)
|
13
|
Adidogomé (13)
|
2
|
6
|
|
Zio (Tsévié)
|
12
|
Boloumodji (12)
|
2
|
6
|
|
Yoto (Tabligbo)
|
10
|
Zafi (10)
|
2
|
6
|
Source : Résultat de l'étude,
2005
Tableau 4 : Choix de l'échantillon des
commerçantes
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Préfecture/Ville
|
Nombre d'enquêtées
|
Quartier/village
|
Nombre d'enquêtées
sélectionnées
|
Nombre d'unités
prélevées
|
|
Golfe (Lomé)
|
5
|
Adidogomé (3) Hanoukopé (2)
|
2
|
6
|
|
Zio (Tsévié)
|
5
|
Boloumodji (5)
|
2
|
6
|
Source : Résultat de l'étude,
2005
N.B. Pour chaque personne
sélectionnée, il y a trois (03) unités de
prélèvement destinées à l'analyse
microbiologique.
2.2.3.2 Analyse microbiologique
2.2.3.2.1 Recherche et / ou dénombrement des
germes 2.2.3.2.1.1. Matériel d'analyse
Il est constitué :
- des trente (30) unités d'huile de palmiste
prélevées dans diverses zones de la région maritime
à raison de trois (03) unités d'huile par échantillon,
- des milieux de culture gélosés tels que les
géloses Plate Count Agar, Sabouraud Chloramphénicol, Mac Conckey
Agar, Tryptone Sulfite Néomycine ; de l'Eau Peptonée
Tamponnée, le Rappaport, la Sélénite de Sodium,
l'Hektoën, et le Salmonella/Shigella,
- le matériel habituel de laboratoire (boîte de
Pétri, anse de platine, Bec Bunsen, microscopes et autres)
2.2.3.2.1.2 Méthodes de recherche et / ou de
dénombrement des germes
Elles ont consisté à déposer 1 ml de la
solution mère et des dilutions décimales (10-1,
10-2) dans des boîtes de Pétri stériles puis
à couler environ 15 ml de milieux gélosés
appropriés maintenus en surfusion à 45°C dans ces
boîtes. Après homogénéisation du mélange, on
laisse le milieu se solidifier sur la paillasse. Les boîtes sont alors
incubées à :
- 30°C pendant 72 heures sur la gélose Plate Count
Agar (PCA) pour la recherche et le dénombrement de la Flore
mésophile totale,
- 30°C pendant 3 à 5 jours sur la gélose
Sabouraud Chloramphénicol (Sb) pour la recherche et le
dénombrement des levures et des moisissures,
- 30°C pendant 24 à 48 heures sur la gélose
Mac Conckey Agar (Mc) pour la recherche et le dénombrement des
coliformes totaux,
- 44°C pendant 48 heures sur la gélose Tryptone
Sulfite Néomycine (TSN) pour la recherche des anaérobies
sulfito-réducteurs,
- 37°C pendant 24 à 48 heures sur la gélose
Baird Parker pour la recherche et le dénombrement des
Staphylococcus aureus,
- 37°C sur l'Eau Peptonée Tamponnée pour le
pré enrichissement des salmonelles, puis leur recherche et leur
dénombrement sur d'autres milieux tels que : le Rappaport, la
Sélénite de Sodium, l'Hektoën, Salmonella/Shigella et leur
identification sur la Galerie API 20 E.
Tableau 5 : Méthodes de recherche
et / ou de dénombrement des germes et leur référence
|
Paramètre
|
Méthodes
|
Référence
|
|
Flore mésophile totale (30°C)
|
Méthodes de routine
|
NF V08-05 1 : février1999
|
|
S. aureus
|
Méthodes de routine
|
NF V08-057-1 : novembre 1994
|
|
Levures et Moisissures
|
Directives générales
|
XP V08-059 : novembre 2002
|
|
Coliformes totaux
|
Directives générales
|
NF V08-050 : février 1999
|
|
Anaérobies sulfito-
réducteurs
|
Méthodes de routine
|
XP V08-061 : octobre 1996
|
|
Salmonelles
|
Méthodes de routine
|
NF V08-052 : mai 1997
|
Sources : Résultat de l'étude,
2005
2.2.3.2.1.3 Préparation des échantillons
pour les analyses 2.2.3.2.1.3.1 Pour tous les germes
recherchés sauf les Salmonelles
La méthode consiste à diluer 10g de l'huile dans
90 ml de Tryptone Sel (TS) avec une agitation pendant 5 minutes. Des aliquotes
de la partie aqueuse sont ensemencés pour la recherche et le
dénombrement des germes.
2.2.3.2.1.3.2 Salmonelles
On dilue 25g de l'huile dans 225 ml de l'Eau Peptonée
Tamponnée avec une agitation pendant 30 minutes. On enlève
ensuite la couche huileuse au dessus du mélange pour éviter le
développement des germes anaérobioses. La phase aqueuse restante
est alors utilisée pour la recherche des Salmonelles.
