Memoire Online - Bioconversion enzymatique des composés phénoliques des effluents issus de l'extraction d'huile d'olive: une voie prometteuse de valorisation par la production de l'hydroxytyrosol naturel

BIOCONVERSION ENZYMATIQUE DES COMPOSES
PHENOLIQUDES DES EFFLUENTS ISSUS DE L'EXTRACTION
D'HUILE D'OLIVE : UNE VOIE PROMETTEUSE DE VALORISATION
PAR LA PRODUCTION DE L'HYDROXYTYROSOL NATUREL.

Ce travail a été réalisé au Laboratoire des Bioprocédés Environnementaux,
Centre de Biotechnologie de Sfax.

Ce travail qui a fait l'objet de cette thèse a été réalisé au Laboratoire de bioprocédés du Centre de Biotechnologie de Sfax.

Je tiens, tout d'abord, à exprimer ma haute considération et mes remerciments au Monsieur le directeur de cette thèse le Professeur Sayadi Sami, Directeur du Centre de Biotechnologie Sfax et Directeur du Laboratoire des Bioprocédés Environnementaux pour avoir dirigé ces travaux de thèse et pour la dynamique qu'il a donné à ce travail. Je salue aussi la souplesse et l'ouverture d'esprit de mon directeur de thèse qui a su me laisser une large marge de liberté pour mener à bien ce travail de recherche. Je lui suis particulièrement reconnaissante pour ces conseils avisés et nécessaires. Je tiens également à le remercier pour ses qualités scientifiques et humaines.

Je tiens à exprimer ma reconnaissance à Mme Dr Khoufi Sonia, maître assistant au Centre de Biotechnologie Sfax, laboratoire de Bioprocédés Environnementaux, pour sa gentillesse, pour toutes les discussions scientifiques que nous avons eues ensemble, ses précieux conseils et pour son aide dans la correction des publications. Merci aussi pour sa sérénité et pour m'avoir souvent remonté le moral.

Je remercie le Professeur............................d'avoir accepté de présider le Jury de cette thèse, ainsi que pour sa gentillesse.

Je suis très sensible à l'honneur que m'ont fait les Docteur...............et............en acceptant d'être les rapporteurs de ce travail, et je les remercie pour leurs remarques avisées.

pour la realisation de la fermentation et la bioconversion à grande échelle. Qu'il trouve ici l'expression de mes sinceres remerciements.

Mes remerciment s'adressent aussi à Monsieur Adel Zitoun ingénieur à l'unité de valorisation au Centre de Biotechnologie de Sfax, Kamel Mrad, Mohamed Amri, Nizar Elleuch et Haitham pour leur aide et leur disponibilité.

Parmi tous les membres du laboratoire que j'ai pu rencontrer, beaucoup sont partis, d'autres restent encore. Je tiens à leur exprimer toute ma reconnaissance, pour leur aide, les discussions, et les critiques qui m'ont permis de prendre du recul sur mon travail de thèse. À tous, aux stagiaires, aux permanents, je vous exprime toute ma reconnaissance pour avoir contribué à votre manière à ce travail.

Qu'il me soit permis d'exprimer toute ma sympathie et mes remerciements à tout le personnel du CBS et à tous les enseignants de l'ENIS qui m'ont fait bénéficier de leurs prestigieux enseignements.

Je clos enfin ces remerciements en dédiant cette thèse de doctorat à ma famille que j'ai eu la chance d'avoir à mes côtés, qui m'ont soutenu tout au long de ces années de travail.

IV- Changement de la composition en polyphénols durant la maturation de l'olive

III-1 Bioconversion de l'oleuropéine par la â-glucosidase thermophile immobilisée

III-4 Bioconversion des sous produits de l'industrie oléicole (grignon et margine) 42

I-5-1 Milieu liquide à base de son de blé pour la production de f3-glucosidase à

I-5-3 Milieu liquide à base de son de blé pour la fermentation d'A. niger pour la

I-9 Chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de

I-10 Chromatographie phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG-

Optimisation de la production de â-glucosidase par le champignon : Aspergillus

I- Optimisation des conditions et de la composition du milieu de culture pour la

II- Résultats de la fermentation d'Aspergillus niger sur le milieu de culture

II-1 Enzymes produites durant la fermentation d'Aspergillus niger dans le son

II-2-1 Evaluation de protéines et de sucre réducteur dans le jus de fermentation 85

II-2-2 Evaluation des activités f3-glucosidase et estérase dans le jus de fermentation 85

IV-1 Procédé de la microfiltration tangentielle pour la clarification de jus de

I. Mise en évidence de la bioconversion des margines moyennant une réaction

I-2-4 Effet de la nature de biocatalyseur, le temps de la réaction et le temps

d'incubation de culture d'A. niger sur la biotransformation en hydroxytyrosol 99

II. Les enzymes fongiques : un outil puissant pour enrichir les margines en

III- Optimisation du process de la bioconversion des composés phénoliques des

III-2 Effet de la température sur la réaction de bioconversion et sur l'activité f3-

III-3 Effet du pH sur la réaction de bioconversion et sur l'activité f3- glucosidase.117

III-5 Relation entre la production de l'hydroxytyrosol et la concentration de f3-

IV-Essai d'immobilisation de la â-glucosidase sur l'alginate de calcium 124

IV-2 Effet de la concentration en alginate de calcium sur l'activité â-glucosidase 124

II- Essai de bioconversion des deux types de margine par l'enzyme conservée131

II-3 Bioconversion des margines issue de huilerie classique super press à l'échelle

IV- Essai de la bioconversion des composés phénoliques des margines à grande

Introduction générale

Les polyphénols sont des composés organiques possédant au moins une fraction phénol dans leur structure chimique. De nombreuses structures différentes existent, ils sont subdivisés en différentes catégories qui sont les flavonoïdes, les acides phénoliques, les lignanes, les procyanidines et les tanins. Ils sont largement distribués dans les fruits (pommes, kiwis, tomates, les baies et les raisins), les légumes (par exemple, artichauts et poivrons), épices (par exemple, la curcumine et la muscade), les boissons (par exemple, le thé, jus de fruits, vins et chocolat) et différentes huiles (par exemple, d'olive, d'argan). Ils sont connus pour leurs activités biologiques (par exemple, anti-VIH, anti-athérosclérose, anti-cancer et anti-inflammatoires). Ils sont de puissants antioxydants en fonction de leur capacité à i) inactiver directement les radicaux libres, ii) inhiber la peroxydation lipidique, iii) chélate de métal et iv) inhibent les enzymes impliquées dans le stress oxydatif.

Parmi les sources intéressantes d'antioxydants naturels, figurent les plantes. Les antioxydants extraits des végétaux suscitent un grand intérêt dans les domaines des industries alimentaires, cosmétiques et pharmaceutiques. Depuis le début des années 1980, une recherche intensive de molécules naturelles à activité antioxydante a été menée. Les sources explorées sont en premier lieu les épices, les plantes aromatiques et les condiments mais aussi les huiles essentielles et les fruits.

Aliment ancestral du bassin méditerranéen, l'huile d'olive voit sa production augmenter régulièrement, en raison de la reconnaissance de sa haute valeur diététique. Après le broyage de fruit d'olive et écart des parties solides (grignons ou tourteaux d'olive) par pressage, la phase huileuse et la phase aqueuse sont séparées et le résidu organique liquide, appelé margines, est écarté. Ce sous-produit pose des problèmes importants de pollution. La difficulté de traitement des margines est due à leur forte concentration en charge polluante, à leur grande toxicité pour la microflore et à leur mauvaise biodégradabilité. La charge polluante en sortie d'industrie oléicole est exceptionnelle : elle dépasse généralement 120 g de DCO/l et peut atteindre 200 g DCO/l. La toxicité de cet effluent est essentiellement due à sa haute teneur en composés phénoliques, qui vont des monoaromatiques jusqu'aux polyphénols de hauts poids moléculaires. Chaque année, entre 20 et 35 millions de m³ de margines sont produites autour du Bassin Méditerranéen. La majeure partie de ces rejets liquides est traitée par collecte dans des bassins d'évaporation aménagés à ciel ouvert. Dans ces bassins, le

Introduction générale

processus de dégradation n'est que partiel, ce qui entraîne l'accumulation et la concentration de la majeure partie de la matière organique présente. Divers procédés ont été testés pour le traitement des margines. Les traitements physiques ou chimiques sont fondés sur la séparation des constituants solubles et insolubles des margines et ne permettent de traiter ultérieurement que la partie soluble. Les traitements biologiques ou mixtes font appel à des microorganismes aérobies et anaérobies. Certains micro-organismes aérobies (bactéries ou champignons) dégradent en totalité les composés polyaromatiques complexes et de hauts poids moléculaires, comme les lignines, tannins et polyphénols des margines. Toutefois, l'utilisation de dispositifs aérobies de dépollution des margines se heurte au coût élevé de la construction et de l'exploitation des installations, qui rend ces procédés non rentables financièrement. Une alternative à la dépollution complète est donc de réaliser une dégradation partielle des margines par voie microbienne (bactéries ou champignons), en respectant les structures aromatiques présentes, ceci afin de biotransformer les structures polluantes en composés d'intérêt industriel.

Les margines, par leur forte concentration en composés polyaromatiques (de 2,5 à 20 g/l), constituent une source potentielle de molécules ou de précurseurs de molécules à haute valeur ajoutée et en particulier les ortho-diphénols. Ces composés, de concentration 10 à 100 fois plus grande que celle dans l'huile d'olive (Lesage-Meessen et al., 2001), sont connus pour leurs propriétés antioxydantes et leur rôle bénéfique dans la prévention de certaines maladies telles que les maladies cardiovasculaires. Ces ortho-diphénols sont d'un intérêt industriel majeur pour l'industrie agro-alimentaire qui recherche des molécules naturelles pour remplacer les antioxydants de synthèse. L'ortho-diphénol majoritaire des margines est l'hydroxytyrosol. Ce produit `'noble» est réputé comme étant un antioxydant très puissant. Il présente aussi une large gamme d'activités biologiques en particulier les activités antibactériennes, anti-inflammatoire et anti- hypertensive.

Pour les applications industrielles, la procédure de la production d'hydroxytyrosol à partir des margines a été développée durant ces dernières années (Allouche et al., 2004 a). Une période de stockage des margines est nécessaire pour la récupération de composés à haute valeur ajoutée à partir de ces effluents. Certainement pour qu'une fermentation spontanée aura lieu une longue durée de conservation s'avère alors nécessaire dépassant parfois 100 jours (Feki et al., 2006). Toutefois, la stabilité de l'hydroxytyrosol et l'opposition à son oxydation et à sa dégradation fongique et microbienne demande beaucoup de réflexion et de technicités pratiques telles que par exemple la recherche de la concentration d'éthanol à ajouter à ces effluents durant toute la période d'enrichissement pour la stabilité de

Introduction générale

l'hydroxytyrosol converti. En effet, la recherche de nouvelles techniques plus séduisantes franchissant à ces problèmes sera alors obligatoire.

Le thème de notre étude s'incrit dans le cadre de la recherche d'une méthode douce et non coûteuse d'enrichissement des margines en terme d'hydroxytyrosol. Nous nous sommes intéressés ainsi à la recherche de la méthode optimale pour l'enrichissement des margines en hydroxytyrosol. La meilleure conception de cette méthodologie proposée est que les polyphénols contenus dans les margines peuvent être modifiés au sein des margines moyennant leur bioconversion tout en offrant un extrait riche en composés phénoliques simples. Ces derniers, sont utiles pour les industries pharmaceutiques, alimentaires et cosmétiques d'une part, et qui produisent un rejet pauvre en polyphénols réduisant considérablement sa demande chimique en oxygène (DCO) en d'autres termes.

Une source d'enzymes hydrolytiques sera alors utile pour attaquer les polyphénols des margines. Pour cela, une étude préliminaire de la souche Aspergillus niger a été d'abord entreprise reposant sur l'optimisation des conditions de sa culture et la composition de son milieu de production de â-glucosidase.

L'étude de la bioconversion des composés phénoliques de la margine par différents champignons à savoir Aspergillus niger, Trametes trogii et Trichoderma atroviride a été par la suite entamée.

La bioconversion des composés phénoliques des margines a été aussi optimiser en utilisant le jus de culture d'A. niger dans le but d'améliorer au maximum le rendement de libération de l'hydroxytyrsosol.

L'étude comparative de la bioconversion moyennant différentes enzymes tels que la â-glucosidase pure et l'estérase pure et d'autres enzymes commerciales a été également effectuée.

Une étude ultérieure a reposée sur le test de l'efficacité de l'immobilisation sur la bioconversion des margines.

Une dernière partie de cette thèse a reposé sur la bioconversion des margines à grande échelle et la récupération de l'hydroxytyrosol par les techniques séparatives membranaires.

I- L'olivier

I-1 Origine et Histoire

L'olivier symbole de la paix, de la sagesse et de la fécondité, est un arbre qui est connu depuis l'antiquité. Son apparition et sa culture en Asie mineure remonteraient à plusieurs millénaires. L'origine de l'olivier se perd dans la nuit des temps. Son histoire se confond avec celle des civilisations qui ont vu le jour autour du bassin Méditerranéen (Rayan et Robards, 1998). C'est ainsi que l'on a retrouvé des fossiles de feuille d'olivier dans les gisements du Pliocène de Mongardino (Italie), des restes fossilisés dans les couches paléolithique supérieur en Afrique du Nord, des morceaux d'oléastres et des noyaux dans les excavations de l'Enéolithique en Espagne. Il en ressort que l'existence de l'olivier remonte au Xème millénaire avant Jésus (Bitonti et al., 2000).

La culture de l'olivier en Tunisie date du VIII^ème siècle avant J.-C., avant même la fondation de Carthage par la reine Didon. Les Phéniciens étaient les pionniers de la culture de l'olivier en Afrique du Nord. A l'époque des Carthaginois, une véritable culture de l'olivier avait commencé à se répandre suite aux avantages accordés aux paysans qui créaient des olivettes. Les Romains développèrent davantage la culture de l'olivier en Tunisie et la technique de l'extraction de l'huile comme en témoignent les fouilles à Sbeïtla et El Jem ainsi que les nombreuses mosaïques romaines découvertes à Sousse (Nefzaoui, 1991)

I-2 L'olivier en Tunisie

Le patrimoine oléicole tunisien compte près de 57 millions de pieds d'oliviers couvrants l'ensemble de territoire sur environ 1,620,000 hectares (30% des arbres terrestres) avec une dominance du gouvernorat de Sfax (COI, 2000). De plus, 15 millions d'oliviers couvrants 800,000 ha sont plantés à une densité de 17 arbres/ha. Cette plantation est cultivée sous des conditions climatiques semi-arides et arides et dans des sols très pauvres (Braham, 1997).

I-3 Botanique de l'olivier

L'olivier (Olea) fait partie de la famille des oléacées, tout comme le frêne, le jasmin, le troène, le lilas et le forsythia, qui sont quelques uns des 25 genres composant cette famille.

Le genre Olea est lui même composé d'une trentaine d'espèces qui sont répandues sur les cinq continents, mais l'Olea Europea est l'espèce la plus représentée et se trouve partout dans le bassin de la Méditerranée.

Si l'olivier, dans des conditions de culture normales, est généralement improductif de sa 1^ère à sa 12^ème année, il commence à produire de sa 12^éme à sa 50^ème année et il est dans la plénitude de sa capacité de production de sa 50^ème à sa 150^ème année, un âge après lequel il ne rend normalement plus même si certains oliviers peuvent atteindre 300 à 400 ans. La mise en fruits initiale peut cependant se produire plus tôt, vers la 5^ème année, si les conditions de culture sont particulièrement favorables parce que l'olivier fait l'objet de soins intensifs (irrigation, fumure, taille).

Le tronc de l'olivier est gris noir, strié et souvent noueux et crevassé : il est tout à fait caractéristique de cet arbre qui a souvent un aspect particulièrement torturé lorsque l'olivier est ancien. Son bois est recherché pour sa résistance et pour la finesse de son grain et maints ustensiles en sont faits: saladiers, coupelles diverses, plateaux à fromage, tire-bouchons, manches de couteaux, etc.

Les feuilles de l'arbre sont, elles aussi, particulièrement caractéristiques : vert foncé sur le dessus et vert argenté sur la face inférieure, elles se renouvellent tous les trois ans.

L'arbre peut atteindre 3 à 5 mètres de hauteur et même, lorsqu'il est laissé à l'état sauvage, 12 mètres et plus, avec une circonférence de 10 à 12 mètres. Certains auteurs (Loussert et Brousse, 1978) font même état d'arbres, vus en Afrique du Nord, qui atteignent des hauteurs de 15 à 20 mètres avec un diamètre de 1,5 à 2 mètres car livrés à eux même dans des conditions naturelles où l'homme n'intervient pas pour contrôler leur taille. Sauf à être taillé dans ce but et à être entretenu, l'olivier, livré à lui même, ne donne normalement de fruits qu'une année sur deux; il produit, en moyenne, de 15 à 50 kilos d'olives et, comme il faut de 5 à 6 kilos d'olives pour fabriquer un litre d'huile, chaque arbre permet, normalement, d'obtenir de 3 à 10 litres d'huile d'olives, selon les variétés. Aujourd'hui, même si les soins apportés à sa culture permettent une récolte chaque année, les rendements demeurent irréguliers et les volumes de production très variables d'une année à l'autre, comme le prouvent les statistiques.

J-4 Culture de l'olivier

Il existe au moins 50 variétés d'olivier dont les fruits sont de formes, de tailles et de goûts différents ; mais Olea Europa est la variété la plus répondue et se trouve partout dans le bassin méditerranéen (Rayan et Robards, 1998). L'olivier est une Oléacée à feuillage

persistant qui exige une luminosité poussé durant toute l'année. La période de vie de cet arbre peut atteindre 400 ans, grâce à sa capacité naturelle de régénération par des rejets racinaires. Il commence à produire des olives à partir de sa 12^ème année. Après cet âge, le rendement de l'olivier décroît progressivement jusqu'à s'annuler vers la fin de sa vie. Son fruit est une drupe ovoïde à mésocarpe charnu, à noyau relativement gros et dur et dont le péricarpe passe du vert tendre au violet plus aux moins noirâtre à maturité complète (Bianco et Ucella, 2000). Par l'ampleur de ces racines, une surface vernissée de ces feuilles et une pause estivale dans son cycle végétatif, l'olivier peut s'adapter aux sécheresses estivales. En revanche, l'olivier a des besoins en eau modestes. Une pluviométrie de 500 à 700 mm par an est suffisante et il peut même être cultivé dans de régions arides. Néanmoins, l'olivier craint des ambiances humides et l'excès de l'eau. L'olivier tolère les sols pauvres, légers et bien égouttés ; par contre, il déteste les sols lourds. La résistance de l'olivier au froid est relativement faible. Les jeunes oliviers de moins de 5 ans supporte mal des températures inférieures à -8°C. Les arbres adultes souffrent à partir de -12 °C (Fernandez-Diaz, 1983). Les oliviers tunisiens se sont adaptés à l'irrégularité des précipitations et à leurs mauvaises répartitions. Ils puissent en profondeur le peu d'eau disponible grâce à un système racinaires très puissant, et ils doivent pouvoir exploiter une grande surface de terre. D'où la nécessité de pratiquer une faible densité de plantation. En Tunisie, deux principales variétés d'olives à huile sont cultivées : la variété «Chetoui» au Nord et la variété «Chemlali» au centre et au Sud. D'autres variétés sont aussi cultivées à savoir : Oueslati, Zalmati et Zarazi (Nefzaoui, 1991).

I-5 Intérêt économique en Tunisie

Le secteur oléicole Tunisien occupe une place majeure, tant au plan écologique, agricole qu'au plan socio-économique. Ainsi, l'oléiculture jouit une place stratégique dans l'agriculture. La production d'olives à huile est tributaire des conditions climatiques et reste une culture traditionnelle. L'activité compte près de 1 440 huileries et occupe 250 000 oléiculteurs. La production est répartie entre le Sud (54 %), le Centre (29 %) et le Nord (17 %) alors que les huileries sont essentiellement implantées au Centre (46 %) et au Sud (40 %). La capacité totale de trituration est constituée de système classique (42 %), de super presse (27 %) et de chaîne continue (31 %). Actuellement, dans les conditions climatiques et culturales optimales, la production d'olive à huile peut atteindre, voir dépasser un million de tonne. L'olivaison demeure une source importante de travail, d'où son poids social : les journées de travail comptabilisées par an en Tunisie, s'élèvent à 25 ou 30 millions (Nefzaoui, 1991). Ce secteur procure aussi 37 % des recettes des produits agricoles et agroalimentaires

exportés et ses revenus représentent 4 à 5 % des recettes de toutes les exportations tunisiennes (Msallem et al., 2000).

J-6 Les olives

L'olive est une drupe charnue très riche en huile, sa composition physique est indiquée dans la Fig. 1.

Figure 1: Section transversale et composition physique de l'olive
(Maymone et al., 1961 ; Nefzaoui, 1983)

II- Technologie d'extraction d'huile d'olives

Les olives vertes sont récoltées en septembre ensuite la récolte se poursuit jusqu'à février. Durant leur maturation, les fruits s'enrichissent en huile et changent de couleur en passant du vert au noir. L'huile d'olive est contenue dans de minuscules poches situées dans les cellules des olives. Ces poches sont appelées vacuoles. Pour pouvoir récupérer cette huile, il faut briser la paroi de ces derniers et donc, tout d'abord, celle de cellules des olives. Cette dernière opération est appelé broyage. Dans la plupart des cas, les olives sont broyées entières, c'est à dire avec leur noyau. On obtient une pâte qui a une consistance plus au moins liquide selon les variétés des olives, l'époque de la cueillette et la pluviométrie. Le broyage ne suffit pas de briser la totalité des vacuoles. Pour cela et afin de libérer le maximum d'huile, un malaxage est appliqué à la pâte. Le broyage et le malaxage permettent d'obtenir une pâte qui contient de la matière solide (débris de noyau, épiderme, parois cellulaires,...) et des liquide (huiles et eaux de végétations, c'est-à-dire l'eau contenue dans les cellules végétales de l'olive). L'étape suivante consiste à séparer la partie solide (appelé grignon) de la partie liquide. Cette opération s'appelle : séparation de phases. La dernière étape de l'extraction de l'huile d'olive consiste à séparer l'huile de végétation désignée sous terme «margines», il s'agit de la décantation. Il faut donc séparer l'huile de la margine.

Depuis des années, ce processus général de trituration des olives a connu des développements technologiques qui tendent vers la mécanisation complète du processus, l'augmentation de la capacité de travail et la spécialisation du processus d'extraction dans le souci de réduire les coûts mais aussi d'améliorer la qualité de l'huile (Ben Sassi, 2006). A l'heure actuelle, 3 techniques d'extractions sont mises en oeuvre (Caputo et al., 2003) :

II-1 Système discontinue de presse (dit classique)

C'est un système de pression intitulé système discontinu dit encore système classique. Ce système fait appel à des presses hydrauliques pour la séparation des grignons du mélange huile/margine. Le grignon demeure dans les scourtins. La phase liquide récupérée est introduite dans une centrifugeuse verticale à assiette qui permet de séparer l'huile d'olive des margines. Certaines huileries font appel à un cycle de double pression, aussi appelé « système super presse ». Le procédé marche sans ajout d'eau. Les margines sont constituées principalement des eaux de végétation, auxquelles s'ajoute l'eau de lavage et éventuellement celle du broyage. Ce procédé conduit aux margines les plus concentrées.

II-2 Système continue à trois phases

Il s'agit d'un système de type mouture / centrifugation à trois phases (système à cycle continu). Le broyage est réalisé par des broyeurs mécaniques à disques ou à marteaux. Ces broyeurs fonctionnent en continue et la pâte est alors obtenue instantanément. Cette pâte est ensuite malaxée dans un bac en inox, dans lequel tourne une spirale ou une vis sans fin, également en inox. La pâte malaxée est injectée par une pompe dans une centrifugeuse dont l'axe est horizontal appelée aussi décanteur. Cette dernière étape permet la séparation des trois phases (huiles, grignons et margine). Cette séparation des pâtes huileuses en grignons et mélange huile/eau se fait par centrifugation continue. Elle requiert des pâtes plus fluides et, à cette fin, de 50 à 100 litres d'eau chaude par 100 kg d'olives sont ajoutés tout au long du procédé. Ensuite, l'huile est séparée des margines par une autre centrifugeuse. Le volume d'eaux résiduaires est donc 2 à 3 fois supérieur à celui produit par le système « Super Presse ». Les margines issues de ce système sont évidemment moins concentrées.

II-3 Système continue à deux phases (dit économique)

Ce système est de type percolation-centrifugation (système à cycle continu dit mixte). C'est une variante du système à deux phases. Le système consiste en une modification des centrifugeuses afin de réduire les effluents au nombre de deux : l'huile et le marc qui contient

dés lors la quasi totalité de l'eau de végétation des olives. Il n'y a alors pas de production des margines, tous les polluants restant inclus dans les grignons. Ce système a des nombreux avantages. Il permet de réaliser une économie d'énergie, fournit une huile de meilleure qualité, tout en permettant une réduction considérable de la quantité d'eau engagée dans le moulin à huile. Cependant, le grignon obtenu, plus humide que celui du système à 3 phases, est plus difficile à manier et à sécher en vue d'en extraire l'huile qu'il contient.

Chaque type de ces systèmes d'extraction est caractérisé par sa capacité de trituration, son coût de fonctionnement (en termes de main d'oeuvre de consommation d'énergie et de volume d'eau ajoutée), la pureté et la qualité de l'huile obtenue, la quantité et le caractère polluant des sous produits générés.

Actuellement, les systèmes de centrifugation se développent au détriment des systèmes traditionnels de presse, c'est le cas de l'Italie et de l'Espagne. En revanche, en Tunisie les moulins à pression sont encore largement présents. Pour la campagne 1992-1993, environ 63 % des huileries étaient équipées de systèmes à pression (Berndt et al., 1996). Alors que le procédé d'extraction «écologique», c'est à dire le procédé continu à deux phases, n'est pas encore appliqué. Actuellement 50 % des huileries (396 huileries) sont encore artisanales le reste sont industrialisés dont 46 huileries ont un système d'extraction en chaîne.

Sous l'angle opératoire, la différence substantielle entre les deux types d'installations les plus répandus, réside dans le fait que par la pression, l'extraction d'huile se fait sans addition significative d'eau. Par contre, les systèmes à cycles continus requièrent l'adjonction d'eau lors de la phase qui précède la centrifugation. En ligne générale, on obtient en moyenne, pour chaque tonne d'olive 200 kg d'huile, 400 à 600 kg de grignons et de 600 à 1200 l de margines (Caputo et al., 2003).

L'industrie oléicole engendre donc deux sortes de résidus, un résidu solide: les grignons et un résidu liquide: les margines. Si les grignons ne posent pas de problèmes environnementaux du fait qu'ils peuvent être valorisés en tant qu'aliment pour les bétails ou pour la combustion (utilisation la plus répondue en Tunisie), les margines sont classées parmi les effluents les plus exigeants dans leur épuration vu leurs quantités élevées et leurs charges polluantes importantes.

I- Introduction

L'effluent liquide des huileries, dénommé « Margines », est constitué des eaux de végétation des olives et de celle ajoutées aux différents stades du procédé d'extraction de l'huile. Si les premières dépendent uniquement des caractéristiques des olives triturées, les deuxièmes sont quant à elles inhérentes au système d'extraction. En effet, lors de l'extraction de l'huile d'olive, la consommation en eau diffère selon que le système d'extraction fonctionne en discontinue ou en continue (à trois phases ou à deux phases). A partir de la mise en oeuvre de 100 Kg d'olives, on obtient en moyenne 20 Kg d'huile et, en fonction du système d'extraction adopté, prés de :

40 Kg de grignons (avec une teneur en humidité de l'ordre de 35 %) et 40 Kg de margines, si l'extraction est réalisée par les systèmes traditionnels utilisant la pression (Tamburino et al., 1999)

55 Kg de grignons (avec une teneur en humidité de l'ordre de 50 %) et jusqu'à 100 Kg de margines, si l'extraction est réalisée par les systèmes en continue à trois phases (Amirante et al., 1993)

70 Kg de grignons (avec une teneur en humidité de l'ordre de 60 %) et jusqu'à 10 Kg de margines, si l'extraction est réalisée par les systèmes en continue à deux phases (Di Giovacchino, 1996)

La production mondiale de margines est estimé à 30 millions de mètres cubes. En Tunisie, cette production peut dépasser 400 000 m³ pendant les années de bonne pluviométrie (Nefzaoui, 1991). D'après certains auteur, le potentiel polluant des margines issue de la mise en oeuvre d'un quintal (hectogrammes) d'olive est équivalent à celui de 45 habitants ; 2 litres de margines provoquent une pollution équivalente à celle délivrée par 3 personne en un jour (Ranalli, 1991). Le processus d'extraction à partir d'une tonne d'olives génère en moyenne 45 à 55 Kg de demande biologique en oxygène (DBO5). Sachant qu'en moyenne un habitant rejette annuellement de l'ordre de 20 Kg de DBO5 et que l'industrie oléicole mondiale peut produire annuellement 420 10⁶ Kg de DBO5, les margine produites dans le monde pourraient corespondre aux déchets de 21 millions d'habitants chaque année (Hamdi, 1996).

Les margines posent donc des sérieux problèmes pour l'environnement. Leurs effets nocifs dérivent en grande partie de leur contenue en composés polyphénoliques dont certains sont très difficilement biodégradables. De plus, ces polyphénols sont potentiellement toxiques pour les microorganismes et peuvent à long terme entraîner une stérilisation des sols et polluer la nappe phréatique. Néanmoins, il est à noter qu'une partie des substances organiques des margines présentent de fortes activités biologiques importantes en particulier l'activité antioxydante. Pour limiter la nature polluante des margine, les chercheurs ont essayé de valoriser ces effluents soit en produisant du biogaz lors du traitement biologique ou bien en isolant les monomères phénoliques à activité antioxydante. Cependant, les procédés développés restent limités et leurs coûts économiques sont très élevés. Par conséquent, les bassins d'évaporation, par leur simplicité d'utilisation, restent la solution la plus actuellement employée, malgré leur danger et leur effet néfaste sur l'environnement.

II- Composition des margines

Les margines présentent une couleur brune rougeâtre à noire et un aspect trouble. Leur odeur, qui rappelle à l'état frais celle de l'huile d'olive, se révèle gênante en cas de rancissement (huile résiduelle oxydée en surface des bassins d'évaporation) ou de fermentation anaérobique (fraction sédimentée des margines). Le pH des margines varie entre 4 à 6 avec un fort pouvoir tampon. Divers auteurs ont étudié leurs compositions. Les margines sont composés d'environ 90 % d'eau, de 7 à 15 % de matière organique et de 1 à 2 % de substance minérale (Fiestas Ros de Ursinos, 1981). La composition chimique des margines varie en fonction du stade de maturation des olives, du processus d'extraction, des conditions climatiques et de la variété des olives. Les concentrations maximales de la DBO5 et de DCO des margines peuvent atteindre respectivement 100 et 200 (Sayadi et Ellouze, 1993). Les margines présentent une fraction minérale très variée. Elles sont très riches en potassium, sodium, calcium et phosphore. Dans certains cas, ces effluents pourraient renfermer des traces de métaux lourds tels que le Nickel, le cadmium et le cobalt (Chamkha, 2001). La matière organique des margines se trouvent essentiellement en solution, et en moindre quantité, en suspension ou en émulsion. Sa composition est très complexe et hétérogène. Plusieurs composés de nature et de concentration très différentes sont présents dans les margines. Ce sont les glucides, les lipides, les composés azotés, les produits phénoliques des margines (Sayadi et Ellouz, 1995). Les polyphénols représentent environ 20% de la matière organique des margines. Ils sont surtout représentés par des les tanins hydrolysables et des tanins condensés (composés flavonoïdiques). Les composés flavonoïdiques sont représentés par les

catéchines, divers dihydroxychalcones et anthocyanes. Ces dernières sont responsables de la coloration rouge à noire des margines. La concentration totale des tanins dans les margines peut atteindre 12 g/l. Les margines ne contiennent pas de vrai lignine, mais des pseudo-lignines caractéristique du fruit (Tanchev et al., 1980).

Les composés phénoliques contenus dans les margines représentent environ 17,1 g/l (Sayadi et Ellouz, 1993). Certaines structures sont fortement toxiques et liées à l'inhibition de la biodégradation des margines. Toutefois, il est à noter l'existence d'un pouvoir antioxydant important de certains phénols d'où la nécessité de les caractériser et de les valoriser.

II-1 Produits phénoliques simples

Plusieurs acides phénoliques ont été identifié dans les margines. Il s'agit des acides caféique, p-coumarique, protocatéchuique, vanillique (Labat et al., 2000), p-hydroxyphényl acétique, p-hydroxybenzoïque (Balice et Cera, 1984), férulique (Ranalli, 1991), synergique et gallique (Perrin, 1992).

Les alcools phénoliques les plus connus sont le tyrosol (4-hydroxyphènyléthanol) et l'hydroxytyrosol (3,4-dihydroxyphényléthanol) (Capasso et al., 1992). Ces alcools sont parfois associés à des glucosides comme le mono-glucoside du 3,4-dihydroxyphényléthanol (Bianco et al., 1998 ; Romero et al., 2002). Le catéchol est le p-méthylcatéchol ont été également identifié dans les margines (Capasso et al., 1992)

Certains aldéhydes phénoliques ont été aussi identifiés dans les margines à savoir le 3,4-dihydroxybenzaldéhyde, le p-hydroxybenzaldéhyde, la vanilline et l'aldéhyde syringique (Ranalli, 1991). Les cinnamates ont été également retrouvés dans les margines (Hamdi , 1993 ; Labat et al., 2000). D'autres composés phénoliques sont encore présents comme l'apigénin (flavone), la cyanidine, la lutéoline (flavone 7-O-glucoside), la quercétine et le flavanol. Les glucosides phénoliques de la pulpe d'olive et les anthocyanes sont présents en quantités appréciables dans les margines fraîches ou nouvellement produites (Fig. 2).

Figure 2 : Structures chimiques des composés phénoliques des margines (Obied et al., 2007).

II-2 Oleuropéine

II-2-1 Historique

L'oleuropéine, l'amer principe des olives, était appelé et étudié par Bourquelot et Vintilesco, (1908). Par la suite, Panizzi et al., (1960) ont montré que cette molécule contient le glucose, le â-3,4-dihydroxyphényléthyl alcool, et un acide (Fig. 1). Ces auteurs ont proposé que l'acide était identique à un agent hypotensive indiqué comme acide élénolique (Veer et al., 1957). Ce dernier a été préparé par hydrolyse à l'acide phosphorique d'extrait d'olives.

II-2-2 Structure chimique de l'oleuropéine

L'oleuropéine (Fig. 3) est le principal composé phénolique de l'olivier. Il est le majeur biophénol de l'écorce de l'arbre, de la feuille de l'olivier Olea europaea à raison de 5 à 7 mg/g de feuilles fraîches, l'huile d'olive et aussi le fruit : la drupe d'olives qui contient 20 à 100 mg/g d'extrait sec (Perrin, 1992). Ce composé est une sécoiridoide phénolique glucidique (Fig. 2). Sa fonctionnalité hydroxyaromatique dérive du métabolisme du phénylpropanoide et

shikimate (Caturla et al., 2005). C'est un glucoside de l'acide élénolique estérifié par le 3,4-dihydroxy-phényléthanol (hydroxytyrosol).

