CHAPI TRE III : Materiels et Methodes
III.1 Materiels et patients :
Des patients présentant des hémopathies malignes
hospitalisés au service d'ophtalmologie Clinique HAMMOU BOUTLELIS au
laboratoire de cytogénétique ont fait l'objet d'une étude
cytogénétique sur prélèvement du sang
périphérique et sur la moelle osseuse.
III.2 Technique de culture cellulaire :
L'analyse chromosomique nécessite la préparation de
lames riches en étalement chromosomiques analysables, ce qui est
réalisé en trois étapes :
- Mise en culture de lymphocytes stimulés par un agent
mitogène ou culture primaire de Fibroblastes.
- Accumulation de cellules en métaphase ou en pro
métaphase, stade du cycle cellulaire auquel les chromosomes sont les
mieux individualisés.
- Récolte des cellules et préparation des
étalements chromosomiques.
III.3 Culture des lymphocytes :
Le sang, facile à prélever, est la source de
cellules la plus utilisée en cytogénétique humaine.
Chez les mammifères, les lymphocytes B et T sont les
seules cellules du sang susceptibles d'être transformées en
cellules actives et proliférantes.
Cette transformation lymphoblastiques induite in vivo par les
antigènes peut être stimulée in vitro par des
composés tels que les lectines.
I l existe plusieurs types de lectines (Sharon et
Lis, 1989), dont les plus couramment Employées pour la
transformation lymphoblastiques sont la phytohémagglutinine (PHA), la
Concanavaline A (Con A) et le pokeweed mitogène (PWM). Leurs effets
mitogènes Diffèrent :
Ainsi la PHA et la Con A activent de préférence
les lymphocytes T alors que le PWM active Les lymphocytes T et surtout B.
III.3.1 Protocole a partir du sang total
Le sang est prélevé à une veine facilement
accessible dans une seringue contenant de
de sodium. Pour chaque échantillon de sang,
différents milieux nutritifs sont utilises pour augmenter la
probabilité d'obtenir des lames de bonne qualite. Le sang preleve
(0,5m1) est ensemencé dans un volume final de 8,5 ml d'un mélange
composé d'un milieu de
1640 auquel sont ajoutés 10 à 20 % de sérum
de veau foetal (SVF) et un mitogene (PHA) à la concentration finale de
10ug/I
Les cultures sont incubées dans des tubes fermés
à 37°C pendant 3 jours
D'une manière générale, de meilleurs
résultats (préparations riches en étalements
chromosomiques analysables) sont obtenus avec la mise en culture de l
Chez certains, les résultats ne sont pas reproductibles
d'un essai à l'autre et l'indice mitotique souvent faible
(figure 24).
Le manque de reproductibilité est probablement dû
au fait que le nombre de lymphocytes au
moment du prélèvement et leur stimulation
potentielle par les mitogène varient beaucoup en
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fonction de l'état sanitaire du patient. L'indice
mitotique dépend du nombre de lymphocytes qui peuvent être
transformés spécifiquement par l'agent mitogène
présent.
111.4 Preparation des italements chrom osomiques :
Pour obtenir des préparations chromosomiques, i l faut
récolter les cellules au stade de la Mitose, les gonfler par un
traitement particulier pour avoir une bonne dispersion des Chromosomes, les
fixer et les étaler sur lames (figure 25).
111.4.1 Accumulation des cellules mitotiques :
Une solution de colchicine 1 X est ajoutée au milieu de
culture à une concentration finale de 0,04 ug/ml, 90 mn avant la
récolte des cellules. Les flacons sont remis à l'étuve
à 37 °C.
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