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Recherche de nouvelles souches fongiques productrices d' antibiotiques à  partir du sol et des concrétions sédimentaires des grottes de AàŻn Fezza.

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par Wahiba Kholkhal
Université Abou Bekr Belkaid, Tlemcen Algérie - Magistère en biologie 2006
  

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République Algérienne Démocratique Et Populaire

Ministère De L'enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université Abou Bekr Belkaid

Faculté Des Sciences

Département De Biologie

Laboratoire De Recherche : Produits Naturels

Mémoire en vue de l'obtention du Diplôme de Magistère en Biologie

Option : Produits Naturels : Activité Biologique et Synthèse

Recherche de nouvelles souches fongiques productrices d'antibiotiques à partir du sol et des concrétions sédimentaires des grottes de Aïn Fezza.

Thème :

Présentée par :

Melle KHOLKHAL Wahiba

Soutenue le :

Devant le Jury :

Président : Mr TALEB BENDIAB S.M Professeur

Examinateurs :

· Mr. CHABANE SARI D Professeur

· Mr. ABDELOUAHED J Docteur

· Mme. HASSAINE H Maître assistant Chargé de cours

Promoteur : Mr. MOUSSAOUI A Maître de conférence

Année universitaire 2005-2006

Ø A mes chères parent

Ø Soeurs et frères

Ø Ma famille

Ø Les personnes que je connais

A NOTRE DIEU

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ãä äæÚ « Beauveria felina »

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ÇáÚÒáÉ ÇáÊÇÈÚÉ áäæÚ« Beauveria felina » ÙåÑÊ íÖÇ ÚÇáíÉ ÊÌÇå ÇáÈßÊíÑíÇ

.Pseudomonas aeruginosa

ÒÑÚ åÐå ÇáÚÒáÉ í æÓØ ÓÇÆá ÓãÍ áäÇí äÓ ÇáæÞÊ ÈÏÑÇÓÉ ÇáäÇÊÌ ãä ÇáãÖÇÏÇÊ ÇáÍíæíÉ ÇáãÊæÇÌÏÉ í ÈíÆÉ ÇáÊÛÐíÉÇáåíÇÊ ÇáåæÇÆíÉ æ ÇáåíÇÊ ÇáÞÇÚÏíÉ.

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En vue du risque augmenté jour après jour des bactéries résistantes aux antibiotiques, nous nous sommes intéressés dans notre travail à la recherche de nouveaux produits naturels antibactériens d'origine les champignons des grottes de Aïn Fezza.

Afin d'atteindre notre objectif, on a procédé à des prélèvements d'échantillons de sol de trois grottes (Ghar Sokhrane, Ghar Ouled Djaâdi et Ghar Beni Aâd), ainsi que des concrétions sédimentaires. Ces prélèvements effectués entre le mois de novembre et mars (2004-2005), ont été suivis par des isolements sélectifs des champignons.

Les isolats retenus sont ceux qui appartiennent au genre «Penicillium » et qu'ils sont du nombre de 152 souches. La source principale de ces isolats était les échantillons du sol du prélèvement du mois de décembre du Ghar Sokhrane et le point de prélèvement P2 (situé à 185 m de l'entrée du Ghar Beni Aâd).

Parallèlement des souches de «Penicillium », on a révélé la présence d'une souche observée pour la première fois dans notre laboratoire. Cette souche était isolée seulement des échantillons du point de prélèvement P2 de Ghar Beni Aâd (sol et concrétions sédimentaire). D'après l'identification réalisée par le Muséum National d'Histoire Naturelle de France, la souche appartient à l'espèce « Beauveria felina ».

Le test d'antibiose de 80 souches de «Penicillium » a été effectué, seul 38 présentent une activité contre les bactéries-cibles utilisées, le criblage secondaire de 14 entre eux a révélé l'exhibition de 7 souches d'une activité inhibitrice contre aux moins une bactérie-cible. La souche appartenant à l'espèce « Beauveria felina » a présenté aussi une activité intéressante contre la bactérie-cible Pseudomonas aeruginosa.