Pendant la phase noire de la maturation des olives, les auteurs ont mis en évidence l'apparition d'anthocyanes et la diminution de l'oleuropéine (Amiot et al., 1989). L'oleuropéine disparaît lorsque les olives deviennent complètement noires. Dans les margines, ce composé est présent en faible quantité par suite de sa dégradation au cours du processus d'extraction de l'huile. Cette dégradation est réalisée soit par voie chimique (chaleur), soie par voie biologique suit à l'action de certaines enzymes hydrolytiques (Ciarfardini et al., 1994), ce qui permet la libération d'hydroxytyrosol connu également pour son pouvoir antioxydant.

II-2-3 Activité biologique de l'oleuropéine

Durant ces dernières années, plusieurs composés de l'olivier comme l'oleuropéine, ont montré de différentes activités biologiques à savoir des activités antimicrobiennes ou des activités antioxydantes (Caturla et al., 2005). Des propriétés hypoglycémiantes et anti-hypertensives ont été attribuées à cette molécule. L'hydroxytyrosol et l'oleuropéine ont été montré comme de puissants radicaux (Briante et al., 2001 ; Saija & Uccella, 2001 ; Paiva-Martins et al., 2003). En addition, la présence de quelques biophénols dans l'huile d'olive et dans la drupe d'olive a été montrée en relation avec la prévention contre l'infarctus, les maladies des artères et l'athérosclérose (épaississement de la paroi intérieure des artères) vue que ces derniers sont capables d'inhiber l'agrégation des plaquettes sanguines (Carluccio et al., 2003), de modéliser le métabolisme de l'acide arachidonique (Kohyama et al., 1997) et inhibe la peroxydation des LDL (Visioli et al., 1995 a, 2002 ; Visioli & Galli, 2002).

En outre ces composés ont été montrés dotés d'activité antimicrobiennes pour inhiber la croissance d'une large variété de bactérie (Bisignano et al., 1999), de champignons (Aziz et al., 1998) et de virus (Ma et al., 2001). En particulier, l'oleuropéine a été exhibé doté

d'activité antibactérienne contre une large variété de bactérie Gram positive et Gram négative causant des pathologies humaines (Bisignano et al., 1999). De plus, l'oleuropéine a surtout montré une activité antivirale contre l'enveloppe du virus (Micol et al., 2005). Ils tuent également le virus de l'herpès. On suppose que l'oleuropéine inactive les bactéries en dissolvant la paroi externe du microbe. Elle interfère avec l'infection virale et sa propagation en inactivant le virus ou en l'empêchant de se multiplier. L'oleuropéine est capable de pénétrer directement dans des cellules infectées, de stopper la réplication virale sans affecter la cellule de l'hôte.

II-2-4 Mode d'action de l'oleuropéine

L'activité antimicrobienne de l'oleuropéine a été montrée inférieure par rapport à celle de l'hydroxytyrosol. Ceci peut être en relation avec la faible capacité de pénétration de cette molécule à travers la membrane cytoplasmique de la cellule vue la présence de la structure glucidique (Saija et Uccella, 2001). Le mécanisme moléculaire putatif de la large activité biologique de l'oleuropéine a été parfois pointu. En effet, ce composé, une fois digéré par la ?-glucosidase, enzyme présente déjà dans les feuilles de la plante ou dérivant des bactéries intestinales, il produit alors des structures de glutaraldéhyde qui dénaturent les protéines, les protéines crosslinking et qui possèdent des propriétés lysine-alkylating (Konno et al., 1999).

II-3 Hydroxytyrosol

II-3-1 Propriétés de l'hydroxytyrosol

L'hydroxytyrosol est caractérisé par une haute activité antioxydante, qui est analogue à plusieurs antioxydants synthétiques et usuelles à savoir, le 2,6-di-tert-butyl-p-hydroxytoluene (BHT) et le 3-tert-butyl-6-hydroxyanisole (BHA) (Chimi et al., 1988). Aeschebach et al. (1994) ont démontré que l'activité antioxydante de cette molécule est comparable à celle du thymol, carvacrol, 6-gingérol, and zingérone. Il contribue à la stabilité d'huile d'olive vierge. (Visioli et al, 1995 b). Il inhibe également l'oxydation des LDL « low-density lipoproteins » (Visioli et al., 1995 a) et confère aussi bien la protection cellulaire (Galli et al., 1994) et les propriétés diététiques de l'huile d'olive vierge (Visioli et Galli, 2002). Outre son activité antioxydante, l'hydroxytyrosol présente un intérêt important vis-à-vis de la santé humaine. On a montré que cet ortho-diphénol s'oppose à l'effet cytotoxique des métabolites réactifs de l'oxygène sur la cellule, ce qui permet de prévenir les lésions cellulaires (Manna et al., 1997 a). Dans une autre étude, Deiana et son équipe ont observé que l'hydroxytyrosol inhibe les lésions provoquées à l'ADN par le peroxynitrite (Deiana et al.,1999). L'hydroxytyrosol

exerce aussi une nette action anti-inflammatoire. Petroni et son équipe ont montré que l'hydroxytyrosol inhibe, la formation d'un éicosaénoide pro-inflammatoire désigné sous le terme «leucotriène B4» (Petroni et al., 1995). De la Puerta et son équipe 1999 a constaté que l'hydroxytyrosol, le tyrosol, l'oleuropéine et l'acide caféique inhibent la formation du leucotriène B4 en réduisant l'activité de l'enzyme qui catalyse cette formation, la 5-lipoxygénase (De la Puerta et al., 1999). Il a d'ailleurs été signalé que cette enzyme est inhibée par l'extrait d'olive et que les substances responsables de cet effet sont l'hydroxytyrosol, l'oleuropéine et l'acide cafeique (Kohyama et al., 1997). Une autre étude a montré que l'hydroxytyrosol inhibe in vitro l'agrégation plaquettaire et la formation d'éicosanénoîdes par les plaquettes (Petroni et al., 1995).

II-3-2 Synthèse de l'hydroxytyrosol

La première procédure de synthèse de l'hydroxytyrosol est une méthode basée sur la réduction de l'acide 3,4- dihydroxyphenylacétique en présence du catalyseur LiBH4 (Verhe et al., 1992). L'hydroxytyrosol naturel est récupéré par une purification à partir des margines (Capasso et al., 1999). Espin et al., (2001) ont discuté la production de cette molécule en utilisant la tyrosinase de champignon comme un biocatalyseur et l'acide ascorbique comme un agent réducteur. D'autres méthodes enzymatiques sont aussi décrites, et qui sont basés sur l'hydrolyse de l'oleuropéine par la â-glucosidase et la déstabilisation de la structure aglycone sous des conditions de température et de pH bien définies (Briante et al., 2001). Les stratégies biologiques ont ouvert une voie de bioconversion utilisant l'ensemble des cellules pour la production de l'hydroxytyrosol (Allouche et al., 2004 b ; Bouallagui et Sayadi 2006). Vu l'intérêt majeur de l'hydroxytyrosol, plusieurs études ont été intéressé à l'élaboration de procédés économiques viables pour la production de cet ortho-diphénol à partir des margines (Allouche et al., 2004 a). Beaucoup de procédés de production de l'hydroxytyrosol à partir des margines ont été brevetés. Parmi ces derniers, figurent essentiellement ceux de Crea (2002) et (2003). Dans ces études, les margines sont acidifiées à pH 2 pour empêcher les phénomènes de fermentation et stabiliser ainsi les structures phénoliques. Après cette acidification, elles sont stockées à température ambiante pendant au moins deux mois pour favoriser la conversion de l'oleuropéine en hydroxytyrosol.

II-3-2 Les métabolites de l'hydroxytyrosol

In vivo, une fois absorbé, l'hydroxytyrosol peut subir différentes voies de métabolisme (Fig. 4). En effet, l'alcool déshydrogénase transforme l'hydroxytyrosol en 3,4 dihydroxyphenyl acétaldéhyde puis en 3,4 dihydroxyphenyl acétique acide par l'action de

l'aldéhyde déshydrogénase. Toutefois, l'action de la sulfotransférase et la glucotransférase permet la libération des conjugués sulfatés et des conjugués glucuronides respectivement. Quant à catéchol-O-methytransférase permet de donner le 4-hydroxy-3-methoxyphenylethanol, qui suite à l'action de l'alcool déshydrogénase permet la libération de 4-hydroxy-3-methoxyphenylacétate d'éthyle qui sera transformé en 4-hydroxy-3-methoxyphenylacétique acide par l'aldéhyde déshydrogénase (Tuck & Hayball, 2002).

Figure 4 : Postulation des voies enzymatiques pour les métabolites de l'hydroxytyrosol in

III- Procédés de dépollution des margines

Comme nous l'avons cité précédemment, les margines sont des déchets de l'industrie agroalimentaire à la fois très riches et très inhibiteurs pour la flore bactérienne susceptible d'effectuer leur biodégradation (Tableau 1).

Tableau 1 : Principales actions des composés phénoliques sur le milieu naturel (Fiestas

C'est pourquoi, de nombreux procédés de dépollution ont été envisagés. Le procédé le plus utilisé dans le sud méditerranéen réside dans l'utilisation des bassins d'évaporation (Cabello et Fiestas, 1981). D'autres procédés sont aussi employés tels que les traitements physiques et biologiques.

- Les traitements physiques des margines consistent essentiellement à l'épaississement des matières polluantes organiques et minérales (solubles et insolubles) et à leur séparation de la phase liquide. Parmi ces procédés physiques ont peut citer la filtration, l'ultrafiltration, la décantation, la polarisation, le séchage et l'utilisation des filtres à charbon actif. Néanmoins, ces procédés sont à l'origine d'une importante charge polluante solide. Vue leurs importante viscosité, et leur forte concentration en matière sèche, les margines posent de sérieux problèmes lors les opérations de filtration et d'ultrafiltration (Hamdi, 1993). Il a été convenu que toutes ces techniques sont extrêmement coûteuses en énergies ou en réactifs, rendant difficile leurs utilisations par les petites entreprises productrices.

- Les traitements biologiques des margines font recours à des microorganismes (bactéries et champignons) pour oxyder et dégrader la matière organique polluante en métabolites simple comme le dioxyde de carbone (CO2), le méthane (CH4) et des composés aliphatiques.

La bio-oxydation aérobique consiste à utiliser la matière organique (généralement soluble) comme source de carbone et d'énergie pour des microorganismes en présence d'oxygène dissous. L'importante énergie libérée est utilisée par les microorganismes pour

leur croissance et leur maintenance ce qui se traduit par une production de biomasse importante. Il existe de nombreuses configurations technologiques pour les traitements aérobics. Le procédé des boues activées tend à être exploité de plus en plus largement pour les traitements des effluents des industries agroalimentaires.

A cause de leurs effets antibactériens, les composés phénoliques sont les principaux inconvénients pour les traitements biologiques des margines. Pour résoudre ce problème, plusieurs travaux ont étudié l'utilisation des microorganismes capables de croître en aérobiose sur les margines diluées dans le bût de réduire les charges organiques initiales et la concentration des polyphénols (Borja et al., 1992; Yesilada et al., 1998). D'après Balice et al. (1988), le traitement direct des margines par les boues activées nécessite leur dilution 70 fois par l'eau de robinet pour éviter l'inhibition par les composés phénoliques.

Les deux principaux avantages qui ont concouru au succès des procédés anaérobies sont: la réduction de la consommation d'énergie et la faible production de boue. La forte charge en matière organique et le caractère saisonnier mettent aussi en faveur l'épuration des margines par la digestion anaérobie. Cependant, le traitement anaérobie de ces effluents bruts s'est avéré non envisageable à cause de l'inhibition de la méthanisation observée par plusieurs configurations de réacteurs. La présence des substances inhibitrices essentiellement les polyphénols et les lipides dans les margines diminue toujours la viabilité économique de ce processus (Hamdi, et al., 1993; Gharsallah et al., 1999).

IV. Différentes approches de valorisation des margines

Les tentatives de mises en place d'une technique de dépollution des margines ont aboutit à l'élaboration de procédés complexes et coûteux. Ces complications sont essentiellement dues aux propriétés des composés phénoliques présents dans les margines (Sayadi et al., 2000). Il serait de ce fait, intéressent de concevoir des méthodes visant l'atténuation de l'effet néfaste de certains composés problématiques des margines. Dans la mesure où certains polyphénols des margines sont biologiquement actifs, la mise en oeuvre de techniques de valorisation de ces effluents serait d'une grande importance. Dans cet égard, plusieurs techniques ont été développées :

IV-1 Utilisation des margines comme fertilisant

De nombreux auteurs ont souligné que la richesse des margines en matière organique et en éléments minéraux (3,5 à 11 g de K2O; 0,6 à 2 g de _P2O5 et 0,15 à 0,5 g de MgO par litre) permet leur utilisation comme fertilisant complémentaire (Fiestas Ros, 1986).

Bien que les résultats relatifs à la charge organique, aux composés phénoliques et à la conductivité électrique semblent en faveur de l'épandage des margines sur les sols (Levi-Minzi et al., 1992), d'autres recherches semblent être nécessaires pour confirmer les indications fertilisantes et/ou pour évaluer la persistance des composés récalcitrants de la margine dans le sol (Mekki et al., 2006).

IV-2 Production des protéines unicellulaires

Plusieurs travaux ont utilisé les margines en tant que substrats pour la production de levures (Gharsallah, 1987; 1993) et pour certains microorganismes servant pour l'alimentation des bétails. Ce procédé ne manque pas d'intérêt, car il se traduit par une diminution de la DBO5 (60 à 70 %) et l'obtention de quantités importantes de levure (Nefzaoui, 1991). Néanmoins, l'utilisation de ce type de protéines pour l'alimentation animale est limitée par les composés phénoliques adsorbés sur les cellules de levures.

IV-3 Production des enzymes pectinolytiques

La croissance de Cryptococcus albidus sur les margines dans un réacteur agité pendant 48 h permet d'éliminer en moyenne 75 % de la DBO5 avec une production de pectinases. La production enzymatique est importante après élimination des polyphénols par floculation-sédimentation. Le concentré d'enzymes récupéré après ultrafiltration est directement utilisé dans l'extraction d'huile d'olive, améliorant ainsi significativement le rendement d'huile de 84,3 à 90,7 % (Petruccioli et al., 1988).

IV-4 Application des margines dans la fabrication du compost

Le compost s'obtient principalement par la dégradation aérobie de la matière organique présente dans les déchets solides (animaux et urbains). Une autre alternative possible pour l'obtention du compost peut consister en un mélange des déchets agricoles, forestiers et urbains avec les margines (Abid et Sayadi, 2006). Le but de ce processus serait de favoriser la croissance des microorganismes étant donné leurs teneurs élevées en substances facilement fermentescibles (Berndt et al., 1996). En effet, le compost produit à partir des margines est totalement exempt de microorganismes pathogènes et plus riche en

phosphore et en potassium (Abid et Sayadi, 2006) que le compost obtenu à partir des résidus solides urbains.

IV-5 Utilisation des margines comme source naturelle d'antioxydants

L'expérience dans ce domaine est récente, il s'agit en particulier de la récupération des composants aromatiques et phénoliques et des solutions de glucides. Il est bien connu que les margines renferment un certain nombre d'antioxydants phénoliques naturels et en particulier les ortho-diphénols. Parmi ces produits naturels figurent l'acide caféique et plus particulièrement l'hydroxytyrosol (Allouche et al., 2004 a). Ces molécules antioxydantes interviennent dans la protection des corps gras insaturés contre l'auto-oxydation qui est responsable des phénomènes de rancissement (Fki et al., 2005). Les antioxydants ont donc un rôle conservateur en limitant l'altération des produits alimentaires. L'intérêt de ces antioxydants naturels est double : en plus de bénéficier du « label naturel » très apprécié par les consommateurs, ils constituent une alternative appropriée pour les additifs artificiels impliquant parfois des risques de cancérogenèse (Castera-Rossignol & Bosque ,1994).

I- Introduction

Les plantes et en particulier les fruits et légumes contiennent des phytomicronutriments à côté des macronutriments, minéraux et vitamines. Ces phytomicronutriments ont été considérés en tant que métabolites secondaires des plantes que l'ont pensait qu'ils n'étaient que des déchets du métabolisme des plantes. Actuellement, on s'est rendu compte que ces micronutriments ne sont pas si secondaires mais contribuent à protéger la plante contre les pathogènes, les champignons de la pourriture, le rayonnement ultraviolet, etc. Ces composés sont propres à une espèce ou à un groupe d'espèces et participent à l'identité chimique de la plante. Ils sont désignés par le terme « Polyphénols » (Bravo, 1980).

La famille des « polyphénols » englobe une large gamme de substances organiques renfermant dans leurs structures un ou plusieurs cycles aromatiques contenant un ou plusieurs groupements hydroxyles. Dans le cas général, le terme « polyphénols » désigne des enchaînements de composés phénoliques simples très hétérogènes aussi bien par la composition de leurs molécules que par leurs modes de polymérisation. Néanmoins, les monomères phénoliques simples comportant plusieurs groupements hydroxyles sont désignés aussi sous cette dénomination.

La famille des polyphénols contient plus de 8000 structures phénoliques couramment connus (Hammerstone et al., 2000). Ces composés sont probablement les produits naturels les plus répandus dans la nature et de ce fait, sont des éléments faisant partie de l'alimentation animale. A titre d'exemple, l'homme consomme en moyenne jusqu'à 10 g de polyphénols par jour (Day et al., 2000). Les transformations oxydatives par voie chimique ou enzymatique des composés phénoliques entraînent un brunissement des tissus végétaux, ce qui pose des problèmes technologiques dans les industries alimentaires.

II- Les différents types de polyphénols

La nature et les teneurs en polyphénols dans divers fruits et légumes sont très variables. Ces derniers sont classés selon la structure de leur squelette carboné : ce sont surtout les acides phénoliques, les flavonoïdes, les lignines, les tanins et dans une moindre mesure les stibènes et les lignanes.

II-1 Les acides phénoliques

Ce sont des composés phénoliques simples formés généralement par un seul noyau aromatique possédant un ou plusieurs groupements dont un parmi eux se termine par une fonction acide. Cette famille de composés est la plus abondante dans les aliments. Dans les plantes, la majorité des acides phénoliques sont soit associés avec des fibres ou bien liés à l'hémicellulose moyennant des liaisons esters (Clifford et Scalbert, 2000).

Les acides phénoliques se divisent en plusieurs types de composés, selon le nombre de carbones dans la chaîne renfermant la fonction acides. On distingue principalement les acides à squelette en _C6-C1 (acides galliques, salicylique et protocatéchuique), les acides à squelette en _C6- (acides phénylacétiques) et les acides à squelette en _C6-C3 (acides hydroxycinnamiques comme acide caféique, acide p-coumarique) (Herrmann, 1989).

II-2 Les flavonoïdes

Le nom flavonoïde est dérivé du mot « Flavus » en latin, qui signifie jaune. L'intérêt nutritionnel pour les flavonoïdes date de la découverte de la vitamine C par Szent Gyorgyi en 1938 (Szent-Görgyi, 1938 ; Bruneton, 1993). Les flavonoïdes sont considérés comme des micronutriments importants puisqu'ils peuvent jouer des rôles antioxydants (Alan & Miller, 1996).

On regroupe sous le terme de « flavonoïdes » les polyphénols possédant un squelette chimique en (C6-C3-C6). Cette structure chimique est constituée de deux cycles aromatiques liés par un hétérocycle oxygéné renfermant trois atomes de carbones (Knekt et al., 1996). Les flavonoïdes sont classés en fonction de leur degré d'oxydation en anthocyanidines, flavonols, flavonols (catéchine), flavones, flavanones, et flavanonols.

Ces flavonoïdes sont retrouvés dans les végétaux et plus particulièrement dans les fruits et légumes sous forme glycosylée rendant ainsi la molécule plus hydrolysable. Les sucres couramment rattachés aux flavonoides sont le glucose, le galactose, le rhamnose, la xylose, l'arabinose ainsi que des disaccharides tels que la rutinose (Hopia & Heinonen, 1999).

II-3 Les tannins

Ce terme englobe les polyphénols formés d'enchaînement de groupements phénoliques n'ayant pas forcément la même structure mais ayant des propriétés chimiques voisines. Généralement, on désigne par « tannins » des composés phénoliques ayant un poids moléculaire compris entre 500 et 3000 Da et qui sont capables de se combiner aux protéines ou aux autres polymères végétaux comme la cellulose ou la pectine (Metche et Girardin, 1980). Seuls les polymères de faible poids moléculaire sont solubles dans l'eau. Au-delà d'un

certain poids moléculaire, les tannins sont insolubles dans l'eau et entièrement non absorbables. La structure biochimique des tannins est encore mal connue. Cependant, il est courant de distinguer les tannins hydrolysables des tannins condensés (Zhao et Hagerman, 1995).

II-4 La lignine

La lignine peut être définie comme étant les parties non glucidiques de la membrane cellulaires des végétaux. La composition de la lignine varie en fonction de la plante dont elle est extraite et des conditions d'extraction. La lignine résulte de la polymérisation d'un composé phénolique en _C6-C3 de nature para-hydroxycinnamylique qui serait essentiellement de l'alcool para-coumarylique et de ces dérivés méthoxylés : l'alcool coniférylique et l'alcool sinapylique (Himmel et al., 1991).

La lignine est le principal constituant du bois. Elle présente de l'ordre de 20 à 30 % de carbone de la biomasse végétale. C'est le deuxième composé organique de la biosphère après la cellulose. C'est une source naturelle renouvelable et abondante. La lignine se dépose entre les constituants polysaccharidiques des parois des cellules végétales spécialisées dans les fonctions de soutien et de conduction. La biodégradation de la lignine est possible par les enzymes ligninolytiques tels que la lignine peroxydase (LiP) et la manganése peroxydase (MnP) (Sayadi & Odier, 1995).

III- Les polyphénols de l'olivier

Outres les triterpènes, les lipides, les glucides, et les protides, l'olivier renferme des composés phénoliques dans les feuilles et les fruits. Les produits phénoliques de l'olivier sont conventionnellement désignés sous le terme « polyphénols » même pour ceux comportant un seul noyau aromatique ou/et possédant un seul groupement hydroxyle (Ryan & Robards, 1998). Ces polyphénols sont des métabolites secondaires qui résultent de la transformation des shikimates et des phénylpraponoides an niveau de la plante. Les polyphénols de l'olivier sont très variés et peuvent être répertoriés selon six groupes majeurs à savoir : les dérivés benzoïques, les dérivés cinnamiques, les flavonoïdes, les iridoides, les tannins et les lignines. Les constituants de ces différents groupes referment à leur tour des « O-glucosides » pour les quels un ou plusieurs groupement hydroxyles sont liés à un ou plusieurs sucres. Parmi ces sucres figurent principalement le glucose et en faible proportion le rhamnose et les disaccharides (Bitonti et al., 2000).

Pour les nutritionnistes, l'intérêt des les polyphénols a pris de l'ampleur depuis que certaines de ces substances se voient attribuer un certain nombre d'activités bénéfiques que ce

soit pour les plantes (sources de ces polyphénols) que pour l'homme (consommateur de ces polyphénols).

V- 1 Vis-à-vis des plantes.

L'intégration du métabolisme phénolique dans le processus général du développement d'un organe végétal pose en elle-même la question d'un intérêt éventuel de ces substances pour les plantes. Les travaux plus anciens ont montré que les polyphénols seraient associés à de nombreux processus physiologiques : croissance cellulaire, différenciation organogène, dormance des bourgeons, floraison et tubérisation (Parr & Bolwell, 2000). Les polyphénols et en particulier les anthocyanes et certains flavonoïdes interviennent dans la qualité alimentaire des fruits et participent à la coloration des fruits mûrs. Ces composés déterminent également la saveur des fruits : les tannins sont à l'origine de la sensation d'astringence des fruits non mûrs (Talcott & Howard, 1999). Les flavanones sont responsables de l'amertume des citrus et peuvent donner naissance, par transformation chimique, à des dihydrochalcones à saveur sucrée (Hollman et al., 1996).

D'autres composés phénoliques sont impliqués lorsque la plante est soumise à des blessures mécaniques. C'est ainsi que des phénols simples sont synthétisés et l'activité peroxydasique caractéristique des tissus en voie de lignification est stimulée. Ces réactions aboutissent donc à la formation au niveau de la blessure d'un tissu cicatriciel résistant aux infections. De plus, la capacité d'une espèce végétale à résister à l'attaque des insectes et des microorganismes est souvent corrélée avec la teneur en composés phénoliques. Par ailleurs, certains polyphénols responsables de la coloration et l'odeur des fleurs représentent des signaux visuels ainsi que sensoriels qui attirent les insectes pollinisateurs (Robards et al., 1999).

V-2 Vis-à-vis de l'homme

Notre organisme est en permanence soumis à un stress oxydant associé au métabolisme de l'oxygène dans nos cellules. Ce métabolisme est utile pour la production d'énergie, pour la défense contre des microorganismes pathogènes ainsi que pour la détoxification de molécules toxiques. Mais, ce stress oxydant a aussi des effets délétères sur les tissus et induit une augmentation du risque de cancers, des maladies cardio-vasculaires, d'ostéoporose ou des maladies inflammatoires (Bravo, 1980). La consommation des polyphénols contenus dans les aliments contribue à limiter ce stress oxydant et probablement à réduire les risques de développer ces pathologies (Chung et al., 1998).

Ingérés par l'homme, les polyphénols sont absorbés à travers la barrière intestinale et parviennent au niveau des tissus cibles où ils peuvent exercer des effets protecteurs. L'effet majeur des polyphénols sur les tissus humains réside dans le pouvoir antioxydant de ces micronutriments. C'est ainsi que les bienfaits des polyphénols semblent être étroitement liés à leur exceptionnelle capacité à piéger et à neutraliser les radicaux libres qui sont des espèces extrêmement réactives et fortement néfastes pour l'organisme. En effet, ces radicaux libres provoquent l'oxydation des divers constituants de la cellule (en particulier sa membrane) entraînant ainsi l'accélération de son vieillissement et de sa destruction. Cependant, les polyphénols ne semblent jouer un rôle effectif que s'ils sont sous formes biochimiques bien spécifiques. En effet, l'activité antioxydante de chaque composé est liée à la structure chimique de sa molécule :

? Rattachement d'un ou plusieurs glucides aux groupements hydroxyles dans la molécule.

Pendant les deux dernières décennies, il a été démontré que les effets bénéfiques des polyphénols vis-à-vis de l'organisme vont convenablement au-delà de leurs propriétés antioxydantes, comme le signalent un grand nombre de travaux. Les polyphénols inhiberaient notamment l'agrégation plaquettaire, réduisant ainsi les risques de thrombose et diminueraient la perméabilité des vaisseaux ouvrant ainsi la voie à la prévention des maladies cardio-vasculaires (Petroni et al., 1995). Par ailleurs, les polyphénols joueraient un rôle clé dans la protection cancéreuse en stimulant les enzymes de détoxification et en inhibant la division des cellules malignes (Visioli et al., 1998). De plus, il a été établi que les polyphénols pourraient prévenir les maladies neurodégénératives tels que la maladie de parkinson et d'alzeimer et exercer plusieurs activités biologiques intéressantes en particulier les activités anti-inflammatoires, anti-bactériennes, anti-fongiques, hypotenseurs, diurétiques et anti-hémorragiques (Tanabe et al., 1995). Il a été convenu que les polyphénols sont promus à un avenir thérapeutique envers toutes les pathologies engendrées par les radicaux libres.

Un radical libre est une espèce chimique, atome ou molécule, contenant un électron non apparié sur l'orbitale externe (Jadot, 1994). Ces électrons non appariés rendent ces espèces très instables et donc très réactives et pour se stabiliser, elles vont tenter d'apparier leur électron célibataire. Les radicaux libres peuvent avoir des origines externes ou internes à l'organisme (Bhuiyan et al., 2009) :

- Externes : tabagisme actif ou passif, alcool, certains modes de cuisson (barbecue, micro-ondes), pollution, stress, fatigue, rayons X (radiographie), exposition au soleil, changement hormonal, certains médicaments et l'exercice physique intensif.

- Internes : allergies, inflammations, infections et micro-lésions tissulaires.

Plusieurs espèces radicalaires existent dans la nature, celles dérivant de l'oxygène sont appelées radicaux libres oxygénés (ROS de l'acronyme anglais Reactive Oxygen Species), celles dérivant du carbone et celles dérivant de l'azote (oxyde nitrique ^.NO, peroxynitrite ^.NO3^-, ...). Dans ce qui suit, nous citerons juste les ROS.

II.2. Nature des radicaux libres

II.2.1. Les espèces réactives dérivées de l'oxygène

Les ROS résultent de réductions mono-électroniques successives du dioxygène (O2)

Figure 6 : Les radicaux libres oxygénés «ROS» représentant les différents états de réduction
du dioxygène (Farr & Kogoma, 1991).

La configuration électronique du dioxygène montre qu'il est avide d'électrons, ce qui lui confère un caractère oxydant. Sa faible réactivité s'explique par sa structure électronique. En effet, bien qu'il possède un nombre pair d'électrons, il présente deux électrons non appariés au niveau de ses orbitales moléculaires. Au contraire, le dioxygène réagit en transférant un seul électron à la fois, ce qui conduit, par ordre de réduction, à la formation du radical superoxyde (^·O2^-), du peroxyde d'hydrogène (H2O2) et du radical hydroxyle (^·OH)

II-2-1-1 L'anion superoxyde : ·O2 -

Si l'oxygène, dans son état fondamental, accepte un premier électron, celui-ci va occuper l'une des orbitales antiliantes et former le radical superoxyde ^·O2^-. Il est plus instable et plus réactif que la molécule d'oxygène du fait que l'électron supplémentaire se place dans une orbitale antiliante.

II-2-1-2 Le peroxyde: H2O2

Le peroxyde est considéré comme une espèce réactive dérivée de l'oxygène (ROS), même s'il n'a pas une structure radicalaire car il est capable d'initier ou de propager des dommages oxydatifs. Le peroxyde d'hydrogène (H2O2) provient d'une réaction entre deux anions superoxyde, qui met fin au processus radicalaire.

II-2-1-3 L'hydroxyle : OH

L'hydroxyle (?OH) est très réactif. Son temps de demi-vie en milieu aqueux est de 10^-6secondes. La coupure homolytique de la liaison O-O du peroxyde d'hydrogène donne deux radicaux hydroxyles.

Cette rupture de liaison peut être causée par la chaleur ou par des radiations ionisantes. Cependant, une solution de peroxyde d'hydrogène avec des ions ferreux suffit à fournir des radicaux hydroxyle. Cette réaction fut observée pour la première fois par Fenton en 1894 (Dersoti, 1991).

III- Dommages causés par les radicaux libres

Les radicaux libres sont à l'origine de réactions en chaîne qui conduisent à des destructions cellulaires. Leurs structures cibles essentielles sont l'ADN, les membranes cellulaires, les lipides, les glucides et les protéines.

III-1 Action sur l'ADN

Les radicaux et en particulier ?OH, s'attaquent aux différents nucléotides de l'ADN par modification des bases azotées, par rupture des brins de la chaîne nucléotidique, ou par déstabilisation de la forme géométrique de l'ADN en rompant les liaisons hydrogène entre bases complémentaires. Ils peuvent également être à l'origine de multiples lésions cellulaires en attaquant les membranes cellulaires. Toutes ces actions conduisent au développement de maladies telles que le cancer, le vieillissement cellulaire,... etc.

III-2 Action sur les lipides

Les lipides sont une cible privilégiée des radicaux libres qui provoquent l'oxydation des acides gras poly-insatures (AGPI) des phospholipides membranaires. Le phénomène d'auto-oxydation ou peroxydation lipidique (Fig. 7), consiste en l'attaque par un radical libre, d'origine exogène ou endogène, de dérives lipidiques.

Cette reaction est à l'origine de la formation d'hydroperoxydes (ROOH) lipidiques. Les peroxydes lipidiques (ROO ) peuvent aussi réagir avec d'autres composes cellulaires et être à l'origine de molécules très toxiques. Par exemple, ils peuvent réagir avec l'ADN et être à l'origine de substances mutagènes.

III-3 Action sur les glucides

Les radicaux libres peuvent aussi agir sur le glucose et générer des intermédiaires réactifs. Les dommages oxydatifs peuvent alors se propager via l'attaque de radicaux formés sur d'autres molécules.

III-3 Action sur les protéines

Les radicaux libres peuvent réagir avec les différents acides aminés et donc altérer la structure des protéines. Les fonctions de multiples enzymes, de récepteurs et de protéines de transport cellulaire peuvent ainsi être modifiées. C'est donc toute la machinerie cellulaire qui peut être affectée.

IV- Mécanisme d'action des antioxydants

Un antioxydant est une substance qui, ajoutée à faible dose à un produit naturellement oxydable à l'air, est capable de ralentir le phénomène d'oxydation en augmentant le temps au bout du quel il y a une altération décelable du produit. L'antioxydant peut agir de trois différentes manières :

? En inhibant la formation des radicaux libres, on parle d'antioxydant de rupture de chaîne désigné aussi sous forme « Antioxydant vrai ».

? En fixant directement l'oxygène préférentiellement dans la phase de propagation.

? En chélatant les métaux catalyseurs d'oxydation, on parle alors « d'Antioxydant secondaire ».

D'autres substances dites synergistes sont capables de régénérer un antioxydant vrai de type phénolique sous sa forme active. Les antioxydants les plus répondus (AH) bloquent l'auto-oxydation des lipides en donnant des atomes d'hydrogènes aux radicaux lipidiques (RO°) et (ROO°) selon les réactions suivantes :

Pour que l'antioxydant (AH) soit très actif, il est nécessaire que le radical qui en dérive (A°) soit plus stable que le radical lipidique (RO° ou ROO°) ou soit facilement transformé en un produit stable. C'est ainsi que les antioxydants les plus actifs sont de nature phénoliques. En effet, ils donnent naissance à des radicaux très stables suite à la délocalisation de l'électron célibataire sur le noyau aromatique correspondant.

En ce qui concerne les antioxydants secondaires, ils agissent soit en chélatant les métaux ou bien en captant l'oxygène. C'est ainsi que la chélation des ions métalliques diminue l'effet pro-oxydant de ces ions et augmente l'énergie d'activation des réactions d'initiation bloquant ainsi les réactions radicalaires d'oxydation. L'acide citrique, l'EDTA, les poly-phosphates sont de bons chélateurs et sont largement utilisés dans les milieux alimentaires souvent en synergie avec des antioxydants primaires notamment les ortho-dihydroxyflavonoïdes. L'acide ascorbique, l'acide isoascorbique et le palmitate d'ascorbyle peuvent piéger différentes formes d'oxygène et les éliminer ainsi d'un système fermé. Ces composés sont particulièrement actifs en combinaison avec des antioxydants primaires, tels que les tocophérols (Berset & Cuvelier, 1995).

Il existe également des antioxydants enzymatiques tels que la glucose-oxydase et la catalase qui consomme l'oxygène dissous dans le milieu et décomposent les peroxydes lipidiques en produits stables (Barlow, 1990).

V- Différents types d'antioxydants

V-1 Antioxydants synthétiques

Le butylhydroxyanisole (BHA) (E 320) et le butylhydroxytoluène(BHT) (E 321) sont les antioxydants synthétiques les plus utilisés dans l'industrie agroalimentaire. Ces deux additifs sont insolubles dans l'eau mais ont une bonne solubilité dans les milieux lipidiques. Ils sont stables dans les conditions opératoires de la plupart des procédés industriels. Ils sont volatils et donc facilement entraînables à la vapeur d'eau. Ils peuvent agir en synergie avec les galates et l'acide citrique. Plus d'études ont montré que le BHT et le BHA sont toxiques et/ou cancérigènes à haute dose. Leur utilisation est donc en baise (Gordon, 1990).