2.2.3.2.1.3.3 Lectures des résultats
Les boîtes renfermant 30 à 300 colonies sont
retenues pour le dénombrement des germes de chaque type de milieu puis
les résultats sont rapportés par ml de l'échantillon. La
méthode de lecture préconisée par BOURGEOIS et
PLUSQUELLEC, (1980), demande de faire la moyenne des nombres obtenus sur les
plaques de même dilution multipliée par la dilution. Ils affirment
aussi que les plaques contenant moins de 30 colonies pourraient
éventuellement être utilisées dans les cas où il
s'agira simplement de vérifier le nombre de bactéries par rapport
à une certaine norme.
Dans le cas précis de ce travail, les nombres retenus
au niveau de chaque boîte de Pétri sont multipliés par la
dilution. Les résultats sont utilisés pour calculer la moyenne de
chaque unité. Puis la moyenne de l'échantillon est
calculée avec les résultats précédemment obtenus au
niveau de chaque unité de cet échantillon. Les résultats
définitifs de chaque échantillon sont confrontés aux
nombres définis par les critères du Codex Alimentarius.
Quant à ce qui concerne la lecture des résultats
les situations divergent selon le type de germes. Pour les Coliformes, seules
les colonies rouges ou roses de diamètre supérieur à 0,5
mm sur le milieu Mac Conkey sont dénombrées.
Pour S. aureus, on dénombre les
colonies dans le milieu Baird Parker : des colonies noires avec halo clair puis
le test de coagulase devrait être réalisé sur trois (3)
colonies caractéristiques de chaque boîte.
Pour les salmonelles, les colonies lactoses négatifs
sur Hektoën et Sélénite de Sodium sont repiquées sur
la gélose nutritive. Les boîtes de la gélose nutritive sont
incubées à 37°C pendant 24 heures et les colonies obtenues
sont utilisées pour ensemencer la galerie API 20 E.
Pour la Flore mésophile totale (30°C), toutes les
colonies apparues dans la boîte de Pétri sont
dénombrées.
2.2.3.2.2 Test de gram des bactéries
présentes dans l'huile de palmiste
2.2.3.2.2.1 Matériel
Il est composé :
- des souches de bactéries (retrouvées dans les
huiles analysées) isolées et repiquées sur le milieu PCA
et incubée pendant 24 heures,
- le matériel de laboratoire,
- des réactifs comme le violet de gentiane, le lugol de
Gram, la fushine de Ziehl au 1/10ème
2.2.3.2.2.2 Méthodologie
Il a été utilisé la méthodologie
décrite par GUIRAUD et GALZY, (1980), et dont les étapes sont
:
- quelques gouttes de solution aqueuse de violet de gentiane sont
répandues sur le frottis fixé. L'excès de violet est
jeté après 1mn d'action,
- le frottis est alors recouvert de lugol de Gram ; cette
liqueur prend une teinte mordorée ; on la jette au bout de quelques
secondes et on répète l'opération une ou deux fois
jusqu'à ce que la pellicule mordorée n'apparaisse plus,
- la lame est ensuite décolorée à l'alcool
absolu goutte à goutte en l'inclinant au dessus de l'évier
jusqu'à ce que l'alcool ajouté n'ait plus d'action
décolorante,
- après lavage à l'eau du robinet, le frottis est
recoloré à la fuschine de Ziehl au 1/10ème
pendant 1mn puis lavé à l'eau, séché et
examiné à l'immersion.
2.2.3.2.2.3 Lecture des résultats
Au microscope :
- les bactéries Gram+ apparaissent en bleu noir, - les
bactéries Gram- apparaissent en rouge.
2.2.3.2.3 Préparation à l'état frais
des germes
Cette préparation, décrite aussi par GUIRAUD et
GALZY, (1980), consiste à examiner le microorganisme vivant en milieu
liquide entre lame et lamelle.
- Une goutte de suspension microbienne est
déposée au centre de la lame. Cette goutte doit être de
petite taille pour éviter les débordements. La manipulation est
effectuée de manière aseptique, la lame étant
placée près du Bec Bunsen.
- Dans le cas d'une culture sur milieu solide ou d'un produit
semi solide, une goutte d'eau est déposée sur la lame et une
très faible quantité de produit est prélevée
à l'ose et dissociée dans la goutte.
- Une lamelle est ensuite appliquée sur la goutte en
évitant de créer des bulles d'air et des débordements
à la limite entre lame et lamelle et toujours dans des conditions
aseptiques.
- Les grossissements utilisés sont ×10 et
×40. L'examen microscopique de bactéries à l'état
frais peut être délicat : la mise au point est difficile et peut
être obtenue facilement sur une petite bulle d'air ou une
impureté. Cet examen permet d'apprécier la forme et parfois la
mobilité des germes étudiés. Il faut éviter de
confondre la mobilité d'une bactérie avec les mouvements de
convexion susceptibles de l'entraîner.
- L'examen à l'état frais de germes
anaérobioses nécessite le lutage de la lamelle à la
paraffine, c'est-à-dire l'étalement de paraffine sur les quatre
côtés de façon à isoler la préparation de
l'extérieur.
- L'observation terminée, il faut prendre soin de
placer immédiatement la lame dans le bac d'eau de javel pour
éviter les contaminations. Il faut manipuler la préparation avec
précaution
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