La culture en milieu liquide de cette souche, nous a permis d'étudier la production des substances antibactériennes dans le surnageant, le mycélium aérien et enfin le mycélium du substrat. Concernant le surnageant, l'activité antibactérienne étudiée durant les trois mois d'incubation n'était pas exprimé, cependant l'activité antibactérienne du mycélium (aérien et substrat) effectuée après l'extraction par des solvants de polarité différentes était très intéressantes dans le cas de l'extraction par l'éthanol par rapport à l'extraction par l'éther de pétrole éthylique.

Bacterial resistance to the actual antibiotic is mostly in dangerous progress, why we have interest to research new natural antibacterial product that Ain Fezza's grottos fungi contains.

To attempt our objective, samples were taken from the soil of three grottos (Ghar Sokhrane, Ghar Ouled Djaâdi and Ghar Beni Aâd), and from there stalactite.

This sampling was been taken place between November and March, continued by selective isolation of these fungi.

The restrains of this operation were one of the «Penicillium » genera, with a number of 152 strains. The principal sources of these restrains were from the Ghar Sokhrane's samples which are taken place in December, and P2 point situated at 185 m from the entrance of Ghar Beni Aâd.

With the «Penicillium » strains, we were isolated one never seen in our laboratory, which was from samples of P2 point.

Muséum National d'Histoire Naturelle de France was identify this strain as « Beauveria felina » species.

Antibacterial activity's test has been effectuated over 80 strains. Only 38 of there have an activity against bacteria. The secondary screening of 14 from them revealed that 7 were an antibacterial activity. Moreover, « Beauveria felina »'s strain showed a good antibacterial activity against Pseudomonas aeruginosa.

Submerged culture for this strain permit to investigate the production of antibacterial substances in linger, aerial mycelium and submerged mycelium.

For three months, the study of linger's antibacterial activity did not be express, but after extraction with a different polarity solvents , it was more interesting for aerial mycelium and submerged mycelium by using ethanol compared with petrol ethylic ether .

Tableau 1 : Description des stations de prélèvements.

Tableau 2 : Isolement des souches de « Penicillium ».

Tableau 3 : Origine de la souche 23 B.

Tableau 4 : Caractéristiques culturaux de la souche 23 B.

Tableau 5 : Criblage primaire des souches de Penicillium.

Tableau 6 : Origine des souches du groupe (3).

Tableau 7 : Criblage secondaire des souches de Penicillium

Tableau 8 : Identification de la souche 27G1.

Tableau 9 : Activité antibactérienne des extraits étheriques et éthanoliques du mycélium (aérien et substrat).

Figure 1 : Protée (Proteus anguinus).

Figure 2 : Isaria guignardi sur Quedius mesomelinus.

Figure 3 : Situation des stations de prélèvements.

Figure 4 : Les stations de prélèvements.

Figure 5 : Aspect microscopique du Beauveria felina.

Figure 6 : Beauveria felina sur différent milieu de culture.

Figure 7 : Activité antibactérienne de la souche 29S2 dans le deuxième criblage.

Figure 8 : Aspect cultural de la souche 27 G1.

Figure 9 : Beauveria felina sur milieu liquide.

Figure 10 : Activité antibactérienne de la souche 23B « Beauveria felina » contre la bactérie-cible Enterobacter cloacea (5).

Figure 11 : Isaria felina.

USA : United States America.

% : pourcentage.

°C: degré celsus.

m : mètre.

n° : numéro.

Gr : grossissement.

Diam : diamètre.

Km : kilomètre.

v/an : visiteurs par année.

g : gramme.

mn : minute.

ml : millilitre.

a: activité de l'eau.

nm : nanomètre.

mm : millimètre.

pH : nombre d'hydrogène.

al : collaborateurs.