Le 2-tertiobutyl-4-hydroxyquinone (TBHQ) est parfaitement soluble dans les matières grasses et il est très efficace dans les huiles végétales. Il est stable à hautes températures et peu volatils. La présence d'agents chélateurs tels que l'acide citrique peut augmenter considérablement les propriétés antioxydantes du TBHQ. Ce composé est autorisé aux Etats-Unis, mais il est interdit en Europe à cause de suspicion de sa génotoxicité (Coppen, 1989).

Les gallates de propyle (E 310), d'octyle (E311) et de dodécyle (E 312) sont préparés industriellement par estérification de l'acide gallique. Ils sont moins solubles dans les matières grasses que le BHT et BHA. Ils sont sensibles à la chaleur, ce qui les rend inaptes à l'utilisation dans des produits qui doivent subir une cuisson à haute température. Ils chélatent les ions fer en présence d'eau générant alors des produits de couleur bleu-noir désagréable pour le consommateur. Ils sont donc toujours utilisés avec des agents complexants tels que l'acide citrique.

Actuellement, l'emploi des molécules antioxydantes de synthèse est remis en cause en raison des risques toxicologiques potentiels et de cancérisation. C'est pour cela que la législation du comité européenne a interdit l'utilisation des antioxydants de synthèse avec une concentration dépassant les 200 ppm (mg/kg). Par conséquent, et vue le désir des consommateurs de retourner à l'utilisation des produits naturels, la recherche des sources naturelles d'antioxydants a suscité l'intérêt des grands laboratoires spécialisés (Frankel, 1993).

V-2 Antioxydants naturels employés

Différents antioxydants naturels sont actuellement commercialisés par plusieurs sociétés tels que : Grindstedt, Eastman, Henkel, Kemin ou Roche. Ces antioxydants sont fournis sous forme d'extrait à partir de la source naturelle correspondante (Six, 1994).

Parmi les antioxydants naturels, paraissent les tocophérols et les tocotriénols qui sont largement utilisés et ont fait l'objet de nombreuses études. Ils sont autorisés en alimentation humaine sous forme d'extraits naturels ou sous forme d'isomère de synthèse. Leur grande solubilité dans les huiles et les graisses leur confère un intérêt particulier. En effet, ils sont capables d'interrompre la réaction en chaîne d'oxydation en agissant comme donneurs d'hydrogène via un radical hydro-peroxyde. Un effet synergique est mis en évidence avec le palmitate d'ascorbyle et un effet pro-oxydant a été constaté au-delà de 500 ppm (Cuvelier et al., 1990).

Issu de l'huile de sésame, le sésamol présente une bonne activité antioxydante. Il est présent naturellement sous forme de dimère ou de diphénol. L'acide ascorbique, un autre antioxydant naturel intéressent, il est considéré comme synergiste car, en se transformant en acide dihydro-ascorbique, il permet d'hydrogéner les antioxygènes phénoliques oxydés par les peroxydes et de complexer les métaux pro-oxydants. Il est autorisé dans toute matière grasse à la concentration de 300 ppm. Cependant, sa solubilité dans les huiles semble difficile. Son pouvoir antioxydant est supérieur à celui de BHA et du BHT dans les huiles et peut également être supérieur à celui de delta-tocophérol et des extraits de romarin (Castera-Rossignol & Bosqua, 1994).

Les autres antioxydants d'origine naturelle sont des produits extraits de plantes et en particulier des épices : romarin, thym, cumin, clou de girofle, sauge et origan. Les molécules actives présentes dans ces sources naturelles d'antioxydants sont soit des flavonoïdes, soit des dérivés d'acide benzoïque, soit des dérivés de l'acide cinnamique. D'autres molécules telles que le carnosol et le rosmanol sont citées dans les extraits de romarin (Farag et al., 1989).

VI- Sources végétales d'antioxydants

On connaît depuis longtemps des plantes efficaces dans la protection des matières grasses contre l'oxydation. Les plantes les plus étudiées et employées dans ce domaine sont les épices

et les herbes aromatiques. L'utilisation directe des plantes étant assez difficile cause de leur goût, odeur et incompatibilité avec les formulations alimentaires, ce sont surtout les extraits qui sont employés. La plupart des espèces qui ont une forte activité antioxydante appartiennent à la famille des Lamiacées (Moure et al., 2001). C'est le cas de romarin, sauge, thym, cumin, sarriette, basilic, origan etc,... on connait aujourd'hui l'activité antioxydante d'un nombre élevé de plantes et de partie de plantes. Brand-Williams, Cuvelier et Brest (1995) les ont passées en revue :

? Parmi les graines, on peut citer la couche à aleurone et les germes de riz, de soja, d'avoine, d'orge, des haricots Azuki, du coton et du sésame.

? Parmi les feuilles, on peut citer celles de luzerne, orge, épinard, café et surtout le thé vert qui est très riche en catéchines et dont les extraits antioxydants sont commercialisés au Japon.

? Parmi les huiles, il y a à titre d'exemple les huiles essentielles de thym, de clou de girofle, de menthe et des huiles de palm, de coco et particulièrement l'huile d'olive où on retrouve des quantités importantes de polyphénols.

Outre ces sources naturelles d'antioxydants, l'olive et son huile ainsi que ses co-produits constituent les sources naturelles les plus intéressantes d'antioxydants phénoliques qui présentent empiriquement une certaine activité vis-à-vis l'oxydation des corps gras (Visioli et al., 2002). Des travaux antérieurs ont démontré le rôle de certains composés phénoliques de l'olive à propos la bonne résistance à l'oxydation radicalaire des huiles d'olive vierge. Il s'agit principalement de l'oleuropéine, du tyrosol, de l'hydroxytyrosol et de l'acide caféique (Bisignano et al., 1999 ; O Dowd et al., 2004). Ces composés sont présents dans les margines à des concentrations variant de 1 à 15 g/l (Visioli et al., 1995 b).

L'hydroxytyrosol (3,4-dihydroxyphényléthanol), est l'un des ortho-diphénols majoritaires des margines. Il est doté de fort pouvoir antioxydants (Capasso et al., 1999 ; Casalino et al., 2002). Plusieurs études antérieures ont pu établir le classement suivant par ordre décroissant du pouvoir antioxydant :

On attribue à l'hydroxytyrosol par ailleurs des propriétés hypotensives, cicatrisantes, anti-inflamatoires et plusiers autres activité biologiques très bénéfiques pour la santé humaine (Manna et al., 1997 b).

L'oleuropéine est le principal composé phénolique de l'olive avec une teneur s'échelonnant de 20 à 100 mg/g d'extrait sec (Briante et al., 2004). Cependant, on le retrouverait seulement à l'état de traces dans l'huile d'olive et dans les margines car son hydrolyse lors de l'extraction de l'huile produit l'hydroxytyrosol (Capasso, 1997). Selon le même auteur, l'oleuropéine dispose d'un pouvoir antioxydant voisin de celui de BHT. A la même concentration molaire dans l'huile d'olive, l'oleuropéine serait plus efficace que le tyrosol mais restait moins efficace que l'hydroxytyrosol et l'acide caféique.

Le tyrosol est un composé majoritaire dans l'huile d'olive et dans les margines mais son pouvoir antioxydant reste inférieur de celui de BHT et à d'autres composés de l'huile d'olive (Miro-casas et al., 2003).

Enfin, l'acide caféique, ayant une structure chimique ortho-diphénolique, présente une activité antioxydante proche de celle de l'hydroxytyrosol.

Grâce aux progrès réalisés dans le domaine des connaissances sur le fonctionnement des organismes vivants, le champ d'action des procédés utilisant des microorganismes ou des enzymes purifiés pour la production de molécules à haute valeur ajoutée a été considérablement élargi. Les molécules produites par des procédés biotechnologiques sont parfois appelés « produits néo-naturels ». Ils sont synthétisés par des enzymes proches ou identiques à ceux normalement mis en jeu dans la matière première végétale. Une synthèse

biologique peut être réalisée soit par des microorganismes ou soit par des systèmes enzymatiques.

II-1 Synthèse microbiologique

Ce mode de production appelé aussi « fermentation », fait appel à l'emploi des bactéries ou des champignons cultivés en présence du réactif choisi comme précurseur de la molécule à synthétiser. Ce type de réactions biologiques est relativement facile à mettre en oeuvre. La culture envisagée peut être améliorée par l'optimisation des souches et des conditions expérimentales (Barhini et al., 1998). Les processus de bio-production mettent en jeu des réactions diverses telles que l'hydroxylation, l'oxydation, la réduction, l'hydrolyse, l'estérification, la décarboxylation, la méthylation, la condensation et l'isomérisation. Les réactions de bio-production ont été appliquées pour la production de plusieurs types de produits en particulier les arômes et les antioxydants aromatiques (Edlin et al., 1995).

L'exemple typique pour la production d'arôme réside dans la synthèse de la vanille. Plusieurs études ont montré que certaines bactéries (Pseudomonas putida, Streptomyces setonii, Amycolatopsis...) et certains champignons (Pycnoporus cinnabarinus, Aspergillus niger, ...) sont capables de convertir l'acide férulique en vanilline (Muheim & Lerch, 1999). La vanilline a été aussi produite suite à la bioconversion de l'isoeugénol moyennant une bactérie de type Bacillus sp (Eyal et al., 2000).

II-2 Synthèse enzymatique

Cette méthode met en jeu des enzymes purifiées et immobilisées sur un support convenable. Le choix de la nature d'enzyme dépend des structures chimiques du composé précurseur et du produit à synthétiser. C'est ainsi que pour produire un ortho-diphénol il convient d'utiliser une monoxygénase, par ailleurs, en partant d'un précurseur dépourvu de groupement hydroxyle, il est nécessaire d'employer une dioxygénase. Ce type de réactions de bioconversion nécessite l'utilisation de cofacteur tels que : NADH, NADPH et ATP (Bouallagui & Sayadi, 2006). Sur le plan pratique, les réactions de bioconversion utilisant des cellules (en croissance stationnaire) semblent être plus intéressantes que celles mettant en jeu des enzymes purifiées. Par ailleurs, la régénération des cofacteurs constitue généralement un handicape à l'utilisation de nombreuses enzymes.

III- Bioconversion des margines en produits utiles

Le procès de la bioconversion biologique des margines mène à de panoplies de produits à hautes valeurs ajoutées à travers des fermentations submergées liquides et/ou des fermentations à l'état solide (Solid State fermentation « SSF »). Ces idées ont intéressé plusieurs laboratoires de recherche. Comme le montre le tableau 2, différentes recherches ont été effectués durant ces dernières années.

Tableau 2 : Produits à haute valeur ajoutée obtenus par la bioconversion des margines

Résidus	Description process/ Biocatalyse	Produits	Réferences
Margine	Clostridium spp	Butanol (2.8-8 g/L)	Wahner et al., 1988
Margine	Arthobacter spp	Acide Indolacétique.	Tomati et al., 1990
Margine	Pseudomonas aeruginosa	Biosurfactant : rhamnolipid	Mercade et Manresa(1994)
Margine	Propionibacterium shermanii dans le margine prédigéré par Aspergillus niger	Vitamin B12	Munoz, 1998
Margine	Eschericha coli P-260 Recombinante par l'expression de l' enzyme 4-HPA hydrolase de Klebsiella pneumoniae	Pigments Synthétiques, colorants, alkaloides et polymers avec la structure de base est un quinone	Martin et al., 1998
Margine	Funalia trogii ATC00800 Trametes versicolor ATC00801	Hormones végétales de croissance : Acide Gibberellique, Acide abscisique et indolacetique et cytokinine	Yurekli et al., 1999
Margine	Paenibacillus jamilae CP-7, dans des conditions aérobiques dans un milieu à base de margine	Exo-polysaccharide : agent antitumoral avec des propriétés inmunomodulateur	Ruiz-Bravo et al., 2001
Margine	Azotobacter chroococcum	Bioplastic: Homopolymers of 3- hydroxybutyrate and 3-hydroxyvalerate	Pozo et al., 2002

IV-Bioconversion des composés phénoliques

III-1 Bioconversion de l'oleuropéine par la Ji-glucosidase thermophile immobilisée recombinante de Sulfolobus solfataricus

L'hydrolyse enzymatique de l'oleuropéine par la 13-glucosidase a été déjà décrite (Limiroli et al., 1995). Elle engendre l'obtention de l'oleuropéine aglycone. L'immobilisation d'une â-glucosidase recombinante et thermophile de Sulfolobus solfataricus sur un support en chitosane afin d'hydrolyser enzymatiquement l'oleuropéine à 60 et 70°C a été envisagée par Briante et al. (2000). En supposant que l'hydrolyse enzymatique n'attaque qu'uniquement la liaison glucosidique, la biotransformation ne génèrent alors que des espèces aglycones instables qui en se clivant par une température supérieure à 60 °C donneront une quantité considérable en hydroxytyrosol. L'utilisation d'une enzyme immobilisée thermophile dans un bioréacteur peut résoudre les problèmes techniques relatifs à l'hydrolyse de différents substrats. En effet, les hautes températures utilisées limitent la croissance microbienne et aident à la solubilisation du substrat. Dans le cas de l'hydrolyse de l'oleuropéine, l'élévation de la température permet en une seule étape et pendant un bref délai suite à une hydrolyse enzymatique de l'oleuropéine et une hydrolyse chimique de l'aglycone oleuropéine, l'obtention d'hydroxytyrosol (Briante et al., 2000).

III-2 Bioconversion de l'oleuropéine des olives

L'oleuropéine des olives en saumure est hydrolysée par la â-glucosidase (EC 3.2.1.2.1), enzyme produite par la souche oleuropéinolytique telle que Lactobacillus plantarum. Cette souche peut être isolée à partir d'une saumure naturelle d'olives mûres non soumises à un traitement alcalin. Lactobacillus plantarum est une bactérie sous forme de bâtonnets, croît sur un pH limite de 3,5 et tolère jusqu'à 1% d'oleuropéine et 8% de NaCl dans le milieu de culture (Ciafardini et al., 1994). La â-glucosidase produite par cette souche hydrolyse le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-â-D-glucopyranoside et l'oleuropéine.

De plus, durant la maturation des olives, la dégradation de l'oleuropéine sous l'action du 13-glucosidase et l'estérase a été mis en évidence par Briante et al., 2002. Probablement, pendant la maturation des olives, ces activités enzymatiques rétablies sont en corrélation étroite avec la maturation des olives. Ils peuvent être utilisés pour la caractérisation biochimique de différentes variétés d'Olea europaea L. En outre, la corrélation entre l'activité estérase et la quantité d'acétyl-CoA suggère que cette activité est importante dans le procès d'accumulation d'huile dans les olives matures (Briante et al., 2002).

III-3 Bioconversion de l'oleuropéine d'huile d'olive

En 2002, Ciafardini et Zullo ont démontré pour la première fois que la 3-glucosidase des levures Saccharomyces cerevisiae et du Candida wickerhamii peut hydrolyser l'oleuropéine présente dans huile d'olive. Les analyses enzymatiques effectuées directement sur l'huile d'olive non traitée et sur l'huile d'olive stérilisée inoculée avec les levures mentionnées ci-dessus ont prouvé une activité 3-glucosidase qui est encore active sur le substrat synthétique : le p-nitrophenyl 3- D-glucopyranoside (PNPG) et de l'oleuropéine. L'absence des lipases chez Saccharomyces cerevisiae et Candida wickerhamii isolées mènent à soupçonner que les levures contribuent d'une manière positive à l'amélioration de la qualité organoleptique d'huile sans changer sa composition en triglycérides (Ciafardini & Zullo, 2002).

III-4 Bioconversion des sous produits de l'industrie oléicole (grignon et margine)

Un traitement enzymatique des sous-produits d'huile d'olive employant le surnageant de culture d'Aspergillus niger enrichis en cinnamoyl estérases (EC 3.1.1.73) a été examiné en vue de libérer des composés phénoliques simples et libres, et particulièrement l'hydroxytyrosol. Il a été envisagé sur un extrait phénolique du sous-produit d'huile d'olive, obtenu par une extraction à l'éthanol. De grandes quantités d'hydroxytyrosol libre ont été libérées et à moins d'ampleur : le tyrosol, l'acide caféique, l'acide p-coumarique et l'acide férulique (Bouzid et al., 2005).

III-5 Bioconversion des composés phénoliques de blé

Bhanja et collaborateur (2009) ont utilisé des champignons filamenteux GRAS : Aspergillus oryzae et Aspergillus awamori nakazawa afin d'enrichir le blé en terme de composés phénoliques ayant des propriétés antioxydantes intéressantes. Ils ont pu démontrer la corrélation entre les phénols totaux libérés à partir des grains de blé et les activités de trois différentes carbohydrate hydrolase à savoir : á-amylase, 3-glucosidase et xylanase produites par Aspergillus oryzae. En revanche pour le cas d'Aspergillus awamori nakazawa, uniquement deux enzymes sont mises en jeu à savoir, xylanase et 3-glucosidase et qui sont responsables de la libération des composés phénoliques. Enfin, cette étude a démontré que la fermentation des graines de blé est la meilleure source de la phytochimie, de plus différentes enzymes hydrolysantes les carbohydrates sont responsables du développement des propriétés de la phytochimie du blé fermenté.

III-6 Bioconversion des composés phénoliques du vin

Le secteur oenologique a concentré son attention en pectinase et glycosidase (Lambrechts et Pretorius, 2000). Les glycosidases sont prometteuses en libération d'arôme du vin via un mécanisme d'hydrolyse des précurseurs glycosidiques polymérisant des molécules jouant le rôle d'arôme, exceptionnellement des terpènes glycosides, qui sont responsables de différents caractères du raisin (Winterhalter & Skouroumounis, 1997). Les composés glycosidiques responsables de l'odeur du vin peuvent être hydrolysés par des traitements chimiques ou enzymatiques, il s'agit d'un mécanisme faisant intervenir différents glycosides (Stahl et al.,1993 ; Williams et al., 1992). Differentes enzymes sont mises en évidence, telles que la rhamnosidase (Rha, EC 3.2.1.40), l'arabinosidase (Ara, EC 3.2.1.55), et la â-glucosidase (âG, EC 3.2.1.21) qui est capable de libérer l'aglycone, qui est en relation directe avec l'augmentation de l'arôme dans le vin (Gueguen et al., 1996).

Le règne des champignons comprend 5 embranchements « phyla » Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota, et « Deuteromycotina ou Deuteromycetes » (Guarro et al., 1999).

*L'embranchement des Chytridiomycota, les chytrids, représente un groupe de moisissures aquatiques primitives. Les champignons de ce phylum sont caractérisés par leurs gamètes mobiles au moyen de flagelles (Berbee & Taylor, 1993).

*Les Deuteromycètes ou l'embranchement des Deuteromycotina sont aussi appelés les « moisissures imparfaites ». Ce groupe contient les espèces pour qui aucune étape sexuelle n'a été découverte. A un moment donné, beaucoup de moisissures parasites ont été classées dans ce groupe. Cependant, beaucoup de ces espèces ont été récemment reclassées dans d'autres phyla quand l'étape sexuelle a été découverte. Un exemple de Deuteromycètes est celui de Candida albicans, une moisissure dimorphique responsable des « infections de la levure » chez l'homme (Hawksworth et al., 1995).

*Les zygomycètes, l'embranchement des Zygomycota, sont caractérisés par la formation de spores sexuelles appelées le zygospore. Ces derniers ne sont pas contenus dans un sac ou un corps fructifiant spécialisé. Les Zygospores se forment quand les noyaux haploïdes des cellules apicales de deux hyphes fondent dans un processus de fécondation pour former

ensemble un zygote diploïde. Le zygote subit immédiatement la méiose pour former des cellules haploïdes qui se développent en zygospores. Ces derniers sont non enveloppés ou « nus » et sont regroupés entre les hyphes parentaux. Un exemple de zygomycète très connu est celui de la moisissure noire du pain, Rhizopus nigricans (Weitzman et al., 1995).

*Les ascomycètes sont membres du l'embranchement des Ascomycota. Ils sont aussi appelés « moisissures à sac » parce que leurs spores sexuelles (ascospores) sont regroupées dans des sacs appelés asci. La formation d'ascospores est semblable à celle de zygospore, mais les ascospores sont formées par méiose et sont regroupées dans l'asque. Neurospora crassa est un ascomycète de grande importance dans les études génétiques (Eriksson & Hawksworth, 1993).

*Les basidiomycètes, sont classés dans l'embranchement des Basidiomycota. Leurs spores sexuelles ou basidiospores sont formées sur des structures complexes du corps fructifiant appelé le basidia (Hawksworth et al., 1995). Quelques basidiomycètes contiennent des moisissures les plus complexes, y compris les champignons comestibles des forêts exemple : la vesse-de-loup et champignon de Paris. C'est essentiellement cet embranchement des champignons qui intervient dans le cycle du carbone et la dégradation de la matière ligninocellulosique dans la lithosphère. Les décomposeurs de bois ou basidiomycètes peuvent être groupés dans trois catégories, moisissures de la pourriture blanche (WRF) et moisissures de la pourriture brune (BRF), un troisième groupe les moisissures décomposant la litière (MDL). Les basidiomycètes représentent les habitants typiques du sol dans les forêts et les prairies. Ces microorganismes sont les décomposeurs fondamentaux des matières résiduelles de la plante dans la couche supérieure du sol. Les moisissures décomposant la litière sont capables d'attaquer tous les composants du complexe lignocellulosique y compris les polymères récalcitrants de la lignine (Steffen, 2003).

III- Aspergillus niger

Un des ascomycètes les plus important et à multi-usage dans les applications biotechnologiques est Aspergillus niger. Son utilisation intéresse la production d'enzymes extracellulaires, telles que : la glucoamylase (Selvakumar et al., 1998), pectinase (Castilhoa et al., 2000), lipase acidique (Mahadik et al., 2002), estérase féruloyle (Asther et al., 2002) et xylanase (Duarte & Costa-Ferreira, 1994). Cette souche est également connue par sa production de quelques acides organiques comme acide gluconique (Pandey et al., 2000) et acide citrique (Kumar et al., 2003). L'acide citrique et plusieurs enzymes produites par

Aspergillus niger sont considérés comme GRAS (Generally Regarded As Safe) par les Etats Unis Alimentaires et l'Administration des Médicaments « United States Food and Drug Administration » (Schuster et al., 2002). De plus, divers biotransformations de l'acide férulique (Bonnin et al., 2001), de progestérone (Kulkarni et al., 1998), de diperpénoide, d'isostéviole (De Oliveira et al., 1999), de terpènes (Chen & Reese, 2002), de linalool (Demyttenaere & Willemen, 1998) ont été exécutées par le biais d'Aspergillus niger. Durant ces deux dernières décennies, Aspergillus niger a été développée comme l'hôte la plus importante d'hyperproduction d'enzymes alimentaires (Schuster et al., 2002).

A part les nombreux usages industriels, Aspergillus niger est un important microorganisme écologique, en effet il joue un rôle important dans la biodégradation des produits chimiques les plus toxiques comme l'hexadécane (Volke-Sepulveda et al., 2003), le traitement du rejet de la mélasse du bettrave et les margines (Jiménez et al., 2003; Vassilev et al., 1997), et la bioconversion de la boues de eaux usées (Molla et al., 2002). La biomasse d'Aspergillus niger est également utilisée dans la biosorption des métaux lourds risqués tels que le cadmium, le chrome et le cuivre (Dursun et al., 2003 ; Kapoor & Viraraghavan, 1997).

L'usage de produit naturel comme un support solide et une source d'énergie et de carbone, particulièrement les résidus agricoles offrent l'avantage de combiner l'utilisation d'un substrat bon marché et une intéressante voie de valorisation de ces sous produits. Nombreux sous produits générés par des industries agro-alimentaires ont été utilisés comme un substrat, tels que : le résidu de canne à sucre, le son de blé, de riz et d'orge et la paille, la pulpe de betterave et la pulpe de café (Cordova et al., 1998 ; Pandey et al., 2000 ; Mandviwala & Khire, 2000, Brand et al., 2000 ; Roussos et al., 1995 ).

Divers études antérieurs ont exhibé l'aptitude de cette souche : Aspergillus niger a attaqué les complexes polysaccharides tels que les pectines et les arabinoxylanes, les composés les plus rencontrés dans la paroi cellulaire. Les dérivés d'acide cinnamique comme l'acide coumarique et l'acide férulique sont liés d'une façon covalente avec ces polysaccharides via des liaisons esters, accroissant ainsi la complexité avec ces structures polysaccharidiques. La dégradation des polymères de cette paroi cellulaire exige plusieurs enzymes hydrolytiques à savoir : hémicellulases, xylanases, pectinases et estérases qui peuvent être produite par cet ascomycète universel (Asther et al., 2002).

III-1 Quelques enzymes produites par Aspergillus niger

III-1-1 Estérase

L'estérase « carboxylique ester hydrolase » est spécifique aux esters solubles, en revanche la lipase « carboxylique ester hydrolase » est spécifiquement active sur les esters d'acide gras insolubles et elle n'hydrolyse que les liaisons esters présents uniquement à l'interface eau-huile. L'estérase est une enzyme qui catalyse l'hydrolyse de diverses liaisons esters. Elle est subdivisée en plusieurs groupes dépendants de la liaison esters qu'elle a hydrolysée. Ces dernières agissent sur les esters carboxyliques (3.1.1), thiolestérase (3.1.2), monoester phosphorique hydrolase, les phosphatases (3.1.3), phosphodiesters hydrolases (3.1.6), diphosphoprique monoestérase (3.1.7) et les triesters phosphoriques hydrolases (3.1.8) (Ismail, 1998).

Parmis les estérases, l'estérase féruloyle ou cinnamoyle qui appartient à la surclasse des ester carboxyliques hydrolases. Elle hydrolyse la liaison esters entre le sucre et l'acide hydroxycinnamique. Ces enzymes sont purifiées et caractérisées à partir de plusieurs microorganismes, incluant Streptomyces olivochromogenes, Clostridium stercorarium, Aspergillus awamorri et Aspergillus niger (Faulds & Williamson, 1991 et 1994 ; Donaghy et al., 2000 ; McCrae et al., 1994 ; Kroon et al., 1996).

3-Glucoside glucohydrolase, communément appelé 3-glucosidase, catalyse l'hydrolyse des liaisons alkyle et aryle-3-glucoside, tels que la di-glucoside, les oligosaccharides et les polysaccharides. Cette enzyme, O-glucoside hydrolase, « EC 3.2.1.x » est un large groupe d'enzyme biochimiquement et industriellement important. Vu le nombre important des combinaisons possibles entre les carbohydrates, il existe alors un large nombre de glucosidase spécifique à beaucoup de substrat (Henrissat, 1998).

III-2 Applications biotechnologiques des estérases et de Ji-Glucosidase

III-2-1Applications biotechnologiques des estérases

Les estérases sont impliquées dans plusieurs réactions de bioconversion. En effet, cette dernière est capable d'estérifier les acides gras du lait. Cette estérification conduit à la formation des esters de ces acides qui sont responsables du développement d'un arôme de fruit dans l'industrie artisanale du fromage (Reddy et al., 1970). Une technique biotechnologique simple pour l'obtention d'arôme de fraise par l'estérase de Pseudomenas fragi qui croit dans le lait écrèmé et le lactosérum (Ismail, 1998).

Le traitement enzymatique des sous produits d'huile d'olive utilisant le jus de culture d'Aspergillus niger enrichie d'estérase cinnamoyl a été testé avec sa possibilité de libération de composés phénoliques simples et exceptionnellement l'hydroxytyrosol (Bouzid et al., 2005). Ces enzymes sont capables d'hydrolyser les liaisons esters entre les composés phénoliques et les polysaccharides.

La 3-glucosidase est largement utilisé dans divers procès biotechnologiques, incluant la production du fuel éthanol à partir des résidus agriculturals cellulosiques (Bothast et Saha, 1997). Elle participe dans la celluloyse en hydrolysant le cellobiose. La 3-glucosidase joue un rôle important dans l'étape finale de la saccharification biologique du matériel cellulosique. Certaines 3-glucosidases catalysent non seulement les réactions d'hydrolyse mais aussi les réactions de trans-glycosylation (Cote et Tao, 1990). En addition, la 3-glucosidase joue un majeur rôle dans la formation des arômes du vin et du pomme sucré « Shochu » (Ohta et al., 1991). Ceci est due à l'hydrolyse de terpenyl-3-D-glucosides en terpen (Vasserot et al., 1995). De plus cette enzyme est démontré efficace dans la libération des composés phénoliques simple à partir des sous produits de l'industrie oléicole (Briante et al., 2000 ; 2002).

III-3 Immobilisation des Ji-Glucosidases

L'utilisation des enzymes immobilisées présente un grand intérêt pour différentes applications industrielles notamment pour la production des sucres, des acides aminés, et des drogues depuis plus de deux décennies (Saudagar et Singhal, 2004). L'idée fondamentale d'immobiliser les enzymes est d'inclure la protéine dans un support semi-perméable, qui empêche l'enzyme de partir tout en permettant à des substrats, à des produits, et à des cofacteurs de passer à travers. Bien que les conditions exactes pour la matrice d'immobilisation sont dictées par le type d'enzyme et l'application prévue, il est clair que le matériel doit au moins être non dégradable et compatible avec les enzymes. Le procédé pour l'immobilisation doit également être assez doux pour ne pas dénaturer l'enzyme pendant la préparation (Taqieddin et Amiji, 2004).

Soit en tant qu'enzymes libres : ceci nécessite une étape de purification induisant une perte partielle de celles-ci, mais est idéale pour des enzymes sécrétées ;

soit en cellules entières : ceci est simple et idéale pour des enzymes intracellulaires puisqu'elle évite les étapes de purification. Cependant, des réactions parasites peuvent interférer sur le produit et entraîner sa dégradation.

L'immobilisation, d'une manière générale, permet d'avoir une meilleure stabilité des enzymes, mais peut induire des problèmes de diffusion et d'accessibilité au substrat contrairement aux enzymes libres. L'immobilisation peut être réalisée sur différents types de support, mais la plupart des supports présentent l'inconvénient d'être chers. Les principales méthodes pour préparer une enzyme immobilisée incluent l'adsorption, l'inclusion, la liaison covalente et l'encapsulation (Fig. 8). Quant aux matrices utilisées, on a principalement deux types qui sont les plus employées (Saudagar et Singhal, 2004 ; Bai et Zhou, 2004) :

les polymères : l'agarose, la cellulose, les dextranes, les polymères tels que le chlorure polyvinylique, les acrylates, les nylons, le polystyrène. La matrice de polymère est aisément fonctionnelle et l'attachement de la protéine s'effectue facilement ;

les matériaux inorganiques : la silice sous forme de billes de verre microporeuses et de gel de silice, peuvent doter les enzymes immobilisées des propriétés mécaniques sur la stabilité de pression.

Des hybrides de ces matières premières telles que l'amide d'agarose-acryl et la silice polymère-enduite ont été également employés pour l'immobilisation des enzymes.

L'alginate est de loin le polymère le plus largement répandu pour les technologies d'immobilisation et de micro-encapsulation. L'alginate est un extrait d'algue composé de chaînes alternant les résidus d'acide á-L-guluronique et d'acide â-D-mannuroniques. Les supports d'alginate sont habituellement faits en réticulant le groupe carboxylique de l'acide á-L-guluronique avec un ligand cationique tel que le chlorure de calcium, le chlorure de barium, ou le poly-(L-lysine). Les matrices d'alginate réticulées avec des ions de Ca²⁺, sont cependant instables dans l'environnement physiologique ou dans les solutions tampons communes ayant une concentration élevée en ions phosphate et citrate qui peuvent extraire les ions Ca²⁺à partir de l'alginate et liquéfient le système (Taqieddin et Amiji, 2004).

Les enzymes immobilisées déjà présentent sur le marché ont plusieurs avantages au niveau de leurs utilisations industrielles, mais également quelques inconvénients (Tableau 3).

Tableau 3 : Avantages et inconvénients des enzymes industrielles immobilisées (Demirel et al., 2004).

Avantages	Inconvénients
· Économie d'énergie	· Problèmes liés à la dénaturation des	· Équipements adaptés...
enzymes	· Très haute spécificité enzymatique
· Prix élevé de certaines applications	· Conditions douces d'utilisation (pH,
· Nécessité de co-facteurs (Ca2+,..) pour	T°C)
certaines réactions	· Peu de problèmes de stockage des
· Contrôle et ajustement du pH	préparations enzymatiques
· Milieux réactionnels variés induisant des	· Catalyseurs actifs à faibles doses
mécanismes enzymatiques complexes :	· Très haute vitesse de réaction et contrôle
- Catalyse homogène en milieux aqueux	facile
- Catalyse hétérogène (substrats insolubles,	· Synthèses stéréospécifiques,...
réactions en milieu organique)	· Biodégradables

Trichoderma atroviride est un ascomycète, et un mycoparasite effectif, fort et puissant. Il est à l'origine de divers pathogénies de plantes impliquant des modifications morphologiques, des secrétions enzymatiques et des antibiotiques (Reithner et al., 2007). Un travail ultérieur de Kovács et al. (2008) a décrit la sécrétion d'un nouveau microorganisme cellulotique « Trichoderma atroviride » dans le sol prétraité tout en produisant des cellulases et des â-glucosidases dans ce matériel végétal.

I- Procédés de séparation membranaire

Tous les procédés de filtration utilisent une membrane qui constitue une interface séparant deux milieux, à savoir le rétentat du perméat. Le rôle de la membrane est d'agir comme une barrière mince sélective. Sous l'effet d'une force de transfert, elle permet le passage ou l'arrêt de certains composants entre les deux milieux qu'elle sépare. Selon les caractéristiques de la membrane, le transfert résultera, soit de la facilité à diffuser à travers le matériau, soit de la taille des composants par rapport à celle des pores de la membrane, soit d'une interaction ionique, soit d'une combinaison de ces différents paramètres. Dans le cas de la microfiltration, de l'ultrafiltration, de la nanofiltration et de l'osmose inverse, la force de transfert est un gradient de pression appliqué de part et d'autre de la membrane. Pour la dialyse et les membranes liquides c'est un gradient de concentration ; en ce qui concerne la pervaporation et la perméation vapeur, la force agissante est un gradient d'activité combinant pression et concentration. Enfin c'est un gradient de température qui est mis en jeu pour ce qui est de la thermo-osmose et de la distillation membranaire.

La figure 9 montre les techniques membranaires de filtration tangentielle les plus utilisées, leurs seuils de séparation et aussi leurs domaines d'application.

Figure 9 : Procédés de séparation sur membrane en fonction de la taille des solutés.

Les Procédés de séparation utilisant la technologie membranaire sont apparus dans les années 1970. Ces techniques qui utilisent des membranes synthétiques comme un obstacle pour les séparations sélectives sont en expansion très rapide en raison à leurs applications dans les processus de production. Ils sont fondamentalement utilisés dans le traitement de l'effluents industriels et l'industrie pharmaceutique et industries alimentaires, car ils offrent

des avantages comparatifs tels que la consommation de faible énergie, la souplesse de fonctionnement, la facilité d'automatisation et la température ambiante ou à proximité ambiante de fonctionnement (Scott, 1995).

La microfiltration utilisant des membranes en céramique devient rapidement la technologie de choix pour la séparation des cellules, ce qui freine les cellules entières tout en permettant à l'enzyme de passer à travers et d'être récupéré dans le flux de perméat. Il s'agit d'une alternative économiquement viable aux techniques de séparation classiques telle que la centrifugation. L'utilisation du procédé de filtration membranaire plus simple pour récupérer les cellules permet aux entreprises de biotechnologie la possibilité de simplifier leur économie.

Conclusion

La Tunisie, 4^ème producteur mondial d'huile d'olive, produit en moyenne 600 000 m³/an de margines. Ce volume engendre une charge organique d'ordre 60 milles tonnes de la DCO et 6 milles tonnes de polyphénols par an. L'absence des méthodes de traitement efficaces et économiques pousse les propriétaires des moulins à huile à décharger les margines dans des bassins d'évaporation (70 %) ou à les évacuer dans le milieu naturel (30 %), ce qui cause la diminution de la qualité des sols notamment l'activité microbienne et la contamination des nappes phréatiques. La décharge de ces rejets est donc un sérieux problème environnemental pour la Tunisie.

De nombreuses recherches relatives à l'étude de traitement visant à dépolluer les margines ont été menées depuis ces dernières décennies, mais la plupart d'entre elles présentent un caractère académique et ne permettent pas d'envisager l'extrapolation vers une application réaliste, soit pour des raisons techniques, économiques soit environnementales. Dans ce cadre, nous avons proposé de chercher un procédé de traitement de margines fiable pour toutes les raisons essentiellement celles liées à l'environnement.

Différentes études ont décrit la production de l'hydroxytyrosol à partir de molécules précurseur synthétique comme le tyrosol ou l'oleuropéine. Le problème réside que la concentration de l'hydroxytyrosol dans les margines brutes est très faible (de 0,2 à 0,4 g/l) et ne possédant pas un support de récupération. De propres procédures biotechnologiques doivent être développés afin d'augmenter la concentration de cette molécule des margines.

Les champignons sont des microorganismes qui sont bien connus pour leur excellente production des enzymes, qui sont utilisées dans plusieurs processus industrielles. L'importance des enzymes microbiennes dans les applications biotechnologiques a augmenté significativement dans ces deux dernières décennies et actuellement dans la biotransformation et la bioconversion des margines. Les enzymes offrent la voie la plus simple et la plus rentable afin de réduire l'utilisation des composés chimiques pour la conversion et la récupération des composés phénoliques à partir des margines (Briante et al., 2000-2004 ; Da Re et al., 2007).

Actuellement, la bioconversion des margines est le procédé clé pour leur valorisation biologique en raison de son faible coût et la production de molécules à hautes valeur ajoutées. Cette technique a été appliquée pour la première fois au traitement et l'exploitation des margines dans le cadre de cette thèse.

I- Matériel

I-1 Appareillages

- Système chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie

- Système chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de

- Système chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG-SM) de

I-2 Produits chimiques

Les produits utilisés au cours de cette étude sont de pureté garantie et procurés chez des fournisseurs agréés. Les fournisseurs et les produits sont :

Hydroxytyrosol, utilisé comme un standard, est purifiée à partir des margines dans notre laboratoire (Allouche et al., 2004 a). p-nitrophenol (PNP), p-nitrophenyl-3-D-glucopyranoside (PNPG), p-nitrophenyl acétate (PNPA), butylated hydroxytoluéne (BHT) and 2,6-diméthoxyphénol (DMP) est acquise de Sigma-Aldrich. La 3-glucosidase purifiée à partir d'Aspergillus niger (EC 2328898) est acheté aussi de Sigma-Aldrich. L'acétate d'éthyle, l'acétonitrile, et l'acide orthophosphorique sont des solvants à grade HPLC et acheté à partir de Prolabo (France). Le réactif de folin « Folin-Ciocalteu phenol » est procuré de Sigma-Aldrich Chemie (Switzerland). Le xylane de Sigma, hydroxyethylcellulose (Fluka 54290).

Finalement, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) et alginate (poudre) sont procurés de Fluka (Switzerland).

I-3 Substrats biologiques

I-3-1 Margine

Les margines utilisées proviennent du système d'extraction en discontinu «super presse» : MSP et du système d'extraction continu «chaîne continue» MCC, depuis la campagne de 2006-2007 jusqu'à celle de 2009-2010 de la région de Sfax. Les margines sont collectées dans des bouteilles et stockées dans le congélateur afin qu'elles gardent leurs caractéristiques biologiques et physico-chimiques initiales.

Le son de blé utilisé est procuré à partir de la Société Tunisienne de Produit Animale « STPA ». Un lot de dizaine de kilogrammes a été acheté et stocké dans la chambre froide à + 4 °C.

I-4 Origine des champignons utilisés

Trois souches de champignons ont été procurées de l'unité service de maintenance des souches du Centre de Biotechnologie de Sfax (CBS) à partir de la Collection Tunisienne des Microorganismes (CTM). Ces souches sont de références suivantes : CTM 10099 (Aspergillus niger), CTM 10156 (Trametes trogii), CTM 10476 (Trichoderma atroviride).

I-5 Milieux de culture

I-5-1 Milieu liquide à base de son de blé pour la production de â-glucosidase à partir d'une fermentation en erlenmeyer

Ce milieu de culture est constitué de 67 g de son de blé supplémenté de 1 g/l KH2PO4, 2,5 g/l K2HPO4 ; 0,3 g/l MgSO4·7H2O ; 0,3 g/l CaCl2 ; 3,75 g/l urée ; 3,75 g/l peptone de blé ; 1 g/l extrait de levure ; 1 ml/l Tween 80 et 1ml/l oligoéléments. Le pH est ajusté à 4 par l'addition de HCl (2 M). Ce milieu est par la suite stérilisé par autoclavage (20 min, 121°C).

Un fermenteur de volume total de 20 litres (Biolafitte) a été utilisé pour préparer une préculture d'A. niger. Le volume utile préparé est de 7 litres est constitué de 469 g de son de blé supplémenté de 7 g KH2PO4, 17,5 g K2HPO4 ; 2,1 g MgSO4·7H2O ; 2,1 g CaCl2 ; 52,5 g urée ; 7 g extrait de levure ; 7 ml Tween 80 et 7 ml oligoéléments. Le pH est ajusté à 4 par l'addition de HCl (2 M). Ce milieu est par la suite stérilisé par chauffage du contenue à 121°C

durant 20 minutes. Un prétraitement du son de blé a été effectué en l'hydrolysant partiellement par son chauffage jusqu'à ébulition durant 10 minutes et en ajustant son pH à 3. L'hydrolysat est filtré afin d'éliminer les macromolécules, par la suite, le filtrat est additionné au fermenteur. Cette étape supplémentaire d'hydrolyse du son de blé est effectué afin d'éviter l'appartiton abondante de mousse et/ou le colmatage des tyaux du fermenteur.

I-5-3 Milieu liquide à base de son de blé pour la fermentation d'A. niger pour la production de â-glucosidase

Un fermenteur de volume total de 100 litres (Biotron) a été utilisé pour préparer une culture d'A. niger. Le volume utile préparé est de 40 litres est constitué de 2680 g de son de blé préalablement hydrolysé supplémenté de 40 g KH2PO4, 100 g K2HPO4 ; 12 g MgSO4·7H2O ; 12 g CaCl2 ; 300 g urée ; 40 g extrait de levure ; 40 ml Tween 80 et 40 ml oligoéléments. Le pH est ajusté à 4 par l'addition de HCl (2 M). Ce milieu est par la suite stérilisé par chauffage du contenue à 121°C durant 20 minutes.

A court et à moyen terme les champignons sont conservés et repiqués sur le milieu solide ME. La composition de ce milieu est la suivante : extrait de malt 20 g/l, agar-agar 20 g/l. Le pH de ce milieu est réglé à 5,5.

I-6 Conditions opératoires de la préculture d'A. niger

Le fermenteur Biolafitle de volume total 20 litres a été utilisé pour lancer la préculture d' A. niger avec un volume utile de 7 litres. Des spores d'A. niger collecté stérilement à partir du milieu solide PDA sont inoculés à raison de 6 10⁸spores/ml. Le pH de la préculture est de 4,5. La température de la préculture est de 30°C. L'agitation est de 300 tours/min. La durée de la fermentation est de 5 à 7 jours et le volume d'air injecté est de 4 litres/min.

I-7 Conditions opératoires de la culture d'A. niger

Le fermenteur Biotron de volume total 100 litres a été utilisé pour lancer la culture d'A. niger avec un volume utile de 40 litres. Le pH de la culture est de 4. La température de la culture est de 30°C. L'agitation est de 200 tours/min. La durée de la fermentation est de 5 à 7 jours et le volume d'air injecté est de 18 litres/min.

I-8 Chromatographie liquide à haute performance (CLHP)

La chaîne CLHP utilisée est de type « Shimadzu ». Elle comprend une pompe de type « LC-6A », un détecteur de type « UV-SPD-6AV » fixé à une longueur d'onde égale à 280

nm, un intégrateur de type « CR-6A » et un injecteur de type « Rhéodyne 7125 ». L'éluant utilisé est un gradient de deux solutions : A (H3PO4; 0,1%) et B (acétonitrile-eau; 7/3, V/V). pendant 20 minutes, la proportion de la solution B augmente linéairement en passant de 20 % à 50 %. Cette dernière proportion de (B) est maintenue constante pendant 10 minutes puis elle augmente linéairement pour atteindre 80 % pendant 10 minutes. Enfin, la proportion de (B) diminue jusqu'à 20 % au bout de 1à minutes. Après filtration sur filtre 0,2 um, 20 ul de l'échantillon à analysé sont injectés dans une colonne de type « VP-ODS » de diamètre intérieur 4,6 mm et de longueur 25 cm. Le débit utilisé est égale à 0,5 ml/min.

J-9 Chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse (CLHP-SM)

Le système CLHP utilisé est de type « Water ». Il est constitué par une pompe « 600 E » et par un détecteur UV de type « Merck-Hitachi L-4000 UV detector ». La colonne employée est la même que celle utilisé dans la CLHP-UV. L'appareil (SM) est de type « Finnigan-MAT LCQ ». L'ionisation adoptée est une ionisation chimique par protonation. La température du vaporisateur est égale à 450 °C et celle du capillaire est de 150 °C.

J-10 Chromatographie phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG-SM)

Le système CPG-SM est de type « Hewlett-Packard model 5872 A ». La colonne utilisée est une colonne capillaire « HP5MS » de longueur 30 m et de diamètre intérieur égal à 0,32 mm. Les températures de l'injecteur, de l'interface et de la source sont égales à 260 °C, 280 °C et 175 °C respectivement. Le gaz vecteur est l'hélium utilisé avec un débit égal à 1,7 ml/ min. la température de la colonne augmente de 100 °C jusqu'à 260 °C pendant 10 minutes.

II- Méthodes

II-1 Techniques de culture de champignons

II-1-1 Extraction des spores et culture de la souche Aspergillus niger

La suspension qui stocke des spores est obtenue par culture du champignon dans le milieu PDA «Potato Dextrose agar » à 30 °C pendant 5 jours (Selvakumar et al., 1998). Les spores sont récupérées à partir de la surface par l'ajout de l'eau stérile contenant 2 % (V/V) de Tween 80 et grattées avec une spatule stérile. La suspension de spores obtenues est filtrées puis stockées dans le glycérol 25 % (V/V) à -20 °C.

La culture en batch d'Aspergillus niger est effectuée dans des Erlenmeyers de 500 ml contenant 100 ml de milieu de culture. L'inoculation est effectuée par 100 ul de la suspension de spores dans des conditions stériles. La culture est incubée au Shaker à 30°C et sous une agitation de 160 tr/min, pendant 10 à 15 jours.

II-1-2 Culture de la souche Trichoderma atroviride et de la souche Trametes trogii

Les mycéliums de champignons sont hydratés et inoculés dans le milieu solide PDA (Potato Dextrose Agar) et cultivés à 30 °C pendant 7 jours. 2 % (V/V) d'inoculum préalablement préparé et broyé sera transféré au milieu de production stérile qui est constitué par 100 ml de milieu de culture dans des erlenmeyeres de 500 ml. Ce milieu est identique à celui préparé pour la souche Aspergillus niger.

II-2 Techniques de récupération des enzymes et dosage de leurs activités

II-2-1 Préparation des enzymes

Les activités enzymatiques (laccase, estérase et â-glucosidase) sont déterminées dans le filtrat de la culture du champignon. Ce filtrat est obtenu par une filtration (moyennant un papier Wattman GF/D).

Pour la culture d'Aspergillus niger, l'échantillon est d'abord filtré (Whatman GF/D), ensuite centrifugé dans le but d'éliminer les spores qui sont formés pendant la fermentation d'Aspergillus niger. La solution d'enzyme clarifiée est stockée à -20 °C jusqu'à son utilisation ultérieure pour la biotransformation et/ou le dosage enzymatique.

La â-glucosidase purifiée à partir de la souche Aspergillus niger est préparée en dissolvent 1,5 mg de l'enzyme dans 0,8 ml du tampon citrate (20 mM pH 4,5).

L'activité â-glucosidase est déterminé selon la méthode développé par Norkrans (1950), mais en utilisant une concentration de la solution de substrat de 5mM à la place de 1 mM. Un volume de 0,1 ml de la solution enzymatique est mélangé à 1 ml de PNPG (5mM dans le tampon citrate de sodium (50 mM), pH 4,8). La réaction enzymatique se déroule à 50 °C pendant 10 minutes. La réaction est arrêtée en additionnant 2 ml de la solution Na2CO3 (1 M), suivit de 10 ml d'eau. L'absorbance est mesurée à 405 nm. Pour le blanc, 0,1 ml d'eau est additionné à la place de l'échantillon enzymatique. L'activité â-glucosidase est définie comme le nombre de umol de p-nitrophénol produit par minute sous les conditions opératoires (UI). Les activités sont mesurées en triplicata et exprimées en Unité international par millilitre (UI/ml), avec UI définie la quantité de l'enzyme qui catalyse la libération de 1 umol de p-nitrophenol par minute.

L'activité estérase est déterminée selon la méthode développée par Mackness et al. (1983). Le mélange réactionnel contient 50 ul du jus enzymatique, 50 ul de p-nitrophenyl acétate (PNPA) dans l'éthanol (150 mM), et 2,9 ml du tampon Tris 6HCL (9,2 mM, pH 7,5) afin d'obtenir une concentration de PNPA de 2,5 mM et un volume réactionnel total de 3 ml.

La réaction est initiée par l'addition de l'extrait enzymatique et incubé à 25 °C durant 4 min. L'absorbance est déterminée à 405 nm. La gamme étalon, et la courbe standard est préparée dans la série de 0 à 220 nmol de p- nitrophénol.

L'activité laccase est déterminée par l'utilisation de la solution DMP 10 mM dans le tampon tartrate de sodium (100 mM, pH 5). L'extinction molaire å469 est égale à 27,500/M cm, réfère à la concentration de DMP (Yaropolov et al., 1994). Les réactions enzymatiques sont effectuées à la température ambiante (22 à 25 °C). Une unité d'enzyme est définie comme étant la quantité d'enzyme oxydant 1 umol de substrat par minute.

L'activité á-amylase est déterminée par le mélange de 0,25 ml de l'échantillon avec 0.5 ml du tampon acétate (0.2 M ; pH 5,0) et 1.25 ml d'amidon soluble (1%). Après 10 min d'incubation à 50 °C, la concentration de glucose libérée à partir de l'amidon par l'action de á-amylase est estimée à l'aide du spectrophotomètre à 550 nm accordant la méthode de Miller (1959). Une unité (U) de l'activité á-amylase est définie comme la quantité de micromole de

sucre réducteur (glucose) libéré par minute sous les conditions de l'essai. Les résultats sont exprimés en UI/ml.

L'activité protéase est déterminée par le mélange de 0,5 ml de l'échantillon avec 0.5 ml de la solution caséine à 1 %. Après 15 min d'incubation à 50 °C, on ajoute 0,5 ml de TCA (Tri-chloroacétique acide) à 20 %. Après incubation à la température ambiante pendant 15 minutes. Une centrifugation à 13 000 tours/min est par la suite effectuée pendant 15 minutes. La concentration d'acides aminés libérés à partir de la caséine par l'action de protéase est estimée à l'aide du spectrophotomètre à 280 nm. Une unité (U) de l'activité protéase est définit comme la quantité de micromole d'acide aminé libéré par minute sous les conditions de l'essai. Les résultats sont exprimés en UI/ml.

L'activité endoglucanase est mesurée en utilisant le substrat hydroxyéthylcellulose (10 g/l) dans le tampon citrate (50 mM ; pH 4,8) (Bailey & Nevalainen, 1981). Le substrat (900 ul) est équilibré à 50 °C, 100 ul d'échantillon sont additionnés, et après 10 min 1500ul de réactif de DNS sont ajoutés (Ghose, 1987). Pour les standards, 100ul glucose (2.5-10 mM) sont additionnées au 900 ul de substrat et au 1500ul de DNS. L'échantillon et le standard sont bouillis à 100 °C pendant 5 minutes et refroidie à la glace. L'absorbance est mesurée à l'aide du spectrophotomètre à 540 nm

L'activité papier filtre est mesuré en suivant la méthode détaillé par Ghose, 1987. On utilise le papier filtre Wattman N°1 dans le tampon citrate (50 mM ; pH 4,8) et à 50 °C. L'activité papier filtre est exprimée en UPF (umol/min de substrat convertis)

L'activité xylanase est déterminée par la méthode de Bailey et al. (1992). Une unité (U) de l'activité xylanase est définie comme la quantité d'enzyme libérant 1umol de xylose équivalent par minute sous des conditions de pH égale à 5 et de température de 50 °C. Le substrat de l'enzyme est préparé à la concentration de 1% de xylane dans le tampon acétate pH 5.

II-3 Bioconversion de la margine

II-3-1 Méthode de la biotransformation

Le test de la bioconversion des margines sont étudiés en utilisant le mycélium d'Aspergillus niger (ou pelotes), filtrat de culture et le jus de culture entier (mycélium et le milieu extracellulaire).

L'effet de la température sur l'activité 3-glucosidase et l'efficacité de la biotransformation est déterminée par l'examen de son activité sur son substrat spécifique pNPG et sur la margine à pH 4,8 à différentes températures, à savoir de la température ambiante (25°C) jusqu'à 100°C.

L'effet du pH sur l'activité 3-glucosidase et l'efficacité de la biotransformation est déterminée par l'essai de son activité à 50 °C à différents pH (de 4,0 à 8,0). Des solutions tampon citrate (50 mM) sont préparés à différents pH (de 4,0 à 8,0) afin d'évaluer le comportement de l'enzyme dans la bioconversion des margines.

Différents volume de margines sont testés dans la bioconversion afin de chercher l'optimum de la bioconversion. En effet, des ratios de volume de margine / volume d'enzyme allant de 0,5 à 10 sont également testés.

La quantité de l'enzyme utilisée a été échangée de 40 UI à 9000 UI afin de chercher l'optimum de la biotransformation.

La biotransformation a été évaluée à deux différentes conditions à savoir la condition statique et la condition agité. Cette dernière condition à été menée à l'aide d'un réacteur adiabatique à double paroi moyennant un agitateur magnétique.

L'effet du temps de contact entre l'enzyme et les margine a été aussi testé. Une cinétique de la bioconversion est effectuée. Le temps de la réaction a varié de 15 minutes à 24 heures. Un contrôle est incubé par l'ajout de l'eau à la place de l'enzyme. Les échantillons sont réservés périodiquement à partir du milieu de la biotransformation pour les analyses ultérieures.

II-3-7 Bioconversion à grande échelle

Les réactions de bioconversion ont été menées dans un réacteur et un réservoir fixe en acier inoxydable dans des conditions optimales (Hamza, Khoufi & Sayadi 2012, a). Pour la grande échelle de cette réaction de bioconversion 15 L de deux types de OMW, (MCC: Margine Chaine Continuer et MSP: margine superbe Press, qui sont fabriqués à partir moulin Sfax) ont été effectuées dans un réacteur fermé "Biolift 20 L" . Cependant, 40 L de margines du Nord Tunisien ont été biotransformé dans un réservoir fixe inoxydable. Ces margines fraîchement recueillie ont été traitée avec la 3-glucosidase de concentration 500 UI/mL de milieu réactionnel. L'enzyme 3-glucosidase a été obtenue suite à la fermentation d'A. niger dans un fermenteur de 100 L durant 7 jours dans un milieu de culture enrichi par le son de blé. La réaction enzymatique se déroule dans un réacteur discontinu pilotée à 50 ° C pendant 120 min. La quantité de produit hydroxytyrosol et l'activité enzymatique residuel ont été déterminés au moment du déroulement de la réaction. Après bioprocédés, chacun sortes de margines sont collectées dans des tanks et conservés à 4 °C jusqu'à la séparation et la purification par des technologies membranaires.

II-4 Techniques séparatives membranaires

II-4-1 Procédés de séparation

Les expériences de filtration membranaire ont été réalisées avec des installations de microfiltration (MF) et ultrafiltration (UF) à échelle pilote. La microfiltration contient deux membranes tubulaires en céramique, sa surfce membranaire est egal à 0,2 m². L'ultrafiltration utilise des membranes organiques (18 PCI membranes d'ultrafiltration de PM 8000 daltons), sa surfce membranaire est égale à 0, 0825 m². Les caractéristiques techniques des membranes de MF et UF employés sont rapportées dans le Tableau 4.

Après la biotransformation, les grands volumes sont mélangés et préfiltrés par la gaze. La suspension est pompée dans la première étape à membrane, qui est la microfiltration. La phase dense colloïdale qui est sous la forme de micro-émulsion en raison de la présence de

micro-gouttes d'huile doit être retirée par des enzymes, mais dans notre expérience, elle est simplement rejetée. Les technologies membranaires, la microfiltration (MF) et l'ultrafiltration (UF) sont utilisés dans l'ordre. Le flux de perméat de chaque section, se nourrit de l'étape de filtration suivante.

Où J est le taux de flux moyen, VP est le volume total de perméat, AP est la surface effective

Le rejet est une détermination de la quantité de molécule cible qui est retenu par la membrane

Lorsque R est le coefficient de rejet, Cp la concentration de l'hydroxytyrosol dans le perméat,

Le VCR est un paramètre important dans le mode de fonctionnement de concentration par lot,

en indiquant la réduction du volume initial au cours du processus, en plus d'être le critère

pour mettre fin aux expériences de MF et UF. Le VCR est défini comme le rapport entre le

II-5 Concentration par évaporation

Le perméat de l'ultrafiltration est concentré par l'évaporation de l'eau et la concentration de polyphénols dans un petit volume. Une unité d'évaporation à l'échelle pilote se compose de trois parties: préchauffeur afin de porter la solution d'alimentation jusqu'à la température et la pression (45 ° C, 100 mbars) pour démarrer l'évaporation sur la première unité requise; des séparateurs pour la séparation la vapeur de la liquide phase, et enfin des condenseurs pour les vapeurs résiduelles et des unités de dégazage. La température d'évaporation ne dépasse pas 45°C pour éviter la détérioration thermique des polyphénols.

II-6 Extraction des composés phénoliques à partir des margines

L'extraction liquide-liquide des composés phénoliques est adoptée par l'acétate d'éthyle. Les échantillons des margines sont mélangés avec l'acétate d'éthyle (V/V). Le mélange est vigoureusement agité et centrifugé à 3000 tours/min pendant 5 minutes. La phase

organique est séparée et filtrée par une seringue à filtre (0,45 uM). Le filtrat est analysé directement par CLHP pour une détermination qualitative et quantitative des composés phénoliques.

II-7 Analyse par Chromatographie liquide à haute performance : CLHP

Le suivi de la concentration des molécules de monomères phénoliques contenus dans les margines est réalisé par chromatographie liquide à haute performance (CLHP). Les composés sont identifiés et quantifiés par la comparaison du temps de rétention et des aires des pics avec des échantillons standards.

Le suivi de la variation des masses moléculaires de polyphénols contenus dans les margines est réalisé par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) en utilisant une colonne TSK-G2000 S-W-Supelco de longueur égale à 300 mm et de diamètre intérieur de 7,5 mm avec un débit de 0,6 ml/mn. La chaîne utilisée est de type Shimadzu. Elle comprend :

- Un détecteur de type «UV-SPP-6AV» fixé à une longueur d'onde égale à 280 nm; - Un intégrateur de type «CR-6A»;

Comme phase mobile nous avons utilisé le tampon phosphate 0,1 M à pH 6,8. Ce tampon contient 0,5 g/l de NaN3 (conservateur) et 0,1 M de Na2SO4 (déshydratant). Le débit est de 1 ml/min. Avant l'injection, l'échantillon est filtré sur membrane « Millipore » de 0,45 ìm, puis dégazé sous l'hélium. Les composés aromatiques sont détectés à une longueur d'onde de 280 nm moyennant un détecteur UV (Shimadzu class-VP).

II-8 Détermination de l'activité antiradicalaire

II-8-1 Principe de la méthode

Cette méthode met en oeuvre un radical stable : 1, 1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical (DPPH). Ce radical peut fixer un (H°) arraché à l'antioxydant (AH). Il perd alors son absorbance à 520 nm et on calcule, après établissement de l'état stationnaire de la réaction, la quantité d'antioxydant nécessaire pour faire disparaître 50 % du DPPH (Brand-Williams et al., 1995). L'avantage de ce test est d'être rapide (2 à 6 heures) et de ne nécessiter aucune condition drastique.

II-8-2 Mode opératoire

Pour chaque composé à tester, des solutions sont préparées dans le méthanol à différentes concentrations. Pour chaque solution, 4 ml sont mélangés avec 10 ml d'une solution méthanoïque de DPPH de concentration 1.5 x 10^-4 M. Après agitation, les mélanges ainsi préparés sont incubés pendant 30 minutes à l'obscurité. La densité optique à 520 nm est par la suite déterminée. On représente ainsi la courbe donnant la variation de la densité optique en fonction du logarithme décimal de la concentration. L'activité antioxydante de chaque composé est exprimée en _IC50 (ug/ml) qui représente la concentration du composé à tester nécessaire à la neutralisation du 50 % des radicaux libres de DPPH. L'activité antioxydante est d'autant plus forte que la valeur de l'IC50 est plus faible.

II-9 Analyse des protéines

La concentration des protéines est déterminée en suivant la méthode de Bradford (1976).

Le test est basé sur l'absorbance d'une solution acide de bleu de Coomassie G-250 à la longueur d'onde de 595 nm quand la liaison aux protéines se produit. Les deux interactions hydrophobes et ioniques stabilisent la forme anionique du colorant, entraînant un changement de couleur visible. Le coefficient d'extinction est déterminé selon une gamme étalon d'une solution de Sérum Albumine Bovine (SAB) de concentration allant de 50 à 100 ug/ml de protéines.

On ajoute à 0,2 ml au réactif de Bradford, 0,8 ml d'une des solutions standard de protéines ou d'échantillons à doser préalablement dilués.

II-10 Détermination de la concentration des sucres réducteurs

Le réactif de DNS est préparé en mélangeant 10,6 de l'acide 3,5- dinitrosalicylique et 19,8 g de Na OH dans 1416 ml d'eau distillée. 306 g du tartrate de sodium et de potassium, 8,1 g de phénol et 8,3 g de sulfate de sodium sont par la suite additionné (Al-Zuhair, 2008). 100 ul de l'échantillon sont mélangés avec 900 ul du tampon citrate (50 mM pH 4,8). Ensuite 1,5 ml de la solution de DNS sont additionnés au mélange et chauffé dans l'eau bouillante pendant 10 minutes. Les échantillons sont ensuite refroidis à la température ambiante avec l'ajout de 10 ml d'eau distillée. L'absorbance à 550 nm est déterminée à l'aide du spectrophotomètre. La solution blanc est constituée de 100 ul d'eau distillée à la place de l'échantillon à analyser. La gamme étalon est préparée dans la série de 0 à 2 g/l de glucose.

II-11 Détermination de la concentration des ortho-diphénols totaux

La détermination de la concentration des phénols totaux revient à doser l'acide gallique équivalent (Bouaziz et al., 2005). 1 ml de l'échantillon dilué est transféré dans le tube à essai avec 1 ml d'éthanol à 95 %, 5 ml d'eau distillé et 0,5 ml de réactif de folin «Folin-Ciocalteu phénol» sont ensuite ajoutés. Après un temps d'incubation de 5 minutes, 1 ml de la solution Na2CO3 à 5 % est ajouté, bien homogénéisé et gardé à l'obscurité pendant une heure. Après, l'échantillon est vortexé et l'absorbance est mesuré à 725 nm utilisant le spectrophotomètre. La courbe d'étalonnage est réalisée avec l'acide gallique.

II-12 Analyse par GC-MS

L'échantillon de margine (20 ml) sont extrait avec l'acétate d'éthyle (60 ml). La phase organique est collecté et réduit à un volume de 10 ml par l'évaporation au rotavapeur (37 °C) et par la suite silylé. Pour la procédure de silylation, on prépare un mélange de pyridine (40 ul) et BSTFA (200 ul) et 20 ul d'extrait de margine qui est mélangé et vortexé dans les tubes en verre qui sont placés dans un bain marie à 80 °C pendant 45 minutes. A partir de la solution silylé 1 ul est directement analysé par GC-MS.

II-13 Détermination de la matière sèche (MS)

La matière sèche (MS) représente l'ensemble des substances organiques et inorganiques en solution ou en suspension, contenues dans l'échantillon. Cette matière est déterminée à 105°C par l'évaporation d'un échantillon de masse m1, dans un creuset en porcelaine de masse initiale m0, jusqu'à obtention d'une masse constante m2 (généralement après 24 h).

II-14 Dosage de glucose (méthode enzymatique GOD-PAP)

Le dosage enzymatique du glucose est effectué en présence des enzymes « glucose oxydase et peroxydase ». D'abord, le glucose est oxydé en acide gluconique avec libération de peroxyde d'hydrogène. Ce dernier réagit avec le phénol et le 4-amino-antipyrine et sous l'action de la peroxydase il donne une quinone-imine de couleur rosâtre. Trois échantillons sont préparés: le blanc (2,5 ml des enzymes + 20 ul d'eau bi-distillée), le standard (20 ìl standard + 2,5 ml des enzymes) et l'échantillon de margine (20ìl échantillon +2,5 ml des enzymes). Après incubation des échantillons à 37 °C pendant 15 min, la mesure de la densité

optique des échantillons est effectuée à 505 nm contre le blanc de réactif. Le calcul de la concentration du glucose est égal alors :

II-15 Estimation de la concentration en polyphénols des margines

Un volume de margine est extrait trois fois par trois volumes d'acétate d'éthyle dans une ampoule à décanter. La phase organique (phase supérieure) est récupérée dans un ballon de masse initiale m0, puis concentrée sous vide à l'aide d'un rota-vapeur. Ensuite, le ballon est rincé par un volume d'hexane afin d'éliminer la matière grasse. Ce ballon, portée au four 105°C pendant 2 h, acquière une masse m. La concentration (C) en polyphénols est la suivante :

II-16 Immobilisation en Alginate de â-glucosidase

Tout d'abord, on prépare une solution d'alginate de sodium en ajoutant 2,3 g pour 100 mL d'eau distillée bouillante sous agitation. L'homogénéisation s'effectue lentement et est accompagnée d'une désaération de la solution pendant 30 min. Lorsque la température est redescendue aux alentours de 40-45 °C, on ajoute l'enzyme toujours sous agitation.

La suspension ainsi réalisée est placée dans une seringue et une goutte à goutte est effectué dans une solution contenant un ion bivalent à savoir le chlorure de calcium (CaCl2) à 0,05 M maintenue sous agitation à température ambiante, ce qui va permettre la formation des billes. A l'issue de l'écoulement de la suspension, les billes sont laissées sous agitation 30 min, ensuite elles sont rincées à l'eau distillée puis mises à équilibrer dans une solution de chlorure de calcium (CaCl2) à 0,005 M. Les billes sont alors prêtes pour la bioconversion et conservées à 4 °C. Différents paramètres sont alors testés pour optimiser la bioconversion des composés phénoliques des margines, tels que :

? la taille des billes : Afin de tester l'effet de la taille sur la bioconversion, différents types de billes ont été coulés à l'aide d'embouts de tailles plus ou moins grandes afin d'obtenir des billes ayant une taille de 1 à 4 mm.

III. Caractérisation des margines brutes

La production nationale de margines qui proviennent du système à pression (40 %) et du système continu (60 %) s'élève à 650 000 m³/an (1995-2004). Sur 21 régions productrices de margine en Tunisie, la région de Sfax vient en première position avec 210 mille m³/an (Msallem et al., 2000). Les margines brutes utilisées au cours de notre étude sont issues de deux systèmes d'extraction « chaîne continue » nommé MCC et « super presse » nommé à son tour MSP. Le tableaux 3 résume les différentes caractéristiques physico-chimiques des margines utilisées.

Comme signalé dans la partie « Synthèse bibliographique », la composition des margines est non seulement dépendante du type d'extraction, mais également, et dans une moindre mesure, de la variété des olives, de la période de la campagne, des pratiques culturales et de la modalité de l'extraction (Lesage-Meessen et al., 2001; Obied et al., 2005). Ceci a été remarqué dans le Tableau 5, où les margines brutes provenant de deux systèmes d'extraction différents à savoir le Super Presse et la chaine continue, ont une variation des caractéristiques surtout celles responsables de leur richesse en polyphénols (polyphénols, ortho-diphénols, hydroxytyrosol,...).

	MCC	MSP
pH	5,1	5,4
Polyphénols (g/l)	30,3	33
Ortho-diphénols (mg/l)	7,42	4,34
Matière en suspension (g/l)	110,63	119,04
Sucre réducteur (g/l)	23	26,25
Glucose (g/l)	5,6	5,98
Hydroxytyrosol (g/l)	0,019 à 0,045	0,022 à 0,065
â-Glucosidase (UI/ml)	80	83

L'analyse du Tableau 5 montre que les margines ont un pH légèrement acide, ils renferment une quantité de sucre réducteur importante, qui est de l'ordre de 23 g/l pour les MCC et de 26,25 pour les MSP. Une activité â-glucosidase de 80 à 83 UI/ml dans ces rejets a été remarquable, qui peut avoir comme origine, soit le fruit, soit les microorganismes qui cohabitent ces rejets. Il est également remarquable que ces margines sont très riches en composés phénoliques ayant une moyenne de concentrations très élevées qui est de l'ordre de 30 g/l. En revanche, la quantité totale d'ortho-diphénols est très faible ; elle est de l'ordre de 7,42 mg/l pour margine chaine continue (MCC) et de 4,34 mg/l pour la margine Super Presse

(MSP). L'analyse chromatographique par le C18-CLHP montre que ces margines renferment une quantité très faible en hydroxytyrosol (0,019 à 0,065 g/l) et une quantité importante en oleuropéine et ses dérivés (Figure 11). L'ensemble de ces caractéristiques mettent les margines parmi les effluents industriels les plus toxiques et les plus riches en composés phénoliques. Une voie de valorisation de ces rejets par leur enrichissement en composés à haute valeur ajoutée comme les antioxydants sera alors prometteuse.

La composition phénolique des margines a été étudiée profondemment par plusieurs chercheurs (Bianco et al., 2003; Della Greca et al., 2004; Obied et al., 2005; De Marco et al., 2007). Les polyphénols des margines sont surtout représentés par les monophénols simples et les composés polymérisés tels que les tannins, les flavonoides, l'oleuropéine qui est le composé sécroiroide, le déméthyloleuropéine et le dialdéhydique formé de l'acide élénolique (EDA) liée du 3,4-dihydroxyphényléthanol (3,4-DHPEA ou hydroxytyrosol). Également, ce rejet contient d'autres sécoiroides comme le verbascoide et le ligstroside. D'autres groupes de composés phénoliques y sont présents qui sont des dérivés d'acide cinnamique (acide p-coumarique, férulique et caféique) et d'acide benzoïque (acide 3,4-dihydroxyphényacetique et acide 4-hydroxybenzoique). D'autre phénols sont retrouvés dans les margines comme le catéchol, méthylcatéchol, phénylalchols (tyrosol, hydroxytyrosol). Et relativement une haute concentration de composés flavonoïques qui sont représentés par les catéchines, les quercétines, les dihydroxyglycones, et les anthocyanes (cyaniding-3-glucoside et cyaniding-3-rutinoside). Ces dernières sont responsables de la coloration rouge à noire des margines (Fernández-Bolaños et al., 2006). Particulièrement, le glucoside d'hydroxytyrosol est le composé phénolique prédominant des margines et de la drupe d'olive (Romero, et al., 2002). Ces composés phénoliques ont des structures chimiques extrêmement variées. Plusieurs approches peuvent être appliquées pour l'identification des composés phénoliques. Parmi ces techniques on site la chromatographie liquide à haute performance (CLHP), la chromatographie gazeuse - spectrométrie de masse (CG-SM) et chromatographie liquide - spectrométrie de masse (LC-SM) qui sont les plus efficaces.