INTRODUCTION.........................................................1

CHAPITRE 1 : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

1- les Champignons :...............................................................2

1-1- Généralité:........................................................................................2

1-2- Caractéristiques générales :...............................................................2

1-3 - Classification :..................................................................................3

1-4- Écologie des champignons :................................................................4

1-5-les principaux producteurs d'antibiotique :..........................................5

2- La grotte:.............................................................................6

2-1- l'homme préhistorique :.....................................................................6

2-2- L'homme musulman :........................................................................6

2-3- L'homme Algérien :...........................................................................8

2-4- Les historiens : ..................................................................................8

2-5- Un préhistorien :..............................................................................9

2-6-Un spéléologue : .................................................................................9

2-7- Un biospéléologue : .........................................................................9

2-8- Un microbiologiste :.........................................................................11

2-9- Un botaniste : ..................................................................................11

2-10- Un mycologue : ..............................................................................12

3-De nouvelles souches fongiques productrices d'antibiotiques:.....................................................................14

CHAPITRE2 : MATÉRIELS ET MÉTHODES

1- Le site d'étude :..................................................................15

2- MATERIELS ET METHODES :.............................................16

2-1- Isolement et identification :...............................................................16

2-2- Test d'antibiose :..............................................................................19

2-3- Production des substances antibactériennes :.....................................21

CHAPITRE 3 : RÉSULTATS ET INTERPRÉTATION

1- Description des stations de prélèvement : ............................24

2- Isolement et dénombrement :..............................................26

3- La souche 23 B :..................................................................27

3-1- Origine d'isolement :........................................................................27

3-2- Identification :.................................................................................27

3-3- Identification de l'espèce :................................................................32

4- Test d'antibiose :................................................................33

4-1- Les souches de Penicillium :..............................................................33

4-2- Beauveria felina :..............................................................................38

5- Productions des substances antibactériennes:......................38

5-1- Activité antibactérienne du surnageant :............................................38

5-2- Activité antibactérienne du mycélium (aérien et substrat) :.................40

CHAPITRE 4 : DISCUSSION :.......................................43

CONCLUSION :..........................................................59

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES............................60

Annexe

INTRODUCTION

Les infections bactériennes étaient depuis l'antiquité la cause principale des mortalités (choléra, peste, tuberculose....) ; mais depuis 1928 le monde a changé, enfin on a une arme contre ces bactéries, un antibiotique sécrété par Penicillium notatum nommé la pénicilline.

On croyait, que le problème de ces infections était résolu jusqu'au 1947, dont les premiers cas de la résistance acquise au traitement à la pénicilline d'infections aux staphylocoques furent remarqués. Ces phénomènes de résistance ne firent pas grande impression à l'époque (LOMBARD, 2005).

En 1999, aux USA, le premier cas de résistance totale aux 12 grandes familles d'antibiotiques est remarqué. La situation est particulièrement grave dans les hôpitaux nord-américains, où, selon la Food and Drug Administration, 20% des cas d'infections nosocomiales, sont dus à des bactéries multi-résistantes (LEEB, 2004).

Alors, les scientifiques ne cessent de chercher des armes plus puissantes, utilisant ainsi différentes méthodes ; l'isolement des souches fongiques à partir de différents milieux naturels allant des sommets montagneux aux profondeurs des océans. Cependant, l'un des milieux naturels négligés dans ce combat était les grottes.

Ces grottes constituent pour certain, si on dit pas la plupart, l'abri des créatures et des monstres, le cible des chasseurs d'Or, et mêmes pour les biologistes ce milieu était un laboratoire d'étude de l'évolution des espèces et le facteur d'adaptation.

Or, ils ont négligé ce que peut donner ce milieu à l'humanité et plus spécifiquement à la santé humaine. En partant de l'histoire des «  ÕÍÇÈ Ç áßå », et les phénomènes d'antagonistes qui peuvent être intenses par l'effet des conditions extrêmes de ce milieu, on a une grande chance de trouver les champignons les plus producteurs d'antibiotiques.

Alors, pour isoler ce type de champignon, notre programme de travail a consisté à :

1- Choisir le site de prélèvement, les stations, ainsi les points de prélèvement.

2- Effectuer des prélèvements à partir du sol et des concrétions sédimentaires.

3- Faire des isolements sur différents milieux de culture.

4- Réaliser le test d'antibiose des souches fongiques sélectionnées sur une gamme de bactéries-cible par utilisation de différente méthode.

5- Identifier les souches fongiques les plus puissantes.

6- Essai d'étudier la production des substances antibactériennes par la souche fongique la plus puissante.

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9Impact, le film from Onalukusu Luambo on Vimeo.



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