Figure 11: C-18 CLHP chromatogramme de l'extrait de margine brute frais. HT : hydroxytyrosol, Ty :Tyrosol, OE : Oleuropéine.

I-Introduction

La recherche d'une méthode douce et non coûteuse d'enrichissement des margines en terme de d'hydroxytyrosol sera alors essentielle. Nous nous sommes intéressés ainsi à la recherche de la méthode optimale pour l'enrichissement des margines en hydroxytyrosol. La meilleure conception de cette méthodologie proposée est que les polyphénols contenus dans les margines peuvent être modifiés au sein des margines moyennant leur bioconversion tout en offrant un extrait riche en composés phénoliques simples. Ces derniers, sont utiles pour les industries pharmaceutiques, alimentaires et cosmétiques d'une part, et qui produisent un rejet pauvre en polyphénols réduisant considérablement sa demande chimique en oxygène (DCO) en d'autres termes.

L'étude comparative de la bioconversion moyennant différentes enzymes tels que la â-glucosidase pure et l'estérase pure et d'autres enzymes commerciales a été également effectuée.

Une étude ultérieure a reposée sur le test de l'efficacité de l'immobilisation sur la bioconversion des margines.

Une dernière partie de cette thèse a reposé sur la bioconversion des margines à grande échelle et la récupération de l'hydroxytyrosol par les techniques membranaires et la concentration du perméat de l'ultrafiltration par évaporation.

Chapitre I :

Optimisation de la production de â-glucosidase par le
champignon : Aspergillus niger.

I- Optimisation des conditions et de la composition du milieu de culture pour la production de Ji-glucosidase par Aspergillus niger

Les â-glucosidases sont fréquemment demandées dans les applications industrielles agro-alimentaires, en particulier le secteur oenologique (Lambrechts et Pretorius, 2000 ; Gueguen et al., 1996) pour la production d'arôme et l'odeur du vin, et le secteur oléicole (Bouzid et al., 2005 ; Ciafardini et Zullo, 2002 ; Briante et al., 2002) pour la production de composés phénoliques simples, libres et à haute valeur ajoutée à partir de sous produit de l'industrie oléicole tels que feuille, grignon, margine, ... Pour cela, les quantités d'enzymes utilisées sont de plus en plus importantes. Pour que l'enzyme produite soit compétitive sur le marché, elle doit être produite à des coûts infiniment réduits. En effet, une optimisation pour produire le maximum d'enzymes actives avec le minimum de produits et d'énergie s'impose. La production de la â-glucosidase dépend de plusieurs facteurs chimiques et physiques de fermentation (Barbagallo et al., 2004). La composition du milieu de culture tels que la nature de la source de carbone et d'azote et leur rapport C/N, les minéraux, les facteurs de croissances, les vitamines et les inducteurs, influence considérablement la quantité d'enzyme produite. Les paramètres physiques sont également déterminants sur la production et ce comme le pH, la température, l'aération et l'agitation. Les meilleures conditions pour produire le maximum de â-glucosidase avec la souche Aspergillus niger ont été donc étudiées.

I-1 Optimisation des paramètres du procès de production de Ji-glucosidase

I-1-1 Effet du pH initial et de la température

Dans le but de démontrer l'effet du pH initial sur la production de â-glucosidase, A. niger a été cultivée dans un milieu à base du son de blé avec différents pH initiaux allant de 2 à 10 dans des erlenmeyers. Les résultats obtenus sont regroupés dans la Fig 12a. Le pH optimum de la production de â-glucosidase est égal à 4. En tenant compte du temps d'incubation de ce champignon dans la culture submergée conduisant à un risque de contamination, ce pH acide est considéré comme une propriété physiologique favorable. Il a été reporté que plusieurs types de champignon sont plus acidophiles durant les cultures submergées tels que Ganderma lucidum (Yang & Lian 1998; Yang et al. 2000).

Afin de chercher la température optimale de production de â-glucosidase, ce microorganisme est cultivé à différentes températures (25 °C , 27 °C , 30 °C , 37 °C , 45 °C , 55 °C ). Le maximum de production de â-glucosidase mesurée durant cette fermentation a été illustré sur la Fig. 12b. D'après ces résultats obtenus, la quantité de â-glucosidase produite s'amplifie en augmentant la température d'incubation de 25 à 30 °C avec une température optimale de 30

°C. Pour les températures supérieures à 30 °C, le degré de production de cette enzyme décroit. En effet, la température 37 °C est attribuée à d'autres champignons mésophiles. Alors que les autres températures (45 °C et 55 °C) sont attribuées à un autre type de champignon thermophile. En conclusion A. niger est un champignon mésophile qui préfère une température de 30 °C et un pH égal à 4 pour la production de 3-glucosidase.

I-1-2 Effet de la taille de l'inoculum et les conditions de culture

Parmi différentes propriétés physiologiques, la taille de l'inoculum, peut jouer un rôle important dans le développement du champignon (Glazebrook et al. 1992). Pour examiner l'effet du volume de l'inoculum, A. niger a été cultivée dans un milieu liquide tout en variant la taille de l'inoculum (6 10⁷ spores/ml, 6 10⁸ spores/ml, 6 10⁹ spores/ml, 6 10¹⁰ spores/ml). Comme c'est montré sur la Fig. 12 C, la taille optimale de l'inoculum pour la production de 3-glucosidase par A. niger est de 6×10⁸ spores/ml. Un inoculum adéquat permet une initiation rapide de croissance du mycélium et de la formation de métabolites, et ceci par la colonisation totale du milieu par le champignon tout en réduisant l'envahissement du contaminant. Une diminution de la production d'enzyme est observée quand la taille de l'inoculum dépasse l'optimum. En effet, la production enzymatique atteint son plafond si un bon échange entre les nutriments et la biomasse aura lieu dans l'erlenmeyer. Pour cela, une agitation dans un shaker s'avère inévitable pour une meilleure production de l'enzyme par A. niger (Fig. 12d). Les conditions de déséquilibre entre les nutriments et la biomasse en prolifération résultent d'une diminution de synthèse d'enzyme (Ramachandran, et al., 2005).

Figure 12: Effets du pH initial du milieu (a), température d'incubation (b), taille de l'inoculum (c) et les conditions de culture (d) sur la production de 3-glucosidase durant une fermentation à base du son de blé par A. niger.

I-2 Sélection du substrat pour la production de Ji-glucosidase

Différents substrats ont été testés comme la seule source de carbone pour la production de 3-glucosidase par A. niger. La Fig. 13 donne le maximum d'activité 3-glucosidase mesurée durant cette fermentation. Pour les substrats solides testés, le son de blé prouve être le mieux approprié et convenable pour la colonisation du champignon, tout en indiquant une croissance maximale visible en surface de mycélium et un niveau de production d'enzyme le plus élevé (4500 #177; 0,08 UI/ml). Ce degré élevé de production de 3-glucosidase peut être attribué à la présence de 3-glucosides dans le son de blé. Le développement d'un processus de production de 3-glucosidase basé sur l'utilisation de son de blé comme un substrat solide est très fascinant, vu qu'il s'agit d'une source de carbone disponible et bon marché. Pour tous les autres substrats à base de céréales testés, tels que le son de l'orge (1790 #177; 0,06 UI/ml) et le gruau de farine (682 #177; 0,03 UI/ml) sont supposés un support de production de 3-glucosidase modéré. Alors que le saccharose (520#177; 0,2 IU/ml), la cellulose (191 #177; 0,25 IU/ml) et le

lactose (64 #177; 0,09 IU/ml) donnent uniquement un pauvre degré de production (Fig. 13a). Contrairement à ce résultat, Cruz et Park (1982), ont utilisé les graines de soja comme un substrat solide qui ont été économiques, très facile à fermenter avec une récupération facile des polysaccharides et des molécules obtenues suite à la fermentation. De même Garcia-Kirchner et al., 2005 ont utilisé différents résidues de matériel lignocellulosiques comme l'unique source de carbone pour la production de béta-glucosidase par A. niger, et ils ont démontré que les débris de canne à sucre sont le meilleur substrat.

La concentration initiale de son de blé de 7% est supposée la meilleure puisqu'elle permet l'obtention du maximum de production de â-glucosidase (4624#177; 0,25UI/ml) (Fig. 13 b). Quoique que les microorganismes filamenteux sont généralement reportés pour croitre, quand on se contente d'une humidité de substrat allant de 50 à 75% (Pandey et al., 2000). Annunziato et al., (1986) ont démontré que l'humidité initiale de 35% s'avère l'optimale pour un degré élevé de production de á-galactosidase par Aspergillus oryzae. Pour un substrat comme le son de blé, l'activité de l'eau est très élevée pour cette raison, une distribution superficielle de solution de sels minéraux augmente et engendre des agglomérations de substrat. Pour un substrat comme le son de blé, l'activité d'eau est très élevée par la suite une augmentation légère du contenu d'eau par l'addition de solution de sel minérale peut mener à l'agglomération du substrat. L'importance d'humidité et l'activité d'eau implique qu'il est nécessaire d'envisager les quantités d'eau exactes a ajouté au substrat, en le préparant (Gowthaman et al., 2001).

Figure 13: L'activité 3-glucosidase des préparations enzymatiques résultantes de la fermentation de différents substrats par A. niger (a) et de différentes concentrations de son de blé (b).

I-3 Sélection de la source d'azote pour la production de Ji-glucosidase

Différentes sources d'azote organiques et inorganiques à savoir urée peptone de caséine mycopeptone peptone végétale peptone de soja peptone de viande peptone de blé nitrate d'ammonium sulfate d'ammonium nitrate de sodium et nitrate de potassium ont été testées afin de démontrer leurs effets sur la production de 3-glucosidase par A. niger. Le maximum de production de 3-glucosidase durant la fermentation à été regroupé et illustré sur la Fig. 14. La quantité totale d'azote de ces sources est égale à la quantité de (NH4)2SO4 dans le milieu de base. L'utilisation de la peptone de blé et d'urée comme la source d'azote, produit la meilleure production de l'activité 3-glucosidase (4297 #177; 0,08UI/ml et 4100#177; 0,08UI/ml respectivement), par comparaison avec les autres sources d'azote utilisées. Ainsi, la peptone de blé et l'urée sont sélectionnés pour faire une expérience mélangeant ces derniers dans un seul erlenmeyer, depuis une activité assez importante de 3-glucosidase (6500 #177; 0,08 IU/ml) a

été obtenue quand la peptone de blé et l'urée sont ajoutés ensemble dans le milieu de culture comme une source d'azote. Pour les autres sources d'azote testés tels que la peptone de caséine (3025 #177; 0,06 IU/ml), la peptone végétale (3200 #177; 0,03 IU/ml), peptone de viande (3250 #177; 0,06 IU/ml) supposé de bon producteur de 3-glucosidase. La Mycopeptone (2150 #177; 0,2 IU/ml), la peptone de soja (2200 #177; 0,25 IU/ml), le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le nitrate de potassium (2100 #177; 0,09 IU/ml) et le nitrate de sodium (1000 #177; 0.09 IU/ml) donne uniquement des résultats modérés.

Figure 14: Activité 3-glucosidase des préparations enzymatiques résultantes de la fermentation de son de blé par A. niger avec la présence de différentes sources d'azote.

I-4 Effet du rapport C/N sur la production de Ji-glucosidase

Bien que le rapport C/N affecte fréquemment le taux de biosynthèse de plusieurs métabolites, l'influence du ratio C/N sur la production de 3-glucosidase reste non évaluée jusqu'à présent. Le comportement de la souche A. niger dans le son de blé durant 7 jours de fermentation à 30 °C avec différents rapport C/N qui varie de 1 à 80 ont été étudié en respectant l'activité 3-glucosidase. Comme c'est montré sur la Fig. 15, l'activité 3-glucosidase est très sensible au ratio C/N. En effet, la meilleure activité (7000 UI/ml) est obtenue avec le rapport C/N égale à 10. Nos résultats sont un meilleur agrément avec d'autres procès de fermentation pour la production d'autres types d'enzyme, par exemple, la biosynthèse de laccase est favorisée par un faible rapport C/N (Levin et al., 2002, 2010).

Figure 15: Activité â-glucosidase des préparations enzymatiques résultant de la fermentation du son de blé par A. niger avec la présence de différents ratios C/N.

II- Résultats de la fermentation d'Aspergillus niger sur le milieu de culture optimisé

II-1 Enzymes produites durant la fermentation d'Aspergillus niger dans le son de blé

La caractérisation de la préparation enzymatique obtenue à partir de jus de culture d'A. niger à la fin de la fermentation a permis de décrypter la biosynthèse de la majorité des enzymes produites par cette souche. Les résultats obtenus sont regroupés sur le tableau 6.

Tableau 6: Caractérisation de la préparation enzymatique obtenue à partir de jus de culture

D'après ces résultats, la quantité de protéine produite est de 127 ug/ml et celle de sucre réducteur résiduel est de 1,75 g/l. Le jus de culture est dépourvu de laccase (0 UI/ml) et de protéase (0 UI/ml), alors que la biosynthèse de á-amylase (92,22 UI/ml), de xylanase (5,4 UI/ml), CMCase (0,6 UI/ml) et d'activité papier filtre (0, 144 UI/ml) s'avère assez modérée. Quant à la production d'estérase (100 à 230 UI/ml) est moyennement importante. Et la meilleure biosynthèse enzymatique par cette souche dans ces conditions optimales est réservée pour la 3-glucosidase (7185 UI/ml) vu la richesse du milieu de culture en 3-glucanes.

II-2 Caractérisation du jus de culture d'Aspergillus niger

II-2-1 Evaluation de protéines et de sucre réducteur dans le jus de fermentation

Le contenu en protéine et en sucre réducteur (SR) dans le filtrat de jus de culture fongique est aussi déterminé durant la fermentation. Les résultats collectés sont illustrés dans la Fig. 16a. Durant cette fermentation, la croissance du champignon est rapide durant les trois premiers jours de l'incubation et le mycélium colonise efficacement entiérement le substrat pendant le huitième jour. Les résultats montrent que la quantité en protéine dans le jus de fermentation croît linéairement jusqu'à atteindre 127 ug/ml à la fin de la fermentation (Fig. 16a). Ce résultat indique la production progressive des enzymes extracellulaires par le champignon. La Fig 16a montre aussi l'évolution de la concentration des sucres réducteurs durant le temps d'incubation. L'analyse de ces résultats montre que la concentration des sucres réducteurs augmente durant le début de la fermentation qui est enrichit à 8 g/l en 2 jours de fermentation. Cependant, cette concentration décroît à 1 g/l durant le troisième jour d'incubation et se stabilise à cette valeur durant tout le temps d'incubation. Ces résultats peuvent être expliqués par la libération de sucres réducteurs à partir des polysaccharides du son de blé par les cellulases d'A. niger et la consommation simultanée de ces derniers par le mycélium produit.

II-2-2 Evaluation des activités Ji-glucosidase et estérase dans le jus de fermentation

La production d'une préparation multienzymatique par A. niger sur le son de blé est améliorée par l'optimisation des paramètres opératoires de la culture et de la composition de milieu de culture comme il a été décrit dans la partie I présentée ci-dessus. La production des enzymes fongiques est contrôlée par la mesure de l'activité 3-glucosidase et estérase. L'activité 3-glucosidase et le contenu en protéine dans le milieu extracellulaire sont des indicateurs d'une colonisation fongique efficace, et cette activité croît avec le temps de culture (Fig. 16). Les résultats collectés suite à l'étude de la cinétique de production de 3-glucosidase et d'estérase ont été illustrés sur la Fig. 16b. Durant la production de 3-

glucosidase par le champignon ; une phase de latence est observée durant les 3 premiers jours de la fermentation. Par la suite deux phases peuvent être regardées ; d'abord une première phase avec une vitesse de production de â-glucosidase modérée; cette phase commence le quatrième jour (714 UI/ml d'activité â-glucosidase) et s'achève vers le septième jour (4233 UI/ml d'activité â-glucosidase). (Fig. 16b). A partir du huitième jour d'incubation de la culture on note une deuxième phase de production de â-glucosidase où l'activité â-glucosidase croit de 5938 UI/ml à 6380 UI/ml. Cette dernière présente la vitesse de production la plus intéressante. Concernant la seconde enzyme, l'estérase, la Fig. 16b montre que cette activité croît durant les deux premiers jours de la fermentation pour aboutir à 230 UI/ml, puis elle décroît à 140 UI/ml tout en restant presque stable jusqu'à la fin de la fermentation. Cette étude indique une colonisation efficace du champignon sur le son de blé avec une production efficace de â-glucosidase et d'estérase. De plus, les résultats ont montré que le jus de culture est un mélange multienzymatique estérase, CMCase, á-amylase, xylanase et â-glucosidase comme a été décrit dans la partie II-1 de ce chapitre. Ces enzymes sont connues de leurs rôles important dans la mobilisation des substrats phénoliques durant les bio-procès fongiques (Benoit et al., 2006). Pour cela, nous développeront une voie d'enrichissement des composés phénoliques simples dans les margines par le jus de culture produit par la fermentation d'A. niger. L'utilisation de ce jus de culture bien enrichit en â-glucosidase peut résoudre le problème des faibles concentrations en hydroxytyrosol dans les margines fraîches et les problèmes techniques industrielles en relation avec l'hydrolyse chimique des margines.

Figure 16: Evaluation de la quantité de sucre réducteur et de protéines dans le jus de
fermentation durant le temps d'incubation (a) et la production de 3-glucosidase et d'estérase
dans des erlenmeyers agités (b) sous les conditions optimales de culture à travers une
fermentation d'A. niger sur le son de blé.

III- Caractérisation de la Ji-glucosidase d'A. niger

III-1 Détermination de pH optimum

L'étude caractéristique du jus enzymatique a été développée afin de déterminer le pH

optimum de l'activité 3-glucosidase. L'enzyme est testée dans un large domaine de pH (de 2 à 10). Conformément à la Fig 17a les résultats montrent une meilleure activité pour les pH acide que pour les pH alcalin. A pH 4,8 l'enzyme montre 100 % d'activité. Cependant, une négligeable activité est obtenue pour les pH de 7 à 10. Donc la 3-glucosidase obtenue est active dans des environnements acides de pH allant de 4 à 5. Ceci est assez avantageux pour des applications industrielles par cette enzyme et notamment pour le traitement des margines.

III-2 Détermination de la température optimale

L'étude thermique de l'activité enzymatique a été également effectuée. La température optimale de la préparation enzymatique est déterminée à pH 4,8. Une variation de température de 25 °C à 100 °C a été choisie. Les résultats relatifs à cette étude thermique sont collectés et présentés sur la Fig. 17b. La préparation enzymatique est plus active à 50 °C et l'activité 13-glucosidase décroit à 40 % à 70 °C (Fig. 17b). Donc cette enzyme s'avère non thermophile. La stabilité thermique de la 13-glucosidase est déterminée par incubation du jus enzymatique à trois différentes températures à savoir : 4 °C, 25 °C et 50 °C. L'activité résiduelle est déterminée après 1 heure d'intervalle durant 48 heures d'incubation. Le résultat est résumé dans la Fig. 17c. D'après ce résultat, la conservation à 4 °C garde la bonne activité de la 13-glucosidase durant la période d'étude. Ainsi, la demi-vie de l'enzyme est de 24 heures à 50 °C. A la température optimale de 50 °C au bout de 3 h, on trouve encore 75% d'activité résiduelle. Cette enzyme est alors non thermostable mais elle est convenable à la température optimale pour des applications en bioconversion.

Figure 17 : Caractérisation de la 13-glucosidase d'A. niger: Influence du pH (a), Influence de la température (b), stabilité du jus enzymatique à 4°C, 25 °C et 50 °C (c).

IV- Production de â-glucosidase en fermenteur

Un fermenteur de volume total de 100 litres a été utilisé pour préparer une culture d'Aspergillus niger. Le volume utile préparé est de 40 litres. La souche A. niger CTM 10099 a été utilisée pour la production de â-glucosidase à partir de la fermentation de son de blé. Le procédé de la fermentation est schématisé sur la Fig 18.

Figure 18 : Diagramme de fermentation à grande échelle d'A. niger sur le son de blé et la
récupération de l'enzyme.

La figure 19 représentant les cinétiques de production des â-glucosidase en fermentation à grande échelle (40 litres de volume utile dans un fermenteur de 100 litres de volume total) montre que la production de cette enzyme nécessite une phase de latence de 3 jours où l'activité enzymatique est presque constente est égale à 1000 UI/ml. Par la suite la production enzymatique entre dans une deuxième phase et augmente progressivement pour atteinde 3390 UI/ml et cette phase passe du quatierième jusqu'à huitième jour de la fermentation. Enfin la dernière phase où la production enzymatique décroit légérement pour atteindre 3000 UI/ml au neuvième jour de la fermentation. Ceci peut être expliqué par l'épuisement des substances nutritives à partir du milieu de culture. Une fermentation en continue peut améliorer l'induction de production de cette enzyme. Le pouvoir inducteur du son de blé a été mis en évidence en fermentation d'Aspergillus nier sur ce substrat aussi bien

en erlenmyer qu'en fermenteur. La fermentation en milieu liquide a en effet montré le grand pouvoir inducteur du son de blé vis a vis de la production de la béta-glucosidase. D'autres chercheurs ont montré l'aptitude à produire les activites 3-glucosidase sur le bagasse par deux souches fongiques à savoir Talaromyces thermophilus et Trichoderma reesei mais avec un taux maximal inférieur à celui obtenu par A. niger (30 UI/ml) (Boussarssar, 2008).

Figure 19 : Cinétique de production de 3-glucosidase en fermentation à grande échelle d'A.
niger sur le son de blé.

IV-1 Procédé de la microfiltration tangentielle pour la clarification de jus de fermentation

Pour la récupération d'enzyme à partir du jus de culture, la première étape est le retrait du mycélium à partir du bouillon de fermentation. En général, les techniques de centrifugation et la filtration conventionnelle sont utilisées à cette fin. Avec une forte consommation d'énergie, ces techniques ne donnent pas 100% de récupération, comme la plupart des produits reste piégé à l'intérieur du gâteau du mycélium. Elle exige un lavage poussé du mycélium pour augmenter la récupération du produit. La technologie de séparation par membrane a de nombreux avantages par rapport aux classiques de filtration et la centrifugation (Sheehan, Hamilton et Levy, 1988). La microfiltration est utilisée pour la clarification du bouillon de fermentation et de la récolte de cellules (Strathmann, 1985; couronnes, Nissen et Ziegler, 1987; Frenander et Jonsson, 1996). Afin de bien séparer le culot (mycélium de champignon) de jus de fermentation qui renferme l'enzyme recherchée (3-glucosidase), un procédé de technologie membranaire a été utilisé moyennant la microfiltration tangentielle qui utilise un flux parallèle à la membrane utilisée ayant un diamètre de pores de 0,2 um. Le bilan de ce procédé est résumé sur le tableau 7.

Activité 3-glucosidase avant microfiltration = Activité 3-glucosidase après microfiltration Activité 3-glucosidase avant microfiltration = Activité (Filtrat+ Rétentat+ Eau de lavage)

Le bilan de la microfiltration a décelé une perte de 12,96 KUI. La microfiltration permet une bonne séparation du mycélium du jus de fermentation avec sa bonne clarification en éliminant tous les résidus du son de blé résiduels, les mycéliums et les spores, néanmoins ce procédé de microfiltration présente des pertes de 10,58% d'enzyme qui sont retenus dans la membrane, comme le montre le bilan.

	Activité (UI/ml)	Activité totale (KUI)	Rendement (%)
Jus de fermentation	3500	122,5
Filtrat	2028,5	60,855	49,67
Rétentat	7642	38,21	31,19
Eau de premier lavage	1000	10	0,16
Eau de deuxième lavage	95	0,475	0,38
Activité totale		109,54	89,42
Pertes		12,96	10,58

IV-2- Procédé de la concentration du filtrat

La concentration du jus de fermentation filtré a été effectuée moyennant l'évaporation

de l'eau par la chaleur en utilisant la Rotavap. Un essai a été effectué pour choisir le barème temps, température adéquat. Trois différentes températures ont été testées à savoir 40 °C, 50 °C et 60 °C pour obtenir un facteur de concentration égale à 5,71 (cad Vi = 200 ml et Vf = 35

ml). Les résultats obtenus relatifs à l'activité enzymatique avant et après concentration ont été regroupés sur le tableau 8.

D'après ces résultats on remarque qu'avec le facteur de concentration de 5,71 ; presque une même activité finale de â-glucosidase obtenue après la concentration du jus de fermentation. La température 60 °C n'altère pas l'activité de l'enzyme après 40 min de chauffage.

IV-3- Effet de l'hydrolyse du son de blé sur la fermentation

Le son de blé est un sous produit non soluble dans l'eau, il est très riche en glucanes et en polysaccharides. En revanche ce dernier peut engendrer des problèmes de mousse dans le fermenteur qui est sous agitation continue durant plusieurs jours tout en créant un milieu hétérogène non uniforme pour les champignons. L'idée de son hydrolyse préalable avant son utilisation dans le fermenteur peut améliorer le rendement de production de l'enzyme. Les résultats relatifs de cette partie sont résumés sur le Tableau 9.

L'activité â-glucosidase du jus a été améliorée de 1,5 fois par l'hydrolyse du son de blé, elle est de l'ordre de 3895 UT/ml. Le son de blé a subit une hydrolyse avec l'acide (pH = 3) suivie d'un traitement thermique (chauffage jusqu'à ébullition pendant 10 minutes). Ce traitement peut libérer des polysaccharides et/ou de glucides à assimilation facile par le champignon qui rend sa croissance plus aisé sur ce substrat et sa synthèse de â-glucosidase plus élevée.

Chapitre II:

L'utilisation des enzymes hydrolytiques : une méthode douce pour la récupération de l'hydroxytyrosol à partir des margines.

I. Mise en évidence de la bioconversion des margines moyennant une réaction

I-1 Introduction

L'hydroxytyrosol est le majeur composé phénolique naturel des margines (Bonnin et al., 2002). Il est inséré dans l'oleuropéine aglycone et il est obtenu par sa libération suite à une hydrolyse des ces glucosides durant le stockage et la presse des olives, due à l'action des estérases extracellulaires ou à une catalyse acide (Romero et al., 2002). De plus ce composé est libéré suite à l'hydrolyse de l'hydroxytyrosol 4-13-D-Glucoside suite à l'action de 13-glucosidase, dont les margines présentes une richesse considérable en ce composé (Romero et al., 2002). Depuis, l'hydrolyse enzymatique des margines par le jus de culture d'A. niger a été étudiée dont le but de l'enrichissement de ces margines en hydroxytyrosol. L'évaluation du procès enzymatique s'avère nécessaire pour la récupération du maximum d'un tel produit (Fig. 20).

Figure 20 : Proposition d'hydrolyse de quelques polyhénols des margines
par le jus de culture d'A. niger.

I-2 Hydrolyse enzymatique des margines par la culture d'A. niger

I-2-1 Effet du substrat sur la biotransformation en hydroxytytrosol

La première tentative de l'enrichissement de l'hydroxytyrosol récupéré à partir des margines a été portée sur l'extraction à l'acétate d'éthyle puis à l'exposition de l'extrait à une activité hydrolytique par les enzymes d'A. niger. Pour cette raison, la fraction organique récupérée par l'extraction à l'acétate d'éthyle est séchée par le rotavapor puis dissoute dans un

volume fixe d'eau distillée. La deuxième et la troisième alternatives s'intéressent à l'exposition des margines brutes et la fraction résiduelle (margines obtenus après une extraction à l'acétate d'éthyle) à une hydrolyse enzymatique par le jus de culture d'A. niger de 5 jours de culture qui est utilisé pour des réactions enzymatiques des trois échantillons préparés pendant deux heures. Ces réactions enzymatiques préliminaires sont réalisées par le contenu de culture toute entière (c'est-à-dire sans séparation de mycélium par filtration). Cette biocatalyse enzymatique a une activité â-glucosidase de 3000 UI/ml (Fig. 16b). La concentration en phénols totaux dans la fraction phénolique, la fraction résiduelle ou épuisée et les margines brutes sont de 1,2 ; 4,6 et 5,8 g/l, respectivement (Tableau 10). Après le traitement hydrolytique, ces concentrations croient à 1,5 ; 6,2 et 7,1g/l, respectivement (Tableau 10). La transformation en phénols totaux contenus dans les margines brutes et la fraction résiduelle est due à la mobilisation des composés aromatiques à partir des complexes phénoliques. Néanmoins, pour le cas de la fraction phénolique la légère augmentation des phénols totaux dans cette dernière est peut être due à l'addition de jus de fermentation qui est riche en composés phénoliques issu de l'hydrolyse du son de blé (Ishii, 1997 ; Williamson et al., 1998). Ce résultat indique que la fraction résiduelle libère une large quantité de phénols libres. Initialement, son contenu phénolique est de 4,6 g/l et croît après le traitement hydrolytique à 6,2 g/l, ceci indique la libération de phénols libres actifs par les enzymes fongiques. Cet enrichissement en contenu phénoliques peut améliorer l'activité antioxydante des margines particulièrement, si le phénol libéré est l'hydroxytyrosol.

Tableau 10: Le contenu en phénols totaux et la concentration d'hydroxytyrosol de la fraction organique, la fraction épuisée, les margines brutes (fraîches) et les margines acidifiées avant et après traitement hydrolytique par la culture entière d'A. niger.

	Phénols (g/l)		Hydroxytyrosol (g/l)
Traitement hydrolytique	Avant	Après	Avant	Après
Fraction phénolique	1,20#177;0,5	1,50#177;0,5	0,05#177;0,005	0,15#177;0,05
Fraction épuisée	4,60#177;0,7	6,20#177;0,8	0,02#177;0,005	0,75#177;0,15
Margines brutes fraîches	5,80#177;0,65	7,10#177;0,75	0,05#177;0,005	0,56#177;0,15
Margines acidifiés (pH 2)	6,40#177;0,85	-	0,18#177;0,06	-

I-2-2 Identification au CLHP des produits obtenus

Les analyses quantitatives et qualitatives des composés phénoliques durant les réactions de bioconversion sont contrôlées par CLHP. Pour les phénols récupérés, une procédure d'extraction liquide-liquide utilisant le solvant : acétate d'éthyle est appliquée aux échantillons. Il a été rapporté que l'acétate d'éthyle (AE) est le meilleur solvant convenant

pour une extraction des monomères phénoliques (Allouche et al., 2004 a). Pour l'évaluation de la réaction enzymatique avec les différents substrats, l'acétate d'éthyle (v/v) est sélectionné pour l'extraction des composés phénoliques simples à partir des échantillons. Les chromatogrammes de CLHP des margines brutes, la fraction organique et la fraction résiduelle avant et après l'hydrolyse sont montrés sur la Fig. 21. Le profile de CLHP des margines brutes fraîches montre que l'oleuropéine et l'hydroxytyrosol sont les majeurs composés et ils sont présents à 66,5% et 2%, respectivement. Le tyrosol est aussi détecté mais sa concentration est très faible, en comparaison avec les autres phénols. Les trois composés phénoliques présent dans les margines en forte concentration sont l'oleuropéine, l'hydroxytyrosol, et le tyrosol. Ces trois composés sont associés structurellement. En effet, l'hydroxytyrosol et le tyrosol ont des structures identiques à l'exception de l'hydroxytyrosol qui possède un groupement hydroxyle en position méta. L'oleuropéine est un ester qui consiste de l'hydroxytyrosol et l'acide élénolique. L'oleuropéine est le majeur composé phénolique dans le fruit d'olive, qui peut présenter jusqu'à 14 % de l'extrait sec du fruit, l'hydrxytyrosol est le majeur composé phénolique d'huile d'olive (Jemai et al., 2009). Pour les fruits d'olive mature, la concentration de l'oleuropéine décroît et celle de l'hydroxytyrosol, le produit d'hydrolyse de l'oleuropéine croît (Jemai et al., 2009). Par ailleurs, l'hydroxytyrosol a été synthétisé enzymatiquement utilisant une tyrosinase fongique (Espin et al., 2001). Cette procédure biologique est environnementale et elle est adaptée au procès industriel. La base de cette étude est que la large quantité de l'hydroxytyrosol et les phénols monomériques peuvent se trouver dans les margines après son traitement hydrolytique par un procès enzymatique convenable.

La comparaison des différents rendements de production de l'hydroxytyrosol en considérant les substrats utilisés est résumée dans le Tableau 10. Ce résultat et le profil de CLHP indiquent que la concentration de l'hydroxytyrosol augmente après le traitement hydrolytique de différents échantillons. Comme c'est indiqué dans les chromatogrammes de CLHP (Fig. 21), les margines hydrolysées montrent une concentration élevée en hydroxytyrosol (0,56 g/l) en la comparant avec le control (0,05) et les margines acidifiées (0,18). Aussi, ces profiles montrent l'augmentation des concentrations en tyrosol (Ty), l'acide p-coumarique (PC) et l'acide caféique (CA) après l'hydrolyse des margines brutes et de la fraction résiduelle. Concernant l'utilisation de la fraction phénolique comme substrat pour la biotransformation nous observons une mineure augmentation de la concentration d'hydroxytyrosol (0,15 g/l). En outre, les résultats présentés dans le Tableau 10 notent que la bioconversion enzymatique a augmenté la concentration en HT environ 37,5 et 11 fois, en présence de la fraction épuisée et

le margine brut respectivement. En utilisant la fraction épuisée comme substrat; 0,75 g/l d'hydroxytyrosol est produit, suggérant que l'hydrolyse enzymatique peut être une technologie très prometteuse qui peut être utilisée pour augmenter la concentration d'hydroxytyrosol de margine épuisé obtenu après une première série d'extraction par solvant de margine. L'utilisation de margine brut pour la biotransformation enzymatique pour libérer la concentration maximale d' hydroxytyrosol pourrait être aussi très rationaliste. Nos résultats confirment que la 3-glucosidase et l'estérase sont le principal facteur de libération de l'hydroxytyrosol à partir de l'oleuropéine tandis que d'un autre étude a démontré que la bioconversion enzymatique de ce composé en utilisant la 3-glucosidase recombinante et hyperthermophile de l'archaeon Sulfolobus solfactaricus exprimé dans Escherichia coli (Briante et al., 2000). Ici, il convient de noter qu'en vertu des conditions utilisées dans la biotransformation dans cette étude, l' hydroxytyrosol a été obtenue à partir de oléuropéine et d'autres molécules complexes présentes dans le margine, qui sont moins extractible par le solvant d'acétate d'éthyle. En fait, le margine contient généralement en plus de l'oleuropéine, d'autres molécules phénoliques glucosylés, comme le ligstroside et le démethyl-oleuropéine que, lorsque ils sont hydrolysées donnent naissance à des formes d'hydroxytyrosol et plusieurs acide élénolique (Mazzeia et al., 2009). L'amélioration de la bioconversion du substrat en hydroxytyrosol est probablement due à l'action de 3-glucosidase, estérase et d'autres enzymes.

Figure 21 : Les chromatogrammes de HPLC (UV 280 nm) de la fraction phénolique (extrait à l'AE) (a), fraction phénolique hydrolysée (b), fraction épuisée (c), fraction épuisée hydrolysée (d), margine brute fraîche hydrolysé (e) et acidifié (pH 2) OW (f). Tyrosol: Ty; Hydroxytyrosol: HT; Acide para-coumarique: PC; Acide caféique: CA; Oleuropein: OE.

I-2-3 Identification au CG-SM des produits obtenus

L'identification des différents phénols libérés suite au traitement enzymatique des margines est achevée par la technique de CG-SM et par la comparaison avec des composés phénoliques de références (Fig. 22). Les majeurs composés phénoliques identifiés sont : le tyrosol, HT, l'acide p-coumarique et l'acide caféique (Fig. 22). Les autres composés à savoir les acides gras ont été aussi détectés (Fig. 22).

Figure 22: Chromatogramme d'ion total gaz des produits extrait à l'acétate d'éthyle obtenu à partir des margines (a) et margine hydrolysé (b). Les composés identifiés par la masse tout en respectant leur temps de rétention sont les suivants : 15,69: tyrosol (1); 21,05: hydroxytyrosol (2); 25,16: acide para-coumarique (3); 27,59: acide palmitique (4); 29,9: acide caféique (5);

J-2-4 Effet de la nature de biocatalyseur, le temps de la réaction et le temps d'incubation de culture d'A. niger sur la biotransformation en hydroxytyrosol

Pour améliorer la production d'hydroxytyrosol, plusieurs facteurs efficients pourraient être étudiés, principalement la nature du biocatalyseur, le temps de la réaction de bioconversion et le temps d'incubation de culture d'A. niger. Les enzymes d'A. niger peuvent se présenter libres dans le surnageant de la culture ou fixé à la biomasse. Dans cette partie d'étude, nous avons cherché la caractérisation de l'emplacement d'enzymes actives : libre ou fixé à la biomasse qui est considéré comme le biocatalyseur pour la biotransformation. C'est pourquoi,

les réactions de bioconversion des margines par la biomasse (mycélium), le filtrat de culture (jus de culture) et la culture entière (mixte) ont été étudiées. La Fig. 23 illustre le temps de formation d'hydroxytyrosol pendant ces réactions. Le contrôle sans enzyme a été aussi exécuté et aucune production significative d'hydroxytyrosol n'a été observée (Fig. 23). La quantification d'hydroxytyrosol du contrôle a montré une concentration de 0.05 g/l qui correspond seulement à 6,25% de sa valeur finale dans les margines hydrolysées. Il devrait noter qu'en absence de jus de culture d'A. niger, le substrat n'a pas été converti en hydroxytyrososl même avec la condition à haute température (50 °C). La bioconversion des margines par le filtrat a été caractérisée par une production d'hydroxytyrosol rapide avec des concentrations plus élevé que ceux obtenus dans des expériences semblables en présence de la culture entière et la biomasse lavée. La quantité de l'hydroxytytrosol produit en présence de filtrat (0,80 g/l) augmente de 42,8 % comparé à la culture entière (0,56 g/l). Ici, nous pouvons expliquer cette différence par la dégradation de l'hydroxytyrosol par la biomasse. L'utilisation de biomasse, précédemment lavée par le tampon citrate pH 4,8 a abouti à moins de libération d'hydroxytyrososl (0,08 g/l) pendant les premiers temps de réaction. Cependant, la concentration en hydroxytyrosol a augmenté à 0.27 g/l après 6 h de réaction de bioconversion (Fig. 23). Cela peut être expliqué par le fait que le mycélium a continué sa production d'enzyme pendant l'incubation avec les margines. Dans ce cas nous avons noté qu'une augmentation d'activité 3-glucosidase dans le réacteur enzymatique de bioconversion (220 UI/ml).

Nous pouvons conclure que la concentration la plus haute d'hydroxytyrosol (0,8 g/l) a été obtenue en utilisant le filtrat d'enzyme produit par A. niger avec une activité 3-glucosidase de 3000 UI/ml après 2 h de réaction. Selon ces résultats, le jus enzymatique est le meilleur biocatalyseur pour la libération de l'hydroxytyrosol. Cette découverte indique que la 3 glucosidase est l'enzyme clé dans ce processus aussi la concentration 3-glucosidase est essentielle pour la bioconversion de polymères des margines pour évacuer l'hydroxytyrosol. La synthèse et la sécrétion de 3-glucosidase sont très importantes et la présence relativement des hauts niveaux d'activité 3-glucosidase avec l'estérase ensemble semble être essentielle pour une hydrolyse enzymatique efficace des margines.

Pour réaliser le rendement maximal en hydroxytyrosol, l'état de croissance de culture d'A. niger utilisée pour la conversion des margines a été aussi optimisé. Les fermentations en batch de son de blé avec l'A. niger ont été examinées dans des mêmes conditions contrôlées. Les filtrats de culture obtenus aux différents temps d'incubation ont été évalués pour la bioconversion des margines. Les résultats ont montré que, pendant les 5 premiers jours de

culture, la libération de l'hydroxytyrosol était synchrone avec l'activité â-glucosidase présente dans le jus de culture (les Figues 16 b et 24). Une association entre une activité élevée de â glucosidase (le jour 2-5) et une libération de l'hydroxytyrosol a été observée, confirmant de nouveau le rôle d'hydrolyse de cette enzyme. Néanmoins, à une activité enzymatique plus importante (4800 UT/ml) correspondant au jus de culture au huitième jour d'incubation, la concentration en hydroxytytrosol était uniquement de 0,5 g/l contre 0,8 g/l obtenu au cinquième jour d'incubation. En effet, la concentration en hydroxytyrosol a diminué lentement, qui pourrait être en raison du fait qu'il est dégradé par le mycélium ou les spores du champignon qui ont apparu au sixième jour.

Figure 23 : Evolution de la concentration de l'hydroxytyrosol dans les margines durant son hydrolyse par la culture entière, le filtrat et la biomasse de culture d'A. niger à 50 °C.

Figure 24 : La concentration d'hydroxytyrosol après la bioconversion des margines en utilisant le filtrat de culture du A. niger à différents temps d'incubation.

Ces résultats indiquent que la f3-glucosidase est l'enzyme clé dans ce processus; également la concentration de f3-glucosidase est essentielle pour la bioconversion des polymères de margines pour libérer l'hydroxytyrosol. Cela a été démontré par Capasso et al. (1997) qui ont étudié l'hydrolyse enzymatique de l'oleuropéine, extrait de la plante

d'olive, par la f3-glucosidase libre de l'amande. Cela doit également être pris en compte que la quantité d'hydroxytyrosol dans le margine ne vient pas seulement de l'hydrolyse de l'oleuropéine et le verbascoside mais aussi à partir de l'hydrolyse de l'hydroxytyrosol 4-f3-D-glucoside (Romero et al., 2002) où la f3-glucosidase est l'enzyme clé pour la libération

d'hydroxytyrosol. La présence de niveaux relativement élevés des activités f3-glucosidase et estérase semble être essentielle pour l'hydrolyse enzymatique efficace des margines. L'utilisation de préparation enzymatique d'A. niger obtenue après 5 jours d'incubation est un bio-catalyseur efficace pour la bioconversion de margine. Dans ces conditions de

biotransformation, de concentration élevée d'hydroxytyrosol (0,8 g/l) sont collectées par

une procédure très simple (enzymatique hydrolyse - extraction EA) qui peut s'avérer utile pour une nouvelle demande de recyclage de margine. La f3-glucosidase recombinante homogène hyperthermophile archaeon de S. solfactaricus, exprimé dans E. coli, a été immobilisée sur le support, le chitosane utilisé pour produire hydroxytyrosol à partir de l'oléuropéine de commerce (Briante et al., 2000). En outre, les propriétés antioxydantes du principale produits obtenus ont été purifiés et caractérisés (Briante et al., 2001) jusqu'à une production de hydroxytyrosol de 91-94% en poids a été atteint (Briante et al., 2004).

I-3 Activité antioxydante

Les composés phénoliques sont connus par l'exposition de radicaux libres qui aide à enlever les oxydations (l'activité d'antioxydant), qui est déterminée par leur réactivité comme des donneurs d'hydrogène ou d'électrons et leur stabilité de la résultante en antioxydants radicalaire dérivé, leur réactivité avec d'autres antioxydants et leurs propriétés de chélation des métaux (De Leonardis et al., 2007). Dans la présente étude, l'activité antioxydante d'extraits des margines brutes (frais), margines hydrolysées, la fraction épuisée, la fraction épuisée hydrolysée, l'hydroxytyrosol purifiée et BHT a été mesurée par la méthode de l'effet antiradicalaire DPPH de piégeage de radicaux libre et l'IC50 est présenté dans le Tableau 11. La méthode DPPH estime la capacité de l'extrait pour étouffer le radical libre DPPH. Tous les extraits ont montré le potentiel d'antioxydant dans l'essai du radical DPPH (Tableau 11).

Tableau 11: Détermination de l'activité antioxydante (IC50) des margines brutes (fraîches), margine hydrolysée, fraction épuisée, fraction épuisée hydrolysée, BHT et hydroxytyrosol

Le BHT a montré une forte activité antioxydante avec une valeur d'IC50 de 29 ug/ml. L'activité antioxydante des margines brute (fraîche) était naturellement très faible (IC50=650 ug/ml) en comparaison de l'activité de BHT. Cependant, cette activité a augmenté après l'hydrolyse enzymatique avec une valeur d'IC50 de 75,2 ug/ml (Tableau 11). Ces activités antioxydantes des extraits phénoliques dépendent des caractéristiques qualitatives du profil phénolique et non pas du contenu phénolique total (Ziogas et al., 2010 ; Randhir et Shetty, 2007). La valeur de l'IC50 de l'extrait des margines hydrolysées prouve que cet extrait contient des composés de haute activité d'antioxydant comme l'hydroxytyrosol (IC50=23 ug/ml). Le tableau 11 montre aussi l'activité antioxydante de l'extrait de la fraction épuisée et la fraction épuisée hydrolysée. De ces résultats nous avons noté une activité antioxydante très faible de l'extrait de la fraction épuisée (IC50 = 805 ug/ml) cela signifie que les composés phénoliques ayant la convenance de la forte activité antioxydante ont été extraits pendant la première étape d'extraction à l'acétate d'éthyle. L'hydrolyse de cette fraction épuisée utilisant la préparation d'enzyme d'A. niger, nous a permis d'enregistrer une haute activité antioxydante (IC50 = 20 ug/ml) qui est plus élevée que l'activité antioxydante des margines hydrolysées, BHT et hydroxytyrosol pur. Cela pourrait être expliqué par la réaction de synergie entre l'hydroxytyrosol et d'autres composés phénoliques simples qui peuvent aussi être évacué pendant l'hydrolyse enzymatique tels que l'acide caféique et l'acide p-coumarique (Fig. 21d). On le connaît de la littérature que parmi des composés phénoliques des margines, l'hydroxytyrosol et l'acide caféique montrent de fortes propriétés antioxydantes mais dans tous les cas le tyrosol et l'acide férulique sont considérés comme des neutraceuticallement positif (Litridou et al.; 1997).

D'antérieurs résultats ont montré que les phénols d'olive récupéré par l'extraction à l'acétate d'éthyle des margines sont de bons antioxydants pour le saindoux (De Leonardis et al., 2007). D'autres études ont montré que les polyphénols des margines ont un effet d'antioxydant sur des cellules épithéliales humaines intestinales (Manna et al. , 1997 a) et une action cytostatique sur quelques cellules tumorale (Owen et al. , 2000). Fki et al. (2005) ont montré que l'extrait des margines peut être utilisé comme des antioxydants naturels alternatifs pour stabiliser des huiles comestibles, en apaisant en même temps une préoccupation majeure de consommateurs sur l'utilisation d'antioxydants synthétiques dans les produits alimentaires.

I-4 Conclusion

Nous annonçons un traitement enzymatique très simple et rapide des margines fraîches tout en obtenant des quantités importantes en hydroxytyrosol. Les traitements d'hydrolyse d'une fraction phénolique, la fraction épuisée et les margines brutes (fraîches) ont été examinés utilisant le jus de fermentation d'A. niger sur le son de blé. Quelques facteurs d'exploitation de cette bioconversion ont été aussi ajustés. Cette étude indique que la réaction d'hydrolyse des margines brutes (fraîches) pendant 2 h par un filtrat obtenu d'un bouillon de culture d'A. niger après 5 jours d'incubation, permet de libérer l'hydroxytyrosol à une concentration de 0,8 g/l de margine. Ce processus produit un produit naturel et bioactif d'une source végétale, par opposition à la molécule obtenue par synthèse chimique. Le projet de prétraitement enzymatique peut s'avérer utile non seulement pour les applications de laboratoire, mais aussi

II. Les enzymes fongiques : un outil puissant pour enrichir les margines en antioxydants

II-1 Introduction

Les champignons sont des microorganismes bien connus pour la vaste gamme d'enzymes qu'ils produisent et qui ils sont utilisés dans beaucoup de processus industriels. L'importance d'enzymes microbiennes dans les applications de biotechnologie a grandi significativement dans les deux dernières décennies et actuellement dans la bioconversion de sous-produits industriels. La présente étude a été entreprise pour évaluer la possibilité d'appliquer des milieux de culture (sans aucune étape de purification) de trois souches : A. niger (CTM 10099), T. atroviride (CTM 10476) et T. trogii (CTM 10156) sur les margines dans le but d'augmenter la concentration de composés d'antioxydant comme l'hydroxytyrosol.

II-2 Production d'enzymes

A. niger CTM 10099, T. atroviride CTM 10476 et T. trogii CTM 10156 ont été cultivé dans des cultures liquides pendant 10 jours, utilisant le sous-produit agricole disponible, le son de blé, comme la source de carbone unique. La production de B-glucosidase par les champignons mésophiles A. niger cultivé sur le son de blé a été améliorée par l'optimisation de la composition moyenne et des conditions de fermentation (résultats motionnés dans le chapitre I). Les mêmes conditions de culture optimisées ont été utilisées pour les fermentations de T. atroviride et T. trogii. Pour la caractérisation du profil d'enzyme des trois préparations seulement les activités 3-glucosidase, estérase et laccase ont été analysées. Les résultats obtenus sont regroupés sur la Fig. 25 et tableau 12. Cette illustration montre les profils de production typiques de 3-glucosidase, estérase et laccase pendant la fermentation de son de blé par le A. Niger, T. atroviride et T. trogii.

Tableau 12: Maximum des activités 3-glucosidase, estérase et laccase (UI/ml) enregistré dans le jus de culture des trois souches durant la fermentation sur le son de blé et la concentration de l'hydroxytyrosol (g/l) obtenue après le traitement enzymatique des margines par ces trois préparation enzymatiques (Valeur moyenne #177; écart type (n = 3)).

	â-glucosidase	Estérase	Laccase	Hydroxytyrosol
*Aspergillus niger*	8380#177;150	130#177;20	0#177;0,0	1,1#177;0.2
*Trichoderma atroviride*	365#177;50	218#177;20	840#177;50	0,5#177;0,2
*Tramates trogii*	29#177;10	230#177;20	2246#177;50	0,2#177;0,1
â-glucosidase purifiée	3533#177;150	0#177;0,0	0#177;0,0	1,15#177;0,2
Margines brutes	80#177;10	nd	nd	0,049#177;,02

Ces résultats montrent que les trois souches produisent différentes quantités de 3-glucosidase (tableau 12). A. niger et T. atroviride avait une plus forte activité 3-glucosidase que le T. trogii et vice versa pour l'activité laccase (Fig.25). La comparaison de production de 3-glucosidase a révélé qu'A. niger a produit la plus haute activité par rapport à T. atroviride et T. trogii. Dans cette étude, nous avons noté qu'A. niger a produit environ 10 fois plus de 3-glucosidase que T. atroviride. La Fig. 25 a et le tableau 12 illustrent que la culture d'A. niger sur le son de blé n'a pas produit une activité laccase significative. D'une façon intéressante, l'activité estérase a été détectée dans les trois préparations de jus de culture au même ordre de production. Après 10 jours de culture, les plus fortes activités 3-glucosidase (6380 UI/ml) et laccase (2246 UI/L) ont été obtenues dans les jus de culture d'A. niger et T. trogii, respectivement (Fig. 25a et 25c). Cependant, T. atroviride a produit les trois enzymes aux

niveaux modérés (Fig. 25b). Cette souche, isolée à partir de saule préalablement traité, s'est également montré éfficace pour produire des cellulases et des â-glucosidases sur ce matériel (Kovács et al., 2008).

Selon l'étude de Bonnin et al., 2002, les enzymes qui dégradent la paroi cellulaire et les polysaccharides, y compris la cinnamoyl estérase produite par A. niger cultivé sur la pulpe de betterave à sucre, a de haut intérêt pour la libération de l'acide férulique à partir du sous-produits agroindustriels, comme la pulpe de betterave à sucre ou le son de maïs. Sur la lumière de cette étude, les enzymes présents dans le jus de culture d'A. niger, T. atroviride et T. trogii pourrait exercer un effet semblable sur les structures moléculaires des margines qui présentent des glucosides et des liaisons ester entre les poly-phénols et les polysaccharides et/ou lignine (Walter et al., 1973). C'est pourquoi, nous avons évalué l'effet de filtrats des jus fongiques sur l'hydrolyse de macromolécules des margines pour évacuer des composés phénoliques libres ayant de forte activité antioxydante.

Figure 25: Evolution des activités â-glucosidase (BG), estérase et laccase dans le jus de culture de A. niger (a), T. atroviride (b) et T. trogii (c) durant 10 jours de fermentation sur le son de blé.

II-3 Hydrolyse enzymatique des composés phénoliques des margines

L'utilisation des préparations enzymatiques commerciaux dans le processus d'extraction d'huile d'olive pour augmenter la concentration de composés phénoliques dans la pâte et l'huile pendant les étapes de malaxation a été approuvée par Garcia et al., 2001. De plus plusieurs recherches identifient les margines comme une source potentielle du récupération de composés phénoliques (Allouche et al., 2004; Aldini et al., 2006). Dans notre étude, l'acétate d'éthyle a été utilisé pour extraire des composés phénoliques des margines. Les analyses quantitatives et qualitatives de ces composés phénoliques ont été effectuées moyennant la chromatographie liquide haute pression : CLHP. La Fig. 26a illustre les chromatogrammes de CLHP de l'extrait à l'acétate d'éthyle des margines brutes et fraîches (le contrôle). Ce profil montre que les margines fraîches sont riches en oleuropéine (le pic 3) et un autre composé de verbascoside non identifié (le pic 4). Des composés bio-actives phénoliques simples comme HT (le pic 1) et tyrosol (le pic 2) sont aussi présents à de faibles concentrations. La concentration de l'hydroxytyrosol est de 0,049 g/l. Ce contenu correspond à la fraction libre en hydroxytyrosol dans les margines brutes fraîches. Cependant, les margines sont une source hydrolysable de phénols comme l'oleuropéine, les ligstrosides ou les verbascosides (Bianco et Uccella, 2000), dans lesquelles les principaux composants phénoliques sont des glycosides et des esters. Par conséquent, de grandes quantités de constituants phénoliques seraient libérées quand l'hydrolyse chimique ou enzymatique est survenue dans les margines, particulièrement les orthodiphénoliques comme l'hydroxytyrosol qui est reconnu par ces propriétés antioxydantes. L'analyse enzymatique montre que les margines brutes contiennent une activité â-glucosidase de 80 UI/ml (Tableau 10). Cette enzyme peut provenir du fruit : l'olive (Jemai et al., 2009) et aussi des activités des microorganismes (Ciafardini et Zullo, 2000). Cette concentration d'enzyme (aussi bien que d'autres enzymes hydrolytiques) n'est pas suffisante pour l'hydrolyse des conjugués cités et c'est pourquoi la concentration de l'hydrytyrosol augmente avec le temps de stockage des margines, suite à la fermentation spontanée et l'enrichissement de ces effluents en hydroxytyrosol (Fki et al., 2005). Ici, nous suggérons d'augmenter la concentration de ce composé bioactif par un traitement enzymatique tout en utilisant le jus de culture des champignons comme un processus d'intensification.

Figure 26 : Chromatogramme HPLC des composés phénoliques de la fraction d'acétate d'éthyle (détection à X = 280 nm) extraits de margines fraîches et brutes (a) et margines après son hydrolyse par B-glucosidase purifiée (b) et par les préparations enzymiques collectés suite à la fermentation du son de blé par le A. niger au dixième jours (c), T. atroviride au quatrième jour (d) et dixième jour (e) et T. trogii dixième jour (f) de culture. 1 : hydroxytyrosol; 2 : tyrosol; 3 : oleuropéine; 4 : composé non identifié.

Des jus d'enzymes fongiques obtenus par les cultures de A. niger, T. atroviride et T. trogii cultivé sur le son de blé ont été annoncés précédemment (Chapitre II : II-2) pour leur richesse d'enzymes spécifiques. Pour étudier l'effet de chaque préparation enzymatique à la libération de composés phénoliques simples des margines, les filtrats de jus de culture des

trois champignons ont été testés pour l'hydrolyse des margines pendant 2.0 h à 50 °C. Les jus de culture de ces champignons seront choisis en termes de leur spécificité en enzymes pour la transformation en composés orthodiphénoliques les substrats conjugués des margines. La Fig. 27 donne l'évolution de la concentration en hydroxytyrosol hydrolysée dans les margines par les jus extracellulaires fongiques récupérés à différent temps d'incubation des cultures. Comme c'est indiqué de cette figure, les quantités significatives en hydroxytyrosol ont été libérées après les différentes hydrolyses enzymatiques des margines.

Figure 27 : Evolution de la concentration de l'hydroxytyrosol dans la fraction phénolique récupérer à partir des margines après son hydrolyse par les jus extracellulaires collecté durant la fermentation sur son de blé par les trois souches.

L'étude quantitative des extraits de margines suite à son hydrolyse permet de présenter les chromatogrammes de HPLC résumé sur la Fig. 26. D'après cette figure on note une augmentation de l'intensité du pic de l'hydroxytyrosol (1) avec une diminution concomitante du sommet de l'oleuropéine (3) pendant la réaction de bioconversion des margines par les trois types de préparation d'enzyme. L'identification de l'hydroxytyrosol a été aussi confirmée par l'analyse LC-MS (chromatographie liquide couplée à la masse spectrale) (Fig.28). Les concentrations les plus élevées en hydroxytyrosol ont été obtenues en présence de jus de culture d'A. niger. La concentration en ce composé dans les margines a augmenté avec l'âge du jus de culture du A. niger qui pourrait être en corrélation avec la concentration des enzymes extracellulaires hydrolytiques comme l'activité B-glucosidase dans le jus de culture. La bonne corrélation entre la haute activité â-glucosidase et la libération de l'hydroxytyrosol dans les margines pourrait être observée (Fig. 25 et 27) pour les trois souches. Ces résultats peuvent confirmer que la â-glucosidase joue un rôle biochimique

significatif dans l'hydrolyse catalysant des liaisons glycosidiques dans les oligo et les polysaccharides présents dans les margines. L'activité estérase mesurée dans les trois jus de cultures a montré des activités qui varient entre 100-200 UI/ml (Fig. 25). Cette enzyme permet l'hydrolyse de la liaison ester entre les composés phénoliques et les polysaccharides. L'oleuropéine est un ester héterosidique de l'acide élenolique et l'hydroxytyrosol B-glucosylée. Ainsi, l'hydroxytyrosol peut être provenu de l'oleuropéine, via l'aglycone, par la libération de l'acide elénolique avec un réarrangement final dans le composé de secoiridoides (Walter et al., 1973). Ce résultat est en accord avec des études précédentes de Capasso et al., 1999 ; Briante et al., 2002.

		^{125 150}		¹⁷⁵	²⁰⁰	²²⁵	²⁵⁰	^{275 300 m/z}
^x106	^3.							^{-MS2(152.9), Line, 2.3-2.4min (#82-#86), 100%=1017523}
^1.0			^123.0					b
^0.8
^0.6
^Intens. ^0.4
^0.2
	^109.0
^0.0

Figure 28: Spectre de masse du l'ion total du pic chromatographique du temps de rétention
2,2 min dans les margines hydrolysées: (a) MS et (b) MS².

La concentration maximale de l'hydroxytyrosol enregistré par l'analyse CLHP était de 1,1 ; 0,5 et 0,2 g/l respectivement en présence des jus de culture d'A. niger du jour 10 (6380,95 UI/ml d'activité â-glucosidase), T. atroviride du jour 4 (365 UI/ml d'activité â-glucosidase) et T. trogii du jour 2 (29,05 UI/ml d'activité â-glucosidase). Ces concentrations sont 21,63 ; 10,2 et le 4,08 fois plus élevé que le contrôle (Tableau 12) si l'on utilise les jus de culture d' A. niger, T. atroviride et T. trogii respectivement. On a également observé une

augmentation de tyrosol dans le cas du T. atroviride (de 0.05 g/l à 0.17g/l) (Fig. 26e). Ce résultat montre que les enzymes de T. artroviride sont également actives sur des polymères contenant le tyrosol en tant qu'antité phénolique tel que le ligostroside. Cependant, l'utilisation du jus de culture de T. artroviride qui a montré des activités modérées de 3-glucosidase et de laccase a eu comme conséquence la diminution de la concentration de HT des margines (de 0.5 à 0.03) à la fin de la fermentation (Fig. 25e). Cette dégradation est expliquée par l'oxydation de HT par la laccase qui est très sensible aux agents oxydants que le tyrosol (Chakroun et al., 2010). L'utilisation de jus de culture de T. trogii qui a montré de forte activité laccase a abouti à la diminution de la concentration des composés phénoliques totales (Fig. 25c et 26f). Ces résultats montrent que la laccase est efficace pour la transformation ou l'oxydation de composés phénoliques simples et complexes et peut être considéré comme un outil efficace pour la désintoxication de déchets phénoliques comme les margines. La transformation oxydative de mélanges phénoliques naturels et synthétiques par la laccase de Trametes versicolor a été aussi examiné par Canfora et al., 2008.

De la présente partie d'étude, nous pouvons conclure que la margine est une source des phénols hydrolysables tels que l'oleuropéine, le ligstroside ou le verbascoside, qui présentent des liens glucosidiques et ester entre les principaux composants de phénol et les polysaccharides et/ou la lignine (Bianco, et Uccella, 2000 ; Walter, et al., 1973). En conséquence, une quantité plus élevée de HT est libérée quand l'hydrolyse enzymatique est produite dans la margine en employant la préparation enzymatique spécifique.

Des expériences de bioconversion en employant la 3-glucosidase purifiée par d'A. niger (EC 2328898),l'estérase purifiée et le viscozyme ont été conduits aux mêmes conditions opérationnels. Ces préparations enzymatiques ont été ajoutées aux margines à des proportions donnant une concentration en 3-glucosidase et éstérase de 1500 UI/ml au milieu réactionnel. L'utilisation de la 3-glucosidase pure d'A. niger (CE 2328898) UI/ml a abouti à l'obtention de 1,15 g/l d'hydroxytyrosol. Cette valeur est largement proche à celle obtenue en utilisant le jus de culture d'A. niger brute obtenue sans aucune étape de purification (Fig. 29). Cependant, l'augmentation du contenu en orthodiphénol utilisant la 3-glucosidase d'A. niger pure pendant la biotransfomation des margines peut rappeler beaucoup d'études qui ont utilisé cette enzyme pour l'hydrolyse de l'oleuropéine pure (Ciafardini et Zullo, 2000), ou les extraits de feuille d'Olea europaea (Briante, et al., 2002) ou dans des olives vertes (Walter et al., 1973). En revanche, l'estérase pure seule n'a aucun effet sur la bioconversion et la modification des composés phénoliques des margines.

La figure 29 montre également l'effet du viscozyme sur la libération de HT dans les margine. Cette dernière montre que le viscozyme est le meilleur biocatalyseur utulisé, il a augmenté la concentration d'HT de 0,05 (contrôle) à 1,15 g/l. Ceci peut être expliqué par la composition multienzymatique de cette préparation enzymatique commerciale, qui contient des cellulases, des arabinases, des hémicellulases, des gluconases et des xylanases, capable d'agir sur un grand nombre de composants, agit fondamentalement sur les substrats solubles et insolubles (Duenas et al., 2007), et ceci cause des modifications de plusieurs composés phénoliques et peut libérer des composés phénoliques plus simples. Ces résultats ont indiqué que la préparation enzymatique d'A. niger a le même effet que le viscozyme et la 3-glucosidase purifiée pour la libération d'HT. Alors que l'estérase n'a pas d'effet sur la bioconversion. Par conséquent, A. niger, généralement identifié comme le micro-organisme `'generally recognised as a safe (GRAS)», est un excellent producteur de la 3-glucosidase, qui est l'enzyme hydrolytique principale pour le monomerisation des polyphénols des margines. Par conséquent, la préparation enzymatique d'A. niger est la meilleure alternative pour augmenter le contenu de HT dans les margines par l'intermédiaire de la propre réaction de la bioconversion. De plus, la préparation enzymatique d'A. niger est exempt de laccase qui est une enzyme oxydante pour les composés phénoliques. Une concentration élevée de HT 1,1 g/l a été obtenue après 2 heures de réaction enzymatique des margines en présence de préparation enzymatique d'A. niger à 50 °C, et à pH 4,8 et en état statique. La concentration obtenue de HT par cette méthode de bioconversion peut être améliorée par l'optimisation d'autres paramètres : concentration en enzymes, état d'agitation, temps de réaction... etc.

Figure 29: Concentration maximale de l'hydroxytyrosol libéré à partir de margines traités par
la 3-glucosidase pure d'A. niger, viscozyme, la préparation enzymatique d'A. niger, estérase
pure et le contrôle.

Selon les travaux précédents (Espin et al., 2001 ; Bouallagui et Sayadi 2006 ; Capasso et al., 1999 ; Briante et al., 2002), des procédures de synthèse pour la production d'HT sont

chers et/ou ont des rendements bas en produit. Pour l'application à grande échelle du bio-processus proposé, 1 m³ de margine a eu comme conséquence la production de 1,1 kilogramme de HT. Le calcul du coût préliminaire d'hydrolyse des margines par la préparation enzymatique d'A. niger donne une valeur très intéressante des 1181,5 DT/m³. Par conséquent, ce bio-processus a pu ouvrir une nouvelle méthodologie possible pour récupérer un rendement élevé d'HT à bas pris.

II-4 Effet antiradicalaire DPPH de l'extrait des margines

L'effet antiradicalaire DPPH des extraits des margines brutes et hydrolysées à l'acétate d'éthyle, BHT, Hydroxytyrosol pur et l'oleuropéine pure est représentée dans le Tableau 13.

Tableau 13 : Effets antiradicalaires des composés phénoliques (Valeur moyenne #177; écart type (n = 3)).

Parmi les composés présents dans les margines, il a été trouvé que les composantes ortho-dihydroxylés aromatiques présentent une plus grande activité antiradicalaire sur le radical libre de DPPH, en particulier l'hydroxytyrosol et 3,4 - dihydroxyphényl acide acétique (Fki et al., 2005). Comme le montre le tableau 5, l'hydroxytyrosol est un antioxydant puissant et son activité (IC50 = 22 ug/ml) est le plus élevé que celui d'un antioxydant commercial : BHT, (IC50 = 28 ug/ml). En particulier, les activités antioxydantes des extraits des margines brutes et hydrolysées ont été inférieur à celui du BHT (tableau 13). L'effet antiradicalaire de l'extrait des margines brutes (IC50 = 501 ug/ml) est partiellement liée à sa teneur en acide caféique, le 3,4-dihydroxyphényl acide acétique et en particulier à l'oleuropéine. L'extrait à l'acétate d'éthyle des margines hydrolysées présentait une plus grande activité antiradicalaire (IC50 = 45 ug/ml) par rapport à l'extrait à l'acétate d'éthyle des margines brutes et de l'oleuropéine (Tbleau 13). Ces résultats ont démontré que l'hydrolyse enzymatique des margines par la préparation d'enzyme d'A. niger conduit à une augmentation de l'activité antioxydante. Cela est dû à la conversion de l'oleuropéine et d'autres composés verbascosides en hydroxytyrosol qui s'avère un antioxydant exceptionnel ayant une forte capacité d'élimination et d'absorption radicalaire. Les résultats dans le tableau 13 ont prouvé que

l'activité antioxydante de hydroxytyrosol et l'extrait d'acétate d'éthyle ont été plus élevée que celle de l'oleuropéine (IC50 = 173 ug/ml). L'hydroxytyrosol se produisant après ce type de bioconversion puisse être considéré comme un composé ayant des propriétés antioxydantes élevées (Tableau 13). On l'a démontré dans cette étude et beaucoup d'autres que l'activité antioxydante de l'hydroxytyrosol était plus haute que celle de l'oleuropéine (Soni et al., 2006). Fki, Allouche, et Sayadi (2005) ont prouvé que la margine pourrait être une source naturelle de substances utiles, notamment HT, qui ont une action puissante sur le piégeage des radicaux superoxydes.

II-5 Conclusion

Les présents résultats ont montré que A. niger, T. trogii et T. atroviride croissent sur un milieu de culture économique (le son de blé comme l'unique source de carbone) tout en produisant une préparation d'enzyme extracellulaire ayant des activités estérase, 13-glucosidase et laccase. Évalués sur les margines brutes (fraîches) ayant de très basse charge de monomères phénoliques comme l'hydroxytyrsol, ces jus de culture ont pu convertir des phénols hydrolysables comme l'oleuropéine, ligstroside ou verbascoside en monomères comme l'hydroxytyrosol. Les meilleurs résultats ont été atteints en utilisant le jus de culture d'A. niger présentant une forte activité 13-glucosidase (faible activité estérase et aucune laccase) où 1,1 g/l d'hydroxytyrosol a été libéré de margines fraîches ne contenant que 0,05 g/l d'hydroxytyrosol naturellement libres. Ainsi, la réaction de bioconversion proposée dans cette étude, permettant la récupération de l'hydroxytyrosol naturel, offre une alternative à la méthode d'extraction conventionnelle et la fermentation microbienne. Cette méthode est environnemental, amical qui permet également d'améliorer le rendement d'extraction et de la qualité des extraits. La grande efficacité de l'hydroxytyrosol comme un antioxydant puissant a été confirmée par la méthode antiradicalaire DPPH. Cela permet des perspectives encourageantes en matière de commercialisation de l'hydroxytyrosol comme un puissant antioxydant naturel.

III- Optimisation du procès de la bioconversion des composés phénoliques des margines III-1 Introduction

L'hydroxytyrosol est l'un des majeurs composés phénoliques dans le fruit d'olive et il a été prouvé pour être le plus avantageux à son effet pharmacologique remarquable et des activités d'antioxydant (Fabiani et al., 2002 ; Visioli et al., 2004). Actuellement, beaucoup

d'études sur la biodisponibilité et le métabolisme dans l'homme sont conduites pour établir ses effets avantageux de santé (Miró-Casas et al., 2003 ; Visioli et al., 2005). Parce que l'hydroxytyrosol fait comme d'habitude une partie d'autres molécules comme l'oleuropein, le démethyloleuropein, le verbascoside et l'hydroxytyrosol glucosides (Amiot et al., 1989 & 1986 ; Romero et al. , 2002 ; Jemai et al. , 2009 ; Ziogas et al., 2010). La gestion, le traitement et la disposition sûre des margines imposent des préoccupations environnementales sérieuses. Le concept principal de la méthodologie en ceci proposée est que les polyphénols contenus dans les margines pourrait être sélectivement hydrolysés par des enzymes se permettant de libérer des composés utiles pour l'industrie pharmaceutique et cosmétique d'une part et la production d'eaux usées sans polyphénols ayant une DCO significativement réduite d'autre part. L'hydroxytyrosol a été choisi comme un modèle pour les études de la biotransformation. Dans cette étude, nous suggérons la biotransformation des margines par l'utilisation de la préparation enzymatique obtenue suite à la fermentation du son de blé par A. niger. L'analyse des activités enzymatiques de jus de culture d'A. niger a montré une forte activité 3-glucosidase (plus de 4500 IU/ml) et une activité estérase modérée (200 IU/ml). Les différents paramètres de la réaction d'hydrolyse enzymatique proposée ont été étudiés et optimisés pour maximiser la libération de l'hydroxytyrosol. Cette partie de recherche vise à trouver la méthodologie à hydrolyser les margines par une préparation enzymatique pour obtenir le maximum de rendement en hydroxytyrosol. Les variables opérationnelles principales dirigeant le processus d'hydrolyse enzymatique (la température, le temps, le pH, l'agitation) ont été étudiées. La proportion entre l'enzyme et le substrat a aussi été évaluée. La réaction enzymatique proposée a été appliquée à deux sortes différentes de margine; le premier est produit par un processus d'extraction discontinu traditionnel (MSP : Margine Super Presse) et le deuxième est produit par une centrifugation continue suit l'utilisation d'un système à trois phases (MCC : Margine Chaîne Continue).

III-2 Effet de la température sur la réaction de bioconversion et sur l'activité â- glucosidase

Les différents essais d'activité 3-glucosidase et des réactions de bioconversion des margines ont été effectués dans des lots séparés contrôlés aux différentes conditions de température. On montre l'effet de ce paramètre sur l'activité 3-glucosidase et sur la production de l'hydroxytyrosol par l'hydrolyse enzymatique des margines par la préparation d'enzyme enrichie en 3-glucosidase dans la Fig. 30. La température de réaction varie de 25 à 100 °C. Les contrôles ont été également réalisés par addition de l'eau au lieu de la préparation enzymatique. La Fig. 30 montre que la température n'a pas d'effet sur la libération

d'hydroxytyrosol. Toutefois, l'ajout de la préparation enzymatique montre une augmentation de la concentration de l'hydroxytyrosol en toute la gamme de température. Les résultats montrent que l'activité 3-glucosidase a augmenté progressivement avec l'augmentation de la température de 25 à 50 °C. Cependant, l'activité 3-glucosidase était significativement plus importante dans des températures s'étendant entre 50 et 70 °C que cela aux limites de 25 à 40 °C. Comme c'est montré dans la Fig. 30, la préparation d'enzyme brute a montré que l'activité catalytique est plus élevée à 50 °C. Elle a été complètement inactivée à une incubation de température de 100 °C (Fig. 30).

Figure 30: Effet de la température sur l'activité 3-glucosidase et la production de l'hydroxytyrosol. Les barres d'erreur indiquent l'écart type (n = 2).

La température optimale de notre enzyme est semblable à la majorité de 3-glucosidases bactériennes et fongiques annoncée précédent (Gueguen et al., 1994 ; Wei et al. , 1996 ; Sharmila et al. , 1998 ; Saha & Bothast., 1996 ; Yan et al., 1998), et bien sure inférieure que certaines 3-glucosidases thermostables (Hang & Woodams, 1994 ; Saha et al., 1994). Cependant, la tolérance de chaleur de notre 3-glucosidase est plus haute que les expériences de 3-glucosidases les plus annoncées (Barbagallo, 2004).

III-3 Effet du pH sur la réaction de bioconversion et sur l'activité â- glucosidase

Le pH optimum pour l'activité 3-glucosidase a été déterminé sur une gamme de pH allant de 2 à 8. La même étude a été exploitée pour la bioconversion des composés phénoliques des margines, en présence de la préparation enzymatique enrichie en 3-glucosidase. Les contrôles ont été également réalisés par addition d'eau au lieu de préparation enzymatique. Les effets du pH sur l'activité 3-glucosidase et sur le rendement de

bioconversion ont été représentés dans la Fig. 31. La Fig. 31 montre que le pH n'a pas d'effet sur la libération d'hydroxytyrosol. Toutefois, l'ajout de la préparation enzymatique montre une augmentation de la concentration de l'hydroxytyrosol dans toute la gamme de pH. Les résultats indiquent que la 3-glucosidase a montré une activité maximale à pH 4,8. Il a été totalement inactif à un pH au-dessus de 6 et moins de 3. L'activité 3-glucosidase a été comparativement plus élevée dans la gamme acide que dans le domaine alcalin. Remarquablement, la 3-glucosidase d'A. Niger a montré un pH optimal relativement élevé que la plupart des 3-glucosidases d'autres champignons et de bactéries (Zheng & Shetty, 2000). Ce pH optimum de réaction de bioconversion de 4,8 coïncide très bien avec le pH naturel des margines qui varie entre 4,6 et 5.

Figure 31 : Effet du pH sur l'activité 3-glucosidase de jus de culture d'A. niger et sur la production de l'hydroxytyrosol. Les barres d'erreur indiquent l'écart type (n = 2).

L'effet du pH démontre aussi une corrélation positive entre la libération de l'hydroxytyrosol et l'activité 3-glucosidase. La réaction de bioconversion à pH 4,8 donne la plus forte concentration d'hydroxytyrosol (1,54 g/l), qui est le résultat de la plus haute activité 3-glucosidase enregistrée dans ces expériences.

III-4 Effet du type de margine sur la libération de l'hydroxytyrosol

Le processus de fabrication d'huile d'olive a connu des changements évolutifs. Le processus traditionnel discontinus a été remplacé par le processus de centrifugation en continu en utilisant un système à trois phases. Dans cette étude, les margines générées par le premier et le second processus est appelé «Margine Super Presse» (MSP) et «Margine Chaine Continue» (MCC), respectivement. Une étude comparative de la bioconversion des composés

phénoliques de ces deux types de margines par la même préparation enzyme a été opéré dans des batch en erlenmeyrs. Ces deux types de margines proveniennent à partir de la même variété d'olive (Chemlali) et au même jour. Le tableau 14 résume la concentration en composés phénoliques simples totaux et la concentration de l'hydroxytyrosol avant et après la biotransformation des composés phénoliques de ces deux types de margines.

Tableau 14: Le contenu en phénols simples et la concentration en hydroxytyrosol avant et après l'hydrolyse enzymatique de MCC et MSP. (Valeur moyenne #177; écart type (n = 3))

La concentration initiale de l'hydroxytyrosol était très faible dans le MCC (0,015 g/l) et le MSP (0,018 g/l) (Tableau 14). Après la biotransformation, la concentration des composés phénoliques simples totaux a fortement augmenté, en raison du clivage des saccharides polyphénoliques par la préparation enzymatique d'A. Niger (Tableau 14). Pour les deux types de margines, les analyses CLHP montrent que le principal composé phénolique simple et majeur était l'hydroxytyrosol (Fig. 32).

Figure 32: chromatogrammes CLHP à 280 nm des extraits de margine avant (a) et après l'hydrolyse enzymatique (b): (1) Hydroxytyrosol; (2) Tyrosol; (3) Oleuropéine.

La concentration de cet antioxydant atteint une valeur de 0,89 et 1,52 g/l respectivement en MSP et le MCC. Cela montre que la libération de l'hydroxytyrosol dépend du type des margines. Bien sûr, cela pourrait être attribuée à des différences à la technique de

traitement; bien que nous pensons que cela pourrait également être dû à la quantité d'eau ajoutée lors de l'extraction d'huile d'olive. L'étude comparative de la bioconversion des composés phénoliques de ces deux types de margines démontre que le MCC a plus de potentiel de biotransformation que MSP (Tableau 14). Cela pourrait être dû au fait que les phénols les plus hydrolysables comme l'oleuropéine, le ligstroside ou le verbascoside sont présents, et donc plus d'hydroxytyrosol est libéré (Bianco & Uccella, 2000). Pour cette raison, nous avons choisi l'utilisation du MCC pour le reste du travail.

III-5 Relation entre la production de l'hydroxytyrosol et la concentration de Ji-glucosidase

Dans cette partie, nous avons étudié l'effet de la concentration de l'enzyme sur la bioconversion des composés phénoliques des margines. Ici, le volume de margines a été fixé et nous avons fait varier la quantité en enzyme. Pour ces expériences, la préparation enzymatique possède une activité 3-glucosidase de 4600 UI/ml. Les réactions de bioconversion ont été menées à pH 4,8 et à température de 50 °C, qui ont été déterminés comme des conditions optimales pour la 3-glucosidase d'A. Niger (Fig. 30 et 31). Les concentrations de l'enzyme ont été variées de 0 à 1125 IU/ml de milieu réactionnel. La relation entre la production de l'hydroxytyrosol et la concentration de l'enzyme a également été examinée. Les résultats sont représentés dans la Fig. 33. Comme le montre cette figure, la concentration de l'hydroxytyrosol a considérablement augmenté au cours des différentes expériences.

Figure 33 : Effet de la concentration de 3-glucosidase sur la production de l'hydroxytyrosol. Les barres d'erreur indiquent l'écart type (n = 2).

Néanmoins, le contrôle (sans addition d'enzyme) n'a pas montré d'augmentation de la concentration en hydroxytyrosol au cours du temps d'incubation. Cela démontre que le jus de culture d'A. Niger montre une haute activité hydrolytique sur les polymères présents dans les margines. En fait, ce processus semble être très intéressant parce que l'enrichissement des margines en hydroxytyrosol est possible grâce à une réaction enzymatique simple (pas de réglage du pH, aucun produit chimique ajouté, etc.). L'augmentation de la production de l'hydroxytyrosol est proportionnelle à l'activité de l'enzyme dans le milieu réactionnel. Les résultats montrent que tout en augmentant la concentration de l'enzyme dans le milieu réactionnel, la concentration en hydroxytyrosol augmente. Ces résultats montrent que la 13-glucosidase est l'enzyme clé dans ce processus; aussi une forte concentration de 13-glucosidase est essentiel pour la bioconversion des polymères de margines et la libération de l'hydroxytyrosol. Cela a été démontré par Capasso et al. (1996) qui ont étudié l'hydrolyse enzymatique de l'oleuropéine, extrait de la plante d'olive, par la 13-glucosidase libre d'amande. Il devrait également être pris en compte que la quantité de l'hydroxytyrosol dans la margine vient non seulement de l'hydrolyse de l'oleuropéine et la verbascoside mais aussi de l'hydrolyse de l'hydroxytyrosol 4-13-D-glucoside (Romero et al., 2002 ; Feki et al., 2006, Fki et al., 2005) où la 13-glucosidase est l'enzyme clé pour la libération de l'hydroxytyrosol.

Le rendement le plus élevé en hydroxytyrosol (1,5 g/l) a été observé à une concentration de l'enzyme de 1125 UI/ml de milieu réactionnel (Fig. 33). Nous avons noté qu'il ya une augmentation de la concentration de l'hydroxytyrosol environ 0,4 g/l en doublant la concentration de l'enzyme de 571 à 1125 UI/ml. Le système idéal consisterait à la vitesse de réaction la plus rapide que possible par l'équilibre de la quantité de 13-glucosidase utilisée. Afin d'économiser la quantité d'enzymes, nous suggérons l'utilisation de 500 UI/ml comme la concentration optimale qui génère la libération suffisante de l'hydroxytyrosol.

En fait, le pré-traitement enzymatique des margines qui semblait être un processus très prometteur car l'enrichement des margines en hydroxytyrosol est possible grâce à une réaction enzymatique unique sans ajustement du pH et ajout de produits chimiques. L'hydroxytyrosol hydrolysé à partir des margines peut être récupéré par une ultrafiltration ou par une simple extraction liquide-liquide. Le procédé d'ultrafiltration directe conduirait à un concentré contenant des composés phénoliques cibles. Alternativement, le procédé d'extraction par solvant de la margine hydrolysée abouti à un extrait contenant les composés cibles et une fraction épuisée représentant la phase aqueuse de la margine. Cette fraction reste à son pH initial, est libre de polyphénols et a une Demande Chimique en Oxygène

considérablement réduit en comparaison de margines initiales. Ces caractéristiques rendent les eaux usées hydrolysées très facile à traiter par des procédés biologiques.

III-6 Effet de l'agitation sur la réaction de bioconversion

Dans cette partie, l'effet de l'agitation sur le taux de libération de l'hydroxytyrosol a été étudié. La cinétique d'hydrolyse des margines par la préparation enzymatique enrichi en â-glucosidase a été évalué par la détermination de la concentration de l'hydroxytyrosol. Les évolutions de l'accumulation d'hydroxytyrosol lors de la réaction de bioconversion du MCC ont été illustrées dans la Fig. 34. La bioconversion a été effectuée dans les conditions optimales déterminées précédemment. La concentration optimale en â-glucosidase de 500 UI/ml a été utilisée dans le milieu réactionnel.

Figure 34: Cinétique de production de l'hydroxytyrosol durant l'hydrolyse enzymatique de
MCC dans des conditions statiques et agités. Les barres d'erreur indiquent l'écart type (n = 2).

Les résultats montrent que la production de l'hydroxytyrosol est rapide et excellent pour les margines hydrolysées dans un état d'agitation. Les concentrations maximales d'hydroxytyrosol de 2,9 g/l et 1,5 g/l ont été respectivement obtenues après 30 min d'agitation et après 5 h en condition statique (Fig. 34). Ici, nous notons que l'agitation permet d'accélérer et d'améliorer l'hydrolyse enzymatique des margines. Ce résultat pourrait s'expliquer par la saturation des sites catalytiques actifs de la â-glucosidase d'A. Niger dans un état statique. Sur la base de ces résultats, nous concluons que l'agitation est un paramètre important pour optimiser l'hydrolyse enzymatique des margines. Cependant, les résultats montrent que l'état statique fait la plus grande stabilité d'hydroxytyrosol dans le milieu réactionnel. En fait, la molécule d'hydroxytyrosol est très sensible à l'oxydation essentiellement dans un état agité. Gómez-Alonso et al. (2007) ont démontré que la majorité des composés phénoliques d'olive en particulier l'hydroxytyrosol ne sont pas très stables même dans des conditions de stockage doux. En effet, dans des études précédentes, la stabilisation des résidus d'huile d'olive avec

l'éthanol a été trouvé pour être une étape essentielle pour empêcher les réactions oxydatives enzymatiques et non enzymatiques responsables de la dégradation des composés phénoliques et/ou de leurs polymérisation (Lesage-Meessen et al., 2001 ; Feki et al., 2006). En conséquence de ce travail, la destruction de l'hydroxytyrosol est survenue après quelques heures de la réaction par son oxydation avec l'oxygène moléculaire (Fig. 29) et son exposition à la lumière, qui s'est intensifiée dans un état d'agitation. Cela a été démontré par deux expériences d'hydrolyse enzymatique. La première a été réalisée en présence d'oxygène atmosphérique et le second a été contrôlé dans la présence d'azote. La deuxième expérience a montré la production de l'hydroxytyrosol maximale et une plus grande stabilité en comparaison avec le premier (Fig. 35). Par ailleurs, l'hydrolyse enzymatique de la margine dans un état agité a montré la stabilité seulement pour les 30 premières minutes de la concentration d'hydroxytyrosol au cours des 6 heures de réaction et ensuite a diminué progressivement avec le temps. Pour cette raison, 30 min de réaction enzymatique est suffisant pour libérer la forte concentration de l'hydroxytyrosol du MCC (2,9 g/l).

Figure 35: Effet de l'oxygène moléculaire sur la stabilité de l'hydroxytyrosol.

En comparaison avec la méthode de stockage à long terme qui a été publié par Feki et al., 2006, la méthode suggérée enzymatique est très prometteuse. Après 5 mois de stockage, une accumulation importante de hydroxytyrosol a été observée. La concentration correspondante a augmenté dans les margines par un facteur de 3,5 (Feki et al., 2006). En effet, la méthode de stockage à long terme est très simple mais nécessite des coûts de gestion élevés. Il nécessite un espace énorme pour plusieurs mois et produit des boues et de mauvaise odeur.

III-7 Conclusion

Dans la présente recherche, nous avons étudié les effets de (i) les conditions physico-chimiques (pH, température, temps et agitation), (ii) le type de margine comme substrat et (iii) la concentration d'enzyme sur la réaction de bioconversion des margines. Cette réaction a consisté en une hydrolyse enzymatique des composés phénoliques des margines par le jus de

culture d'A. niger riche en 3-glucosidase qui est produite par la fermentation d'A. niger sur un substrat bon marché: le son de blé.

Une forte concentration d'hydroxytyrosol (2,9 g/l) a été obtenu après 30 min de réaction enzymatique de margine à 50 °C, à pH 4,8 et en état agité. Cette concentration n'est pas rapporté avant et c'est une des plus fortes concentrations d'hydroxytyrosol rapporté après conversion chimique ou biologique des margines.

Le projet de prétraitement enzymatique des margines a permis la récupération de l'hydroxytyrosol naturel sans produits ni méthodes chimiques, de solvants de qualité alimentaire, ce qui fait de ce procédé économiquement faisable. Le calcul préliminaire du coût du processus a donné une valeur très intéressante de 1181 DT/m³de margines (dinars tunisien par mètre cube de margine). Ce bio-processus va certainement ouvrir de nouveaux horizons dans le marketing de l'hydroxytyrosol comme un puissant antioxydant naturel.

IV-Essai d'immobilisation de la Ji-glucosidase sur l'alginate de calcium

IV-1 Introduction

L'immobilisation de 3-glucosidase dans un support solide offre la perspective de réductions des coûts et élargit la flexibilité de conception du processus, en permettant l'opération continue et simplifiant en aval le traitement. Dans le présent travail, un essai d'immobilisation de 3 -glucosidase par encapsulation dans l'alginate de calcium a été examiné comme une approche pour l'immobilisation

IV-2 Effet de la concentration en alginate de calcium sur l'activité â-glucosidase

Différentes concentrations en alginate de calcium ont été préparées et utilisées pour l'encapsulation de l'enzyme du jus de culture d'A. niger fermentée sur le son de blé. La Fig. 36 montre l'activité 3-glucosidase de deux billes en fonction des diverses concentrations en alginate de calcium. Cette activité a persisté pour la plupart des concentrations d'alginate de calcium, cependant la Fig. 36 indique clairement que la meilleure concentration d'alginate de calcium est de 2 %. A cette concentration l'activité 3-glucosidase de deux billes est de 200 UT/ml. En revanche pour un pourcentage de 8% l'activité enzymatique chute de 48%. Ces résultats semblent être en accord avec ceux obtenus par Goksungur et Guvenc (1999) où la concentration optimale en alginate de calcium est de 2%.

Figure 36 : Effet de la concentration en alginate de sodium sur l'activité â-glucosidase

Une concentration de 1% en alginate de calcium a comme conséquence des billes très molles et peuvent être plus facilement cassées en raison de leur basse force mécanique, ayant pour résultat la fuite des enzymes des billes (Idris et Suzana, 2006). Tandis que l'augmentation de l'alginate de calcium à une concentration supérieure à 2% durcit les billes, de ce fait des problèmes de diffusion peuvent se produire et l'accès de l'enzyme à son substrat sera plus difficile.

V- Caractérisation des propriétés de l'enzyme immobilisée

V-1 Introduction

En général l'immobilisation des enzymes leur confère les caractéristiques suivantes:

? élargissement du domaine d'utilisation vis à vis des conditions de température et de

V-2 Effet de la température et le pH sur l'enzyme immobilisé

L'immobilisation permet d'améliorer la résistance de l'enzyme aux conditions qui lui sont normalement néfastes. Nous avons donc testé les effets de la température et du pH sur l'activité immobilisée dans les mêmes conditions que l'enzyme native. Une étude comparative de l'effet de la variation de la température sur l'enzyme libre et immobilisée a été effectuée. La température a été variée de 30 °C à 60 °C. Les résultats relatifs à cette étude sont illustrés sur la Fig. 37 a. La même comparaison des deux formes d'enzyme a été effectuée en raisonnant sur le pH. La gamme de pH varie de 2 à 10. Les résultats relatifs à cette étude sont

illustrés sur la Fig. 37 b. Sur la Fig. 37, nous observons qu'une fois immobilisée elle présente une activité sur une gamme de température et de pH plus importante.

Figure 37: Comparaison de l'effet de la température et du pH entre â-glucosidase libre et
immobilisée sur l'alginate de calcium. a : Température. b : pH.

Dans le cas de la température, l'activité subit une perte d'activité de l'ordre de 30% à 60 °C (Fig. 37 a) alors que pour le pH la perte d'activité est observée à un pH 5,5 et 10 (Fig. 37 b) pour l'enzyme libre. En revanche, suite à son encapsulation dans des billes d'alginate de calcium, l'enzyme immobilisée permet d'améliorer l'activité enzymatique à 60 °C de 23% et au pH 6 de 50%. Seulement la chute d'activité de l'enzyme libre était légèrement plus prononcée aux acidités élevées, une caractéristique a été aussi observé par Nagatomo et al., (2005). Ceci peut être provisoirement attribué au rôle protecteur du microenvironnement entourant le biocatalyseur. De plus ; des modèles grossièrement semblables ont été obtenu, où le profil du pH optimum n'est pas significativement changé avec l'immobilisation. Ceci a été annoncés précédemment par Nagatomo et al., (2005). D'autre part, un changement de l'optimum pH de 5 à 4 a été observé comme le résultat d'immobilisation dans l'alginate. Chang et Juang (2007) ont aussi annoncé un changement vers un environnement plus acide suite à l'immobilisation de â-glucosidase dans des supports de chitosan-argile.

L'enzyme immobilisée est montrée efficace jusqu'à 55°C, sans fuite d'enzyme observée, mais au-dessus de cette température, la fonte du support a été observée. Ce comportement postérieur a été aussi annoncé (Rebro et al., 2007) et empêché la nouvelle évaluation de ce support aux températures plus hautes, à savoir, jusqu'à 65°C. Au-dessus de cette température, il y a une chute aiguë d'activité de l'enzyme libre. En revanche, Chang & Juang (2007) ont annoncé une gamme de tolérance plus haute à la chaleur de â-glucosidase immobilisée sur des composés d'argile quand comparés à l'enzyme libre. Les températures optimales d'enzymes libres et immobilisées étaient de 50 °C. Martino et al., (1996) et Synowiecki et Wolosowska (2006) ont aussi annoncé une tolérance accrue vers la chaleur suite à l'immobilisation bien que sans changements dans la température optimale.

VI- Evaluation de la bioconversion par l'enzyme libre et immobilisée

La recherche de l'efficacité de la bioconversion des composés phénoliques des margines par l'enzyme immobilisée par rapport à celle libre a été l'objectif de cette partie d'étude. En effet, suite à son encapsulation dans des billes d'alginate de calcium, une quantité de billes immobilisant de l'enzyme équivalentes à 500 UI/ml de milieu réactionnel (donnée démontrée dans le chapitre II-III) a été testé via sa capacité de bioconversion des composés phénoliques des margines. Un control sans enzyme et un autre avec l'enzyme libre ont été également effectués. La réaction a été déroulée à pH 4,8 durant 2h dans des conditions statiques à 50 C. Les résultats obtenus sont représentés sur les Fig. 38 et 39.

Figure 38: Chromatogrammes CLHP à 280 nm des extraits de margine avant (a) et après l'hydrolyse enzymatique Libre (b) et Immobilisée (c) : (1) Hydroxytyrosol; (2) Tyrosol; (3) Oleuropéine.

Les chromatogrammes CLHP à 280 nm des extraits de margine ont démontré que la margine brute est pauvre en hydroxytyrosol (pic 1) dont sa concentration de départ était de 0,065 g/l et riche en composés phénoliques complexes tel que l'oleuropéine (pic 3). Un changement du profil chromatographique des extraits de margine a été observé suite à la bioconversion par les deux formes d'enzyme avec un taux de bioconversion plus faible observé avec l'enzyme immobilisée qui diminue de 50%. Cette chute de l'activité enzymatique peut être dûe au fait de possibles gênes stériques et de limitations dans l'accessibilité au site actif (Fig. 38; Fig. 39)

Figure 39:Comparaison de la bioconversion par l'enzyme libre et immobilisée. IV- Conclusion

L'encapsulation de l'enzyme dans des billes d'alginate de calcium a été utilisée comme la méthode d'immobilisation envisagée dans cette étude. L'enzyme immobilisée est montrée efficace jusqu'à 55 °C, sans fuite d'enzyme observée, mais au-dessus de cette température, la fonte du support a été observée. Ces résultats ont montré des modèles grossièrement semblables ont été obtenu, où le profil du pH et de température optimum n'est pas significativement changé avec l'immobilisation. Un changement du profil chromatographique des extraits de margine a été observé suite à la bioconversion des composés phénoliques des

margines par les deux formes d'enzyme avec un taux de bioconversion plus faible observé avec l'enzyme immobilisée qui diminue de 50%.

Chapitre III:

II-1 Bioconversion de margine issue d'huilerie super press

Afin d'évaluer l'efficacité de l'enzyme conservée sur la bioconversion des margines, un test en batch de 50 ml de margine MSP a été effectué dans les conditions optimisées. La réaction a été menée 2 heures à 50 °C sous agitation douce en présence de 500 UI de â-glucosidase par millilitre de margine. Les chromatogrammes de CLHP des extraits de margine avant et après biotransfromation sont présentés sur la Fig. 40.

Figure 40: Bioconversion des margines MSP par l'enzyme stockée : (a) avant bioconversion, (b) après bioconversion par l'enzyme lyophylisée.

D'après ces résultats on remarque que le taux de l'hydroxytyrosol a passé de 0,46 g/l à 1,1 g/l. Le rendement de l'amélioration de la concentration de l'hydroxytyrosol est de 2,4 fois pour ce type de margine. Ceci démontre la fiabilité de ce système de bioconversion avec l'enzyme fournit par le fermenteur et conservée sous forme lyophylisée.

II-2 Bioconversion de margine issue de huilerie chaine continue

Afin d'évaluer l'efficacité de l'enzyme conservée sur la bioconversion des margines, un test en batch de 50 ml de margine MCC a été également effectué dans les mêmes

conditions optimisées. Les chromatogrammes de CLHP des extraits de margine avant et après biotransfromation sont présentés sur la Fig. 41.

					a
										b

Figure 41: Bioconversion des margines MCC par l'enzyme stockée : (a) avant bioconversion, (b) après bioconversion par l'enzyme lyophylisée.

D'après ces résultats on remarque que le taux de l'hydroxytyrosol a passé de 0,23 g/l à 0,67 g/l. Le rendement de l'amélioration de la concentration de l'hydroxytyrosol est de 2,91 fois pour ce type de margine. Ceci démontre la fiabilité de ce système de bioconversion avec l'enzyme fourni par le fermenteur et conservé sous forme lyophylisée.

En conclusion, l'enzyme conservée s'est montrée efficace pour la bioconversion des composés phénoliques des deux types de margine tout en libérant l'hydoxytyrosol sous forme simple qui a été complexé dans l'oleuropéine et/ou l'hydroxytyrosol glycoside pour augmenter sa concentration dans les margines MSP et MCC de 2,4 et de 2,91 fois respectivement.

III- Essai de bioconversion des margines à l'échelle pilote

II-1 Introduction

A l'heure actuelle, et malgré des besoins industriels importants, en particulier cosmétiques et agro-alimentaires, il n'existe pas de procédé permettant la production d'hydroxytyrosol à l'échelle industrielle. Seuls des procédés de synthèse à petite échelle ont été décrits ; cependant ces procédés ne sont pas économiquement viables car ils conduisent à des coûts de production trop élevés.

La seule source naturelle d'hydroxytyrosol reste pour le moment l'olive et les sous- produits de l'huile d'olive (Bezançon et al, 2000). L'huile d'olive ne contient qu'une faible quantité d'hydroxytyrosol, les teneurs allant de 0,01 à 1 mg/100 g d'huile. Ceci s'explique par la grande solubilité de l'hydroxytyrosol dans l'eau (environ 5 g/100 ml) ; en conséquence, il se retrouve fortement présent dans les margines, et qui sont dans la majorité des cas rejetées dans la nature. Une première voie de production d'hydroxytyrosol s'appuie sur sa purification à partir des margines. La majorité de ce type de procédés mène souvent à l'obtention d'un produit impur étant donné la grande diversité et l'importante quantité de polyphénols répertoriés dans les margines (2,5-3% en poids, environ une centaine de composés différents ; Labat et al., 2000). De plus, l'obtention d'une fraction purifiée contenant l'hydroxytyrosol à partir de ces déchets implique plusieurs étapes chromatographiques utilisant de grandes quantités de solvants (Capasso et al., 1992, 1994 et 1999; Visioli et al, 1998). Par conséquent, depuis plusieurs années les études se sont multipliées pour tenter de trouver un procédé moins coûteux de purification d'hydroxytyrosol, ces tentatives se sont révélées dans l'ensemble sans grand succès. D'autres voies de production basées sur des méthodes chimiques incluent la synthèse d'hydroxytyrosol par réduction chimique de l'acide 3,4-dihydroxyphénylacétique (Bai et al, 1998; Tuck et al, 2000), et par conversion catalytique du tyrosol en hydroxytyrosol par un mélange de méthylrhénium trioxide (MTO) et de peroxyde d'hydrogène. Deux voies de production enzymatique d'hydroxytyrosol ont également été décrites :

- une production d'hydroxytyrosol par hydrolyse d'oleuropéine en présence de 13-glucosidase (Briante et al. 2001). La 13-glucosidase utilisée dans le procédé de Briante et al. est produite par une souche d'Escherichia coli recombinante, cette 13-glucosidase provient de l'archée Sulfolobus solfataricus qui est une bactérie hyperthermophile. Ce procédé présente plusieurs inconvénients : d'une part, l'enzyme et l'oleuropéine doivent être préalablement purifiées à partir de la culture bactérienne et à partir de feuilles d'oliviers respectivement, et d'autre part, l'extrait final est constitué d'un mélange d'hydroxytyrosol et de deux formes de l'acide élénolique ;

- une synthèse enzymatique par conversion du tyrosol en présence d'une tyrosinase extraite d'un champignon (Espin et al., 2001). Cette seconde méthode enzymatique présente également des limites : d'une part, le procédé nécessite la purification préalable de la tyrosinase avec plusieurs étapes qui font encore augmenter les coûts de production ; d'autre part, le procédé nécessite la présence d'acide ascorbique pour inhiber l'activité crésolase (l'oxydation, en présence de dioxygène, d'un monophénol en catéchol) de la tyrosinase et ainsi éviter la formation de quinones ; une étape de purification finale supplémentaire doit donc être mise en oeuvre pour éliminer l'acide ascorbique du mélange réactionnel.

Un autre type de production a été réalisé à partir de cellules entières cultivées sur le tyrosol. Les bactéries productrices sont Serratia marscecens (Allouche et Sayadi, 2005), Pseudomonas aeruginosa (Allouche et al, 2004 ; Bouallagui et Sayadi, 2006), Pseudomonas putida F6 (Brooks et al, 2006) et Halomonas sp. HTB24 (Liebgott et al, 2007). Le système enzymatique responsable de la bioconversion du tyrosol en hydroxytyrosol n'a jamais été identifié chez les différentes espèces bactériennes précitées. Ces procédés microbiologiques présentent également des limites :

-P. aeruginosa est une bactérie pathogène de classe 2, ce qui entraîne une grande réticence à l'utilisation de l'hydroxytyrosol qu'elle produit ;

-pour toutes ces souches, la production d'hydroxytyrosol reste faible. En effet, on constate une dégradation de l'hydroxytyrosol en 3,4-dihydroxyphénylacétate (3,4-DHPA), ce dernier se dégradant par la suite en succinate et pyruvate.

En résumé, l'extraction à partir de matières premières naturelles donne de faibles quantités d'hydroxytyrosol, elle présente le risque de contamination par les solvants d'extraction et aboutit, du fait d'un nombre d'étapes trop important, à un prix de revient trop élevé. La synthèse chimique, quant à elle, est assez limitée ; elle utilise des substrats ou des catalyseurs toxiques et difficiles à obtenir. Enfin, pour le moment, les procédés microbiologiques décrits utilisent, pour certains, des bactéries pathogènes avec les inconvénients que l'on connaît et présentent un rendement trop faible pour être économiquement intéressants.

Dans le cadre de ces travaux, on a maintenant mis en évidence que l'enzyme impliquée dans la bioconversion des composés phénoliques des margines est une protéine à activité 13-glucosidase. Ainsi, les objets de la présente invention se rapportent à (i) l'utilisation d'une 13-glucosidase d'A. niger produite suite à la fermentation de cette souche sur le son de blé dans le fermenteur de 100 litres (Biotron) pour catalyser la bioconversion des composés phénoliques des margines en hydroxytyrosol, (ii) un procédé de production d'hydroxytyrosol in vitro comprenant au moins une étape de conversion des composés phénoliques complexes en hydroxytyrosol.

II-2 Bioconversion des margines issue de huilerie moderne chaine continue à l'échelle

Le réacteur « biolafit » 20 litres a été utilisé pour la bioconversion des composés phénoliques de 15 litres de margine MCC. La réaction a été menée 2 heures à 50 °C sous

agitation douce en présence de 500 UI de â-glucosidase par millilitre de margine. Un contrôle sans enzyme a été également effectué afin d'évaluer l'effet des enzymes endogènes de la margine durant les 2 heures de la bioconversion. La cinétique de production de l'hydroxytyrosol ainsi que l'activité â-glucosidase résiduelle dans le mélange réactionnel ont été déterminées et présentées sur la Fig. 42.

Figure 42 : Cinétique de production de l'hydroxytyrosol dans les margines MCC (a), Activité â-glucosidase résiduelle dans le mélange réactionnel et les margines brûtes (b).

D'après la Fig. 42 on remarque que l'ajout de l'enzyme améliore la concentration de l'hydroxytyrosol dans les margines MCC avec un rendement de 2,7 fois. L'enrichissement se déroule d'une façon progressive pour passer de 0,17 g/l dans les margines brûtes à 0,31 après 60 minutes d'incubation en présence d'enzyme. Alors que après 120 minutes de réaction enzymatique cette concentration s'éleve pour atteindre 0,46 g/l (Fig 42 a). Néomoins, pour le contôle, on observe uniquement une

légére élevation de la concentration de l'hydroxytyrosol dans les margines pour passer de 0,17 g/l à 0,2 g/l après 2 heures d'incubation en présence de l'eau à la place de l'enzyme et dans les mêmes conditions opératoires. Cette faible augmentation est dûe à la présence d'une faible activité â-glucosidase dans les margines brûtes de 14,76 UI/ml. L'évaluation de l'activité â-glucosidase résiduelle dans le mélange réactionnel a démontré que cette activité est présente et presque constante est de l'ordre de 200 UI/ml durant toutes les 2 heures de réaction (Fig. 42 b).

II-3 Bioconversion des margines issue de huilerie classique super press à l'échelle pilote

Le réacteur «biolafit» 20 litres a été également utilisé pour la bioconversion des composés phénoliques de 15 litres de margine MSP. La réaction a été menée 2 heures à 50 °C sous agitation douce en présence de 500 UI de â-glucosidase par millilitre de margine. La cinétique de production de l'hydroxytyrosol dans le mélange réactionnel a été déterminée et présentée sur la Fig. 43.

Figure 43 : Cinétique de production de l'hydroxytyrosol dans les margines MSP à grande

Le rendement de la bioconversion des composés phénoliques des margines MSP à grande échelle est de 3,6 fois. Le contrôle comporte 0,23 g/l d'hydroxytyrosol, alors que l'ajout de l'enzyme engendre la libération immédiate de ce composé, en effet la concentration de ce composé passe de 0,23 g/l à 0,60 g/l immédiatement après ajout de l'enzyme dés le temps zéro. Néamoins cette concentration se soulève à 0,81 g/l après 30 minutes de réaction enzymatique pour se stabiliser à cette concentration jusqu'à 180 minutes à 50 °C (Fig. 43).

En conclusion, le rendement de la bioconversion des composés phénoliques des margines MCC est de 2,7 et inférieur à celui des margines MSP qui est de 3,6 fois. Cela peut être dû à la concentration initiale des ploymères phénoliques.

IV-Essai de la bioconversion des composés phénoliques des margines à grande échelle

Un bac de 50 litres a été utilisé pour la bioconversion des composés phénoliques de 40 litres de margine apportées à partir d'une huilerie de Nord de la Tunisie. La réaction a été menée 2 heures à 50 °C sous homogéneisation douce en présence de 500 UT de 3-glucosidase par millilitre de margine. La cinétique de production de l'hydroxytyrosol ainsi que l'activité 3-glucosidase résiduelle dans le mélange réactionnel ont été déterminées et présentées sur la Fig. 44.

Figure 44 : Cinétique de production de l'hydroxytyrosol dans les margines de Nord (a),
Activité 3-glucosidase résiduelle dans le mélange réactionnel et les margines brûtes (b).

D'après la Fig. 44 on remarque que l'ajout de l'enzyme améliore la concentration de l'hydroxytyrosol dans les margines de Nord avec un rendement de 1,9 fois.

L'enrichissement se déroule d'une façon progressive pour passer de 0,8 g/l dans les margines brûtes à 1,2 g/l après 60 minutes d'incubation en présence d'enzyme. Alors qu'après 120 minutes de réaction enzymatique cette concentration s'éleve pour atteindre 1,53 g/l (Fig 44 a). L'évaluation de l'activité â-glucosidase résiduelle dans le

mélange réactionnel a démontré que cette activité est présente et presque constante est de l'ordre de 200 UI/ml durant toutes les 2 heures de réaction (Fig. 44 b).

En conclusion, au cours des expériences enzymatiques, les concentrations de l'hydroxytyrosol maximales égales à 1,53, 0,83 et 0,46 g/l ont été obtenues en présence de 500 UT de â-glucosidase d'A. niger par millilitre de margines dans les margines de Nord, MSP et MCC respectivement. Ces concentrations sont 2,70 ; 3,61 et 1,77 fois plus élevées que le contrôle (Fig 42, 43, 44). Ces rapports de grandes échelles obtenus sont inférieurs à ceux trouvés avec la petite échelle du travail de Hamza et al., (2012 b). Cela est dû à la concentration initiale de l'hydroxytyrosol dans les gros volumes de margines frais est beaucoup plus élevé que dans de petits volumes de margines frais qui sont obtenus à partir du séparateur dans le moulin à huile. Cependant, dans la pratique pour le scale up, les grands volumes de margines sont pris à partir de réservoirs de stockage, où la biotransformation a déjà commencé. C'est ce qui explique la forte concentration initiale de l'hydroxytyrosol dans les 15 L de MCC (0,17 g / L), les 15 L de MSP (0,23 g / L) et les 40 L de margine de North (0,86 g / L) frais (Fig. 45). De cette partie de l'étude, nous pouvons conclure que les margines sont une source de phénols hydrolysables tels que l'oléuropéine, le ligstroside ou les verbascosides, qui possèdent des liens glucosidiques et ester entre les principaux composants phénoliques et des polysaccharides et/ou de lignine (Bianco & Uccella 2000 , Walter, Fleming et Etchells, 1973). En conséquence, une quantité importante de l'hydroxytyrosol est libérée lors de l'hydrolyse enzymatique. En fait, le projet de prétraitement enzymatique s'avérer utile non seulement pour les applications de laboratoire, mais aussi pour une application pilote ou industrielle pour recyclage de margine.

Figure 45 : Les chromatogrammes de CLHP des composés phénoliques (détection à X = 280 nm) de l'extrait brut MCC (a), et hydrolysé MCC par la b-glucosidase d'A. niger (b), de l'extrait brut MSP (c), hydrolysat de MSP par la b-glucosidase d'A. niger (d), de l'extrait brut de margine de Nord Tunisie (e) et hydrolysée de margine nord de la Tunisie par b-glucosidase d'A. niger (f). 1, hydroxytyrosol, 2, tyrosol, 3, composé non identifié, 4, oléuropéine.

V- Etude de la stabilité de l'hydroxytyrosol produit

Récemment les sous-produits de l'olivier ont suscité beaucoup d'intérêt en tant que sources d'ingrédients fonctionnels dans les formulations de produits alimentaires. Cependant, avant d'être incorporés dans les aliments ou les boissons, la stabilité de ces constituants dans les matrices alimentaires pendant le traitement et durant le stockage doivent être considérés. Les consommateurs s'attendent à ce que la qualité des aliments doit être maintenue à un niveau élevé de la production à la consommation (Kilcast & Subramaniam, 2003). Plusieurs facteurs peuvent affecter la stabilité des constituants bioactifs d'un produit alimentaire pendant et après le traitement, y compris le brunissement enzymatique, le pH et la température. Par conséquent, avant d'incorporer l'extrait de margine dans la boisson, il est important d'étudier aussi bien l'effet des conditions de stockage et de traitement sur ses composés phénoliques. L'étude de la stabilité de l'hydroxytyrsol dans sa solution aqueuse de margine a été entreprise est ce durant 4 mois. La quantité résiduelle de l'hydroxytyrsol en g/l a été déterminée par CLHP est présentée sur la Fig 46.

D'après cette étude, on remarque qu'après une semaine de la réaction il ya une amèlioration de la concentration de l'hydroxytyrsol (de 0,58 g/l après 2h de réaction à 0,95g/l après 1 semaine de stockage) dans les margines MCC cela est peut être dûe à l'hydrolyse totale de tous les polyphénols complexes contenant de l'hydroxytyrsol. Ainsi la concentration de ce dernier termine à s'intensifier pour atteindre 1,083 et 1,7 g/l pour les types de margine MCC et M Nord respectivement, après un mois de stockage. Toutefois, pour le troisième type de margine MSP, on remqraue une diminution progressive de ce composé durant les quatres mois de stockage. Cela peut être expliqué par l'apparition d'un champignon qui a envahit tout le milieu et a utilisé les composés phénoliques comme source d'energie pour sa croissance, une

dégradation biologique de l'hydroxytyrsosol a été peut être observée à 4°C. La concentration de l'hydroxytyrosol dans le margine MSP est devenue 0,45 g/l elle a abouti persque la moitié de la concentration. Alors que pour les deux autres types MCC et M Nord, la chutte de la concentration n'est observée qu'à partir du quatrième

mois. On peut conclure que l'hydroxytyrosol ne dois pas être conservé à +4°C tel quel est dans les margines hydrolysées durant quelques mois, mais de préférence une extraction immédiate de ce composé par des techniques membranaires utilisant une cascade de celle-ci (microfiltration, ultrafiltration) afin d'obtenir des extraits enrichies

en hydroxytyrosol aptes à être utilisé dans une concentration par évaporation pour l'élimination de l'eau et la bonne conservation de l'hydroxytyrsol.

La stabilité de l'hydroxytyrsol dans des solutions aqueueses a été l'objectif du travail de l'équipe Zafra-Gómez et al., 2011. Ils ont montré que la présence de sels dans l'eau et la température produit l'oxydation du composé et la perte de l'activité biologique. Par conséquent, les résultats sont d'une grande importance pour les études animales futures avec ce composé, pour prédire la stabilité des échantillons d'aliments liquides potentiels contenant ce composé. Aussi les concentrations inférieures de l'hydroxytyrsol sont plus susceptibles de se dégrader que les plus élevées. Par conséquent, ils ont observé des changements dans la stabilité de l'hydroxytyrosl avec la variation de sa concentration, de la température et le contenu ionique des solutions aqueuses.

Les attributs de la qualité d'un aliment fonctionnel peuvent changer au cours du stockage. Les mauvaises conditions de stockage des aliments fonctionnels et des boissons peuvent conduire à la perte d'ingrédients bioactifs avec l'apparition d'indésirable couleur et le changement d'odeur (Harbourne, et al., 2011). Par conséquent, il est d'une grande importance de mesurer le taux de variation d'un paramètre de qualité donné avec le stockage. Le pH acide des margines peut jouer un rôle important dans sa stabilité au cours du stockage, car il a été constaté que les infusions légèrement acides (pH 4,6) conservent la couleur et les composés phénoliques totaux (90%) pendant environ 4 mois. Dans les margines, après 5 mois de stockage, on a observé une accumulation importante de hydroxytyrosol sans une hydrolyse enzymatique préalabble (Feki et al., 2006). La concentration correspondante a augmenté de 0,77 à 0,98 à 3,1-3,5 g/L. Cependant, les concentrations des autres composés phénoliques ont nettement diminué. En revanche, il a été possible de maintenir la concentration de l'hydroxytyrosol constant au cours du stockage en ajoutant 10 % d'éthanol (Feki et al., 2006). En outre, dans une autre étude, Obied et al. (2008) ont comparé différentes conditions de

stockage de mardines, dans une tentative d'identifier les conditions optimales qui préservent les composés phénoliques et leurs propriétés antioxydantes comme il est juste après l'extraction de l'huile d'olive. Ils ont déterminé le taux des phénols et la capacité antioxydante des margines stockées à 4 °C et des margines conservées avec 40% (p/p) d'éthanol et 1% (p/p) d'acide acétique et stockées à 4 °C pendant 30 jours, par rapport à ceux des margines stockées à température ambiante. Aucune de ces conditions de stockage pourrait empêcher la diminution rapide des concentrations phénoliques et la capacité antioxydante, qui est arrivé au cours des 24 premières heures (Obied et al., 2008).

Habituellement, les produits de fruits tels que les jus, les boissons et les boissons mixtes sont conservés par des traitements thermiques, qui sont connus pour inactiver efficacement les micro-organismes et les enzymes délétères. Cependant, la température élevée atteinte au cours du traitement affecte négativement leurs propriétés organoleptiques et nutritionnelle (Aguilò-Aguayo et al., 2010). Malheureusement, à l'heure actuelle il n'existe aucune information disponible portée sur la composition phénolique de boissons à base d'extrait d'olive et quels processus thermique et quelles conditions de stockage suivre-t-on?

VI- Technologies de séparation de l'hydroxytyrosol par membrane

Dans les applications récentes, la filtration sur membrane est plus préférable être appliquée en mode transversal. Dans la filtration à écoulement tangential, l'alimentation est pompée dans le module à membrane, où il est séparé en deux courants à savoir le filtrat (ou perméat) et le rétentat, dans lequel l'espèce retenu a été concentrée. L'ultrafiltration à courants croisés diffère de la filtration frontale conventionnelle en ce que le rétentat s'écoule parallèlement à travers la surface de la membrane et non perpendiculaire vers celle-ci (Lojkine et al., 1992). Ce mouvement tangentiel des fluides supprime la majeure partie du matériau rejeté à partir la surface de la membrane, et minimise par conséquent, l'accumulation sur la surface de la membrane. On sait que les technologies membranaires emploient des filtres spéciaux (membrane) qui sont exploités dans un état fluido-dynamique particulièr (tangentiel) qui permettent de réduire l'encrassement du filtre et assure par conséquent un grand flux de perméat en fonction du temps (Cheryan, 1986). Ces technologies sont définies comme BAT (Best Available Technology) de l'EPA (Environmental Protection Agency) et sont également reconnus par l'Union européenne (UE). Les technologies membranaires sont largement appliquées dans le monde entier non seulement pour le traitement des eaux usées, mais surtout pour la récupération de solutés dispersées, souvent polluant, et pour produire de l'eau purifiée.En outre, le traitement des margines est basé sur l'application de la technologie

membranaire dans le but d'extraire et récupérer le maximum de polyphénols afin de faciliter l'évacuation de ces déchets (Pizzichini & Russo, 2005; Russo, 2007).

Dans cette étude, le traitement des margines par l'application de la technologie de membrane a été proposé dans le but d'extraire et récupérer le maximum de polyphénols afin de faciliter l'élimination de ces déchets. Le système hydraulique de traitement de margines avec les membranes est rapporté dans la figure 47.

La figure 47 montre la voie de traitement par fractionnement de margine brut. Ce processus de traitement permet la séparation des margines brutes en quatre fractions liquides dans différents pourcentages volumétriques. Compte tenu de 70 L de margines, comme charge de MF, les volumes respectifs de perméat et le concentré de chaque section de la membrane et le rapport de concentration en volume (VCR) entre le volume d'alimentation initial/volume de rétentat final de chaque section de membrane sont rapportés sur la figure 47. Selon le procédé proposé, le margine est soumis à une hydrolyse enzymatique par la â-glucosidase pour hydrolyser l'oléuropéine et des composants verbascosides de margines afin d'être amélioré en hydroxytyrosol libre dans les margines (Fig. 42, 43,44, 45). La fraction liquide séparée à partir des produits de dégradation est ensuite utilisée dans un système de membrane comprenant la microfiltration tangentielle, l'ultrafiltration tangentielle et une unité d'évaporation, dans l'ordre. Tous les deux fractions de rétentat de la membrane, respectivement 32,5 L de MF et de 9,5 L d'UF constituent les nouveaux produits raffinés avec l'ajout de l'25,8 litres d'eau purifiée, après les étapes de concentration et de 2,2 L de volume de concentré enrichi en polyphénols. Le concentré ultime du système après évaporation est riche en hydroxytyrosol (7,2 g / L de HT) (Fig. 48, Tableau 16).

Figure 48 : Les chromatogrammes de CLHP de composés phénoliques (détection à ë = 280 nm) des extraits de perméat de MF (a), de rétentat MF (b), perméat de l'UF (c), le rétentat UF (d), avant de concentration (e) et après concentration (échantillon était dilué 10 fois) (f). 1, hydroxytyrosol, 2, tyrosol, 3, composé non identifié, 4, oléuropéine.

Le flux de perméat en fonction du temps, pour les sections de MF et d'UF sont présentés sur la figure 49.

Figure 49 : Flux de perméat en fonction du temps des sections membranaires de microfiltration (MF) et ultrafiltration (UF).

Comme c'est indiqué dans la figure 49, la réduction de flux de perméat, représente une tendance classique pour les technologies membranaires, mais les profils de la productivité des deux sections de filtration baissent lentement, ceci est une démonstration d'un règlement de paramètre d'un procédé satisfaisant. Quand un processus de filtration sur membrane telles que l'ultrafiltration est utilisée, le flux et le rendement en baisse peut être observé. Les causes sont: i) la polarisation de concentration (à savoir l'accumulation des solutés de façon réversible est survenu immédiatement) et ii) des phénomènes d'encrassement comme l'adsorption, bouche-pores et le dépôt de solutés solidifiés, un processus à long terme, et plus ou moins irréversible. Le résultat de ces deux phénomènes est une force d'entraînement pour la diminution de la filtration ou d'une augmentation de la résistance contre le transport du solvant pénétrant lors de la filtration. Le degré de diminution du flux dépend de nombreuses variables qui sont les solutions et les équipements (Van den Berg & Smolders, 1990).

Le tableau 15 résume les conditions opératoires de chaque section de la membrane. Les flux initiaux de traitement de margine par MF et UF étaient de 42,85 et 103,89 L/m²h sous des pressions transmembranaires de 1,8 et 2,2 bar, respectivement.

L'efficacité des différentes conditions de fonctionnement a été évaluée par la détermination de la demande chimique en oxygène (DCO), le pH, la conductivité, la concentration de l'hydroxytyrosol, la teneur en composés phénoliques totaux et la matière séche. La charge en DCO est due à la teneur en matières organiques, notamment des composés azotés, des sucres, des acides organiques, des huiles, de cellulose et des composés polyphénoliques. Elle est de concentration égale à 165 g/L dans la margines brute. Une réduction substantielle de la DCO et de matière séche a été obtenue. La technologie de membrane fournit un perméat légèrement coloré (données non présentées), ce qui nécessite nettement moins de DCO pour son oxydation (3,42% de la DCO initiale) (Tableau 16). La microfiltration élimine 72,12% des DCO initiale. En effet, le rétentat de microfiltration contient toute la matière organique dans les margines se présentant sous la forme d'une suspension de matière insoluble. Alors que, les composés hydrophiles tels que les sucres réduits, l'hydroxytyrsosol et les minéraux se trouvent dans le perméat de MF. Le taux de rejet de l'hydroxytyrosol variait de 8 à 9%. Ce processus permet de récupérer seulement 24% des hydroxytyrosol dans le concentré final. Ce pourcentage peut être considérablement améliorée en prévoyant une dilution de rétentat de MF et d'UF par de d'eau pure, tout en répétant le processus (données non montrées).

Tableau 16: Le pH, la teneur en matière séche, la conductivité, la demande chimique en
oxygène, le contenu en phénols simples et la concentration d'hydroxytyrosol avant et après
l'hydrolyse enzymatique des margines et après la microfiltration, l'ultrafiltration et la
concentration.

Margine Brute Hydrolysed OMW Microfiltration			Ultrafiltration	Concentration
P R			P	R
pH
5.03#177;0.2 4.93#177;0.2	4.78#177;0.2	4.73#177;0.2	4.81#177;0.2	4.79#177;0.2	4.84#177;0.2
Matière séche (g/100g)
9.33#177;0.5 9.23#177;0.5	6.28#177;0.5	11.12#177;0.5	4.71#177;0.5	5.72#177;0.5	41.95#177;0.5
Conductivité (ms)
11.26#177;0.5 11.25#177;0.5	11.17#177;0.5	10.62#177;0.5	10.29#177;0.5	10.7#177;0.5	15.11#177;0.5
DCO (g/l)
165.76#177;1.5 165.83#177;1.5	57.76#177;1.5	119.25#177;1.5	48.44#177;1.5	59.62#177;1.5	nd
Ortho phénols totaux (g/L)
4.5#177;1.2 5.5#177;1.2	3.31#177;0.5	7.27#177;1.2	1.96#177;0.2	2.7#177;0.5	17.6#177;2.5
Sucre Reducteur (g/L)
26#177;3.2 60#177;4.2	nd	nd	nd	nd	158.21#177;8.5
Hydroxytyrosol (g/L)
0.23#177;0.2 0.93#177;0.2	0.85#177;0.1	0.72#177;0.1	0.79#177;0.1	0.807#177;0.1	7.2#177;1

P: Perméat ; nd: non determiné ; R:Rétentat ; DCO : Demande Chimique en Oxygène (g/L)

Les résultats de caractérisation de margine après séparation membranaire par CLHP sont illustrés sur la Fig. 48. Ces chromatogrammes identifient un total de 3 composés, le composé majeur était l'hydroxytyrosol (Fig.48). L'extrait à l'acétate d'éthyle obtenue après hydrolyse enzymatique est riche en hydroxytyrosol plus de 1 g/L, mais pauvres en macromolécules comme l'oleuropéine, le verbascoside et la ligstroside. En utilisant la technologie des membranes de MF, ainsi que l'UF, l'hydroxytyrosol et le tyrosol, ayant des poids moléculaires faibles de 154 et 138 g/mol, respectivement, se trouvent concentré dans le rétentat (Fig.48). Ainsi, la diafiltration est nécessaire pour récupérer au maximum ce composé. L'élimination de l'eau par l'évaporation à des températures modérées a permis l'obtention d'un concentré riche en hydroxytyrosol. Les résultats obtenus montrent que le prétraitement enzymatique, MF, UF et la concentration avec l'évaporation peuvent être utilisés comme un traitement efficace des margines au processus doux. Un tel prétraitement peut améliorer efficacement un processus d'extraction ultérieure des composés phénoliques du perméat et améliore l'efficacité de tout traitement secondaire. En outre, 41% de l'enrichissement de phénols totaux est due à la libération de l'hydroxytyrosol (Tableau 16). Par conséquent, une production durable et plus propre d'une grande quantité d'hydroxytyrosol peut être atteint. L'utilisation du procédé à l'échelle pilote pour la récupération d'hydroxytyrosol naturel est une méthode alternative prometteuse. Le rétentat de l'unité de MF et d'UF peut également être utilisé pour y extraire des composés polyphénoliques ou peut être utilisé dans l'industrie alimentaire comme additif pour le pain, pizza, etc, mais il est aussi plus intéressant comme substrat pour la production de méthane en anaérobiose. Pizzichini & Russo (2005) ont révélé un processus proche pour récupérer totalement les composants chimiques des margines en utilisant des technologies membranaires.

VII- Caractérisation physico-chimique de concentré ultime

Le tableau 14 donne les principales caractéristiques des fractions de margine pendant le processus de traitement. Le pH du concentré final était égal à 4,84. Le pH est à peu près constant tout au long du processus. De plus, la conductivité est maintenue constante, néomoins après la concentration par évaporation, elle a augmenté. Une concentration élevée de sucre réducteur de 158,21 g/L a été dosée dans ce concentré (Tableau 16). La teneur minérale de ce nouveau produit est principalement composée de métaux. La teneur en métal du concentré final a été montrée dans le tableau 17.

Tableau 17: Composition minérale de l'ultime concentré de margine purifié

Ce produit est exempt de métaux lourds, mais il est riche en calcium, fer, potassium, manganèse et sodium (Tableau 17). Les métaux sont importants aussi bien du point de vue nutritionnel que toxicologique. Certains métaux, en particulier le fer, le cuivre et le zinc, sont des substances essentielles pour le corps humain et leur carence peut avoir des effets aigus et chroniques. Toutefois, même ces éléments peuvent avoir des effets toxiques en fonction de la forme chimique, la dose, la voie d'absorption, et une foule d'autres facteurs (Leung et al., 2010). Aussi, les margines contiennent des ions de métaux importants comme le magnésium et le calcium qui sont déclarées pour minimiser le risque de maladie cardiaque (Anne, 2011). D'autres métaux, en particulier les métaux lourds tels que le plomb (Pb) et le cadmium (Cd), sont bien connus comme éléments potentiellement toxiques. Le concentré final obtenu contient une très faible quantité de cadmium (0,0264 ppm) (Tableau 17). La contamination métallique peut avoir lieu au cours de la manipulation et du traitement des olives, de la ferme au point de consommation. D'où l'importance d'être en mesure de contrôler de faibles concentrations de métaux dans les aliments afin de s'assurer que le niveau sécuritaire (par exemple <0,05 mg / kg de poids humide pour le Cd et le Pb, le règlement n ° 1881/2006 « Commission Regulation (EC) No. 1881/2006 ») ne soit pas dépassée. Aucun effort ne doit être épargné pour éliminer les oligo-éléments tels que le cuivre et le fer où ces éléments sont dans l'approvisionnement alimentaire à court. Des éléments tels que le cadmium et le plomb, qui peuvent s'accumuler dans l'organisme, doivent être minimisées. Par conséquent, les caractéristiques des techniques d'extraction des matières premières ont un effet significatif sur la composition des extraits finaux, et donc dans le processus industriel, la composition phénolique de l'extrait d'olive doit être normalisée. Un extrait aqueux de margine

adapté pour les aliments et les boissons peuvent être obtenues facilement par simple ultrafiltration (Galanakis et al., 2010). Les scénarios de commercialisation dépendra de l'utilisation prévue, si les composés individuels, un mélange de plusieurs ou d'un extrait aqueux crud de margine doit être récupéré.

VIII- Conclusion

Cette étude a suggéré le scal-up du traitement enzymatique pour les margines avec le but d'augmenter la concentration en HT. Les traitements d'hydrolyse ont été étudiés à l'aide de filtrat de culture d'A. niger sur le son de blé dans un fermenteur de 100 L durant 7 jours. L'utilisation de filtrat de culture d'A. niger comme un bio-catalyseur donne 1,53 ; 0,83 et 0,46 g d'hydroxytyrosol par litre de margine de Nord, MSP et MCC, respectivement. Ce processus donne un produit naturel et un produit bioactif d'une source végétale, par opposition à la molécule obtenue par synthèse chimique. Le projet enzymatique de pré-traitement peut s'avérer utile non seulement pour les applications de laboratoire, mais aussi pour étendre la capacité d'application à l'echelle pilote pour le recyclage des margines. L'application des procédés de filtration membranaire permet la récupération de quatre grandes fractions liquides dans différents pourcentages volumétriques, qui sont tous adaptés pour un usage commercial en agroalimentaire, nutritionnel et cosmétique. Dans le concentrat ultime obtenu seulement 24% d'hydroxytyrosol ont été recupéré. Par conséquent, le nouveau produit obtenu obéi aux besoins alimentaires; voir que son pH est légèrement acide, elle est concentrée en hydroxytyrosol et le sucre réducteur, il contient des minéraux bénéfiques pour la santé et ne contient pas de métaux lourds ou de produits chimiques.

Conclusion et Perspectives

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Les travaux de recherche entrepris dans cette thèse rentrent dans le cadre de l'enrichissement des margines en terme d'hydroxytyrosol par une méthode douce et biologique ouvrant une voie de la bioconversion des composés phénoliques des margines par le biais d'enzymes produites par des champignons suite à leur fermentation sur un milieu de culture local et bon marché. Cette molécule cible de notre étude est un ortho-diphénol naturel dotées de l'activité antioxydante. L'objectif de notre étude est donc (i) d'optimiser des conditions de la culture et la composition du milieu la production de 3-glucosidase par la souche Aspergillus niger, (ii) d'étudier la bioconversion des composés phénoliques de la margine par différents champignons à savoir Aspergillus niger, Trametes trogii et Trichoderma atroviride, (iii) d'optimiser les paramètres de la bioconversion des composés phénoliques des margines en utilisant le jus de culture d'A. niger dans le but d'améliorer au maximum le rendement de libération de l'hydroxytyrsosol, (iv) de comparer la bioconversion des composés phénoliques des margines moyennant différentes enzymes tels que la 3-glucosidase pure et l'estérase pure et d'autres enzymes commerciales, (v) de tester l'efficacité de l'immobilisation de 3-glucosidase de la souche Aspergillus niger sur la bioconversion des margines. (vi) d'achever la bioconversion des margines à grande échelle et la récupération de l'hydroxytyrosol par les techniques membranaires et la concentration du perméat de l'ultrafiltration par évaporation.

Durant la première étape de notre travail, nous avons montré que la composition du milieu de culture optimisé pour la production de 3-glucosidase de la souche Aspergillus niger est le son de blé comme l'unique source de carbone, la peptone de blé comme la source d'azote organique, l'urée comme la source d'azote inorganique, le rapport C/N est égal à 10 et la taille de l'inoculum est de 6 10⁸ spores/ml. Quant aux paramètres de culture optimisés sont le pH égale à 4, la température d'incubation est de 30 °C et les batchs de fermentation liquide sont soumis à une agitation de 160 rpm. Au cours de cette première partie, une amélioration de la production de 3-glucosidase de la souche Aspergillus niger a été obtenue. L'activité maximale de 3-glucosidase obtenue était égale à 7185 UT/ml et celle d'estérase était égale à 230 UI/ml. La 3-glucosidase de la souche Aspergillus niger à une température optimale d'action égale à 50 °C et un pH optimum d'action de 4,8. Sa demi-vie à 50 °C est de 24 heures, elle est non thermostable. L'utilisation du fermenteur de 100 litres a permis la réussite de la fermentation d'A. niger sur le son de blé à grande échelle et la production de 3-

Conclusion et Perspectives

glucosidase avec une activité égale à 3895 UT/ml suite au prétraitement du son de blé avant sa fermentation.

Les résultats de la bioconversion ont montré que le filtrat enzymatique est le meilleur biocatalyseur pour la libération de l'hydroxytyrosol. Cette étude indique que la réaction d'hydrolyse des margines brutes (fraîches) pendant 2 h par un filtrat obtenu d'un bouillon de culture d'A. niger après 5 jours d'incubation, permet de libérer l'hydroxytyrosol à une concentration de 0,8 g/l de margine. Cette découverte indique que la 3-glucosidase est l'enzyme clé dans ce processus aussi l'enrichissement en 3-glucosidase est essentielle pour la bioconversion de polymères des margines pour évacuer l'hydroxytyrosol.

Les présents résultats ont montré également qu'A. niger, T. trogii et T. atroviride croissent sur un milieu de culture économique (le son de blé comme l'unique source de carbone) tout en produisant une préparation d'enzyme extracellulaire ayant des activités estérase, 3-glucosidase et laccase. Évalués sur les margines brûtes (fraîches) ayant de très basse charge de monomères phénoliques comme l'hydroxytyrsol, ces jus de culture ont pu convertir des phénols hydrolysables comme l'oleuropéine, ligstroside ou verbascoside en monomères comme l'hydroxytyrosol. Les meilleurs résultats ont été atteints en utilisant le jus de culture d'A. niger présentant une forte activité 3-glucosidase (faible activité estérase et aucune laccase) où 1,1 g/l d'hydroxytyrosol a été libéré de margines fraîches ne contenant que 0,05 g/l d'hydroxytyrosol naturellement libre. Ainsi, la réaction de bioconversion proposée dans cette étude, permettant la récupération de l'hydroxytyrosol naturel, offre une alternative à la méthode d'extraction conventionnelle et la fermentation microbienne. Cette méthode est environnemental, douce qui permet également d'améliorer le rendement d'extraction et de la qualité des extraits. La grande efficacité de l'hydroxytyrosol comme un antioxydant puissant a été confirmée par la méthode antiradicalaire DPPH.

Dans la présente recherche, nous avons aussi étudié les effets de (i) les conditions physico-chimiques (pH, température, temps et agitation), (ii) le type de margine comme substrat et (iii) la concentration d'enzyme sur la réaction de bioconversion des margines. Une forte concentration de hydroxytyrosol (2,9 g/l) a été obtenu après 30 min de réaction enzymatique de margine à 50 O C, à pH 4,8 et en état agité. Cette concentration n'est pas rapporté avant et c'est une des plus fortes concentrations d'hydroxytyrosol rapporté après conversion chimique ou biologique des margines.

Les résultats de l'immobilisation de l'enzyme ont montré des modèles grossièrement semblables du profil du pH et de température, l'optimum de ces paramètres n'est pas significativement changé avec l'immobilisation. Un changement du profil chromatographique

Conclusion et Perspectives

des extraits de margine a été observé suite à la bioconversion des composés phénoliques des margines par les deux formes d'enzyme avec un taux de bioconversion plus faible observé avec l'enzyme immobilisée qui diminue de 50%.

L'étude comparative de la bioconversion des composés phénoliques des margines par différentes enzymes commerciales et pures a indiqué que la préparation enzymatique d'A. niger a le même effet que le viscozyme et la â-glucosidase purifiée pour la libération de HT. L'estérase pure n'a aucun effet sur cette finalité.

La bioconversion à grande échelle a été conduite pour biotransformer les composés phénoliques de 40 litres de margine de Nord et 15 litres de margine MSP et MCC de Sfax. Ceci a permis l'amélioration de la concentration de l'hydroxytyrosol de 2,70 ; 3,61 et 1,77 fois que le contrôle dans le cas de margine Nord, MSP et MCC respectivement. Le projet enzymatique de pré-traitement peut s'avérer utile non seulement pour les applications de laboratoire, mais aussi pour étendre la capacité d'application à l'echelle pilote pour le recyclage des margines. L'application des procédés de filtration membranaire permet la récupération de quatre grandes fractions liquides dans différents pourcentages volumétriques, qui sont tous adaptés pour un usage commercial en agroalimentaire, nutritionnel et cosmétique. Dans le concentrat ultime obtenu seulement 24% d'hydroxytyrosol ont été recupéré. De plus, le nouveau produit obtenu obéi aux besoins alimentaires; voir que son pH est légèrement acide, elle est concentrée en hydroxytyrosol et le sucre réducteur, il contient des minéraux bénéfiques pour la santé et ne contient pas de métaux lourds ou de produits chimiques.

Pour la poursuite de ce travail, plusieurs autres axes de recherche pourraient être développés :

- Pour une application industrielle l'enrichissement les margines en
hydroxytyrosol, une bioconversion en continue de l'hydroxytyrsol devrait être envisagée.

- Pour conserver les activités de l'hydroxytyrsol on doit protéger la fonction

ortho-diphénol contre l'oxydation. Pour cela, il est nécessaire de développer une méthode biologique permettant d'acétyler les différents groupements hydroxyles de l'hydroxytyrosol.

d'étudier son application dans plusieurs secteurs industriels tels que l'industrie

Conclusion et Perspectives

agroalimentaire et l'industrie cosmétique. L'hydroxytyrosol pourrait être testé dans des jus, des huiles alimentaires et dans des produits à application cutanné.

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Ministère de l'Enseignement Supérieur,de la Recherche Scientifiqueet de la Technologie

BIOCONVERSION ENZYMATIQUE DES COMPOSES PHENOLIQUDES DES
EFFLUENTS ISSUS DE L'EXTRACTION D'HUILE D'OLIVE : UNE VOIE
PROMETTEUSE DE VALORISATION PAR LA PRODUCTION DE
L'HYDROXYTYROSOL NATUREL.

Résumé: Au cours de ce travail, nous avons étudié et optimisé la production de 13-glucosidase par fermentation en milieu liquide du son de blé par Aspergillus niger. Un essai de la production de 13-glucosidase dans un fermenteur de 100 litre a été entrepri et a permis l'obtention de 3895 UI/ml comme activité maximale. L'utilisation de la préparation enzymatique d'A. niger pour l'hydrolyse des margines a montré une augmentation significative de la concentration de l'hydroxytyrosol. L'effet hydrolytique de la préparation enzymatique produite lors de ce travail a été comparable à celui trouvé lors de l'hydrolyse de margines par la 13-glucosidase pure. La bioconversion a été entreprise à grande échelle pour biotransformer les composés phénoliques de 40 litres de margine de Nord et 15 litres de margine MSP et MCC de Sfax. Ceci a permis l'amélioration de la concentration de l'hydroxytyrosol de 2,70 ; 3,61 et 1,77 fois dans le cas de margine Nord, MSP et MCC respectivement. Une série de procédés a été par la suite effectuée pour la purification et la concentration de l'hydroxytyrosol. Une microfiltration, une ultrafiltration de 70 litres de margine hydrolysée et une concentration du perméat de l'UF ont été effectuées dans l'ordre. Uniquement 24% d'hydroxytyrosol a été récupéré dans le concentrat final. Le nouveau produit obtenu obéi aux besoins alimentaires.

Mots clés Aspergillus niger, 13-glucosidase, fermentation en milieu liquide, margine, hydrolyse enzymatique, composés phénoliques, antioxydants, microfiltration, ultrafiltration.

Abstract: During this work, we have studied and optimized the 13-glucosidase production by liquid state fermentation of wheat bran by Aspergillus niger. A trial production of 13-glucosidase in a fermenter with 100 liters was companies and helped obtain 3895 IU/ml as the maximum activity. The use of A. niger enzyme preparation for olive mill wastewater (OMW) hydrolysis showed a significant increase of simples phenolics and reduced sugars. The hydrolytic effect of the enzyme preparation produced during this study was comparable to that found during the hydrolysis of OMW by different commercial enzyme preparations. The bioconversion was carried out large-scale biotransformation of phenolic compounds of 40 liters of North OMW and 15 liters of MSP and MCC from Sfax. This has helped improve the concentration of hydroxytyrosol 2.70, 3.61 and 1.77 times in the case North OMW, MSP and MCC respectively. A series of processes was subsequently performed for the purification and concentration of hydroxytyrosol. Microfiltration, ultrafiltration of 70 liters of hydrolyzed OMW and concentration of the UF permeate were carried out in order. Only 24% of hydroxytyrosol was recovered in the final concentrate. The new product obtained obeyed the dietary needs.

Key-words Aspergillus niger, 13-glucosidase, liquid state fermentation, OMW, enzymatic hydrolysis, phenolic compounds, antioxydants, microfiltration, ultrafiltration.