Bioconversion enzymatique des composés phénoliques des effluents issus de l'extraction d'huile d'olive: une voie prometteuse de valorisation par la production de l'hydroxytyrosol naturel

J-10 Chromatographie phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG-SM)

Le système CPG-SM est de type « Hewlett-Packard model 5872 A ». La colonne utilisée est une colonne capillaire « HP5MS » de longueur 30 m et de diamètre intérieur égal à 0,32 mm. Les températures de l'injecteur, de l'interface et de la source sont égales à 260 °C, 280 °C et 175 °C respectivement. Le gaz vecteur est l'hélium utilisé avec un débit égal à 1,7 ml/ min. la température de la colonne augmente de 100 °C jusqu'à 260 °C pendant 10 minutes.

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Matériel et Méthodes

II- Méthodes

II-1 Techniques de culture de champignons

II-1-1 Extraction des spores et culture de la souche Aspergillus niger

La suspension qui stocke des spores est obtenue par culture du champignon dans le milieu PDA «Potato Dextrose agar » à 30 °C pendant 5 jours (Selvakumar et al., 1998). Les spores sont récupérées à partir de la surface par l'ajout de l'eau stérile contenant 2 % (V/V) de Tween 80 et grattées avec une spatule stérile. La suspension de spores obtenues est filtrées puis stockées dans le glycérol 25 % (V/V) à -20 °C.

La culture en batch d'Aspergillus niger est effectuée dans des Erlenmeyers de 500 ml contenant 100 ml de milieu de culture. L'inoculation est effectuée par 100 ul de la suspension de spores dans des conditions stériles. La culture est incubée au Shaker à 30°C et sous une agitation de 160 tr/min, pendant 10 à 15 jours.

II-1-2 Culture de la souche Trichoderma atroviride et de la souche Trametes trogii

Les mycéliums de champignons sont hydratés et inoculés dans le milieu solide PDA (Potato Dextrose Agar) et cultivés à 30 °C pendant 7 jours. 2 % (V/V) d'inoculum préalablement préparé et broyé sera transféré au milieu de production stérile qui est constitué par 100 ml de milieu de culture dans des erlenmeyeres de 500 ml. Ce milieu est identique à celui préparé pour la souche Aspergillus niger.

II-2 Techniques de récupération des enzymes et dosage de leurs activités

II-2-1 Préparation des enzymes

Les activités enzymatiques (laccase, estérase et â-glucosidase) sont déterminées dans le filtrat de la culture du champignon. Ce filtrat est obtenu par une filtration (moyennant un papier Wattman GF/D).

Pour la culture d'Aspergillus niger, l'échantillon est d'abord filtré (Whatman GF/D), ensuite centrifugé dans le but d'éliminer les spores qui sont formés pendant la fermentation d'Aspergillus niger. La solution d'enzyme clarifiée est stockée à -20 °C jusqu'à son utilisation ultérieure pour la biotransformation et/ou le dosage enzymatique.

La â-glucosidase purifiée à partir de la souche Aspergillus niger est préparée en dissolvent 1,5 mg de l'enzyme dans 0,8 ml du tampon citrate (20 mM pH 4,5).

II-2-2 Dosage des activités enzymatiques

? â-glucosidase

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Matériel et Méthodes

L'activité â-glucosidase est déterminé selon la méthode développé par Norkrans (1950), mais en utilisant une concentration de la solution de substrat de 5mM à la place de 1 mM. Un volume de 0,1 ml de la solution enzymatique est mélangé à 1 ml de PNPG (5mM dans le tampon citrate de sodium (50 mM), pH 4,8). La réaction enzymatique se déroule à 50 °C pendant 10 minutes. La réaction est arrêtée en additionnant 2 ml de la solution Na2CO3 (1 M), suivit de 10 ml d'eau. L'absorbance est mesurée à 405 nm. Pour le blanc, 0,1 ml d'eau est additionné à la place de l'échantillon enzymatique. L'activité â-glucosidase est définie comme le nombre de umol de p-nitrophénol produit par minute sous les conditions opératoires (UI). Les activités sont mesurées en triplicata et exprimées en Unité international par millilitre (UI/ml), avec UI définie la quantité de l'enzyme qui catalyse la libération de 1 umol de p-nitrophenol par minute.

? Estérase

L'activité estérase est déterminée selon la méthode développée par Mackness et al. (1983). Le mélange réactionnel contient 50 ul du jus enzymatique, 50 ul de p-nitrophenyl acétate (PNPA) dans l'éthanol (150 mM), et 2,9 ml du tampon Tris 6HCL (9,2 mM, pH 7,5) afin d'obtenir une concentration de PNPA de 2,5 mM et un volume réactionnel total de 3 ml.

La réaction est initiée par l'addition de l'extrait enzymatique et incubé à 25 °C durant 4 min. L'absorbance est déterminée à 405 nm. La gamme étalon, et la courbe standard est préparée dans la série de 0 à 220 nmol de p- nitrophénol.

? Laccase

L'activité laccase est déterminée par l'utilisation de la solution DMP 10 mM dans le tampon tartrate de sodium (100 mM, pH 5). L'extinction molaire å469 est égale à 27,500/M cm, réfère à la concentration de DMP (Yaropolov et al., 1994). Les réactions enzymatiques sont effectuées à la température ambiante (22 à 25 °C). Une unité d'enzyme est définie comme étant la quantité d'enzyme oxydant 1 umol de substrat par minute.

? á-Amylase

L'activité á-amylase est déterminée par le mélange de 0,25 ml de l'échantillon avec 0.5 ml du tampon acétate (0.2 M ; pH 5,0) et 1.25 ml d'amidon soluble (1%). Après 10 min d'incubation à 50 °C, la concentration de glucose libérée à partir de l'amidon par l'action de á-amylase est estimée à l'aide du spectrophotomètre à 550 nm accordant la méthode de Miller (1959). Une unité (U) de l'activité á-amylase est définie comme la quantité de micromole de

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Matériel et Méthodes

sucre réducteur (glucose) libéré par minute sous les conditions de l'essai. Les résultats sont exprimés en UI/ml.

? Protéase

L'activité protéase est déterminée par le mélange de 0,5 ml de l'échantillon avec 0.5 ml de la solution caséine à 1 %. Après 15 min d'incubation à 50 °C, on ajoute 0,5 ml de TCA (Tri-chloroacétique acide) à 20 %. Après incubation à la température ambiante pendant 15 minutes. Une centrifugation à 13 000 tours/min est par la suite effectuée pendant 15 minutes. La concentration d'acides aminés libérés à partir de la caséine par l'action de protéase est estimée à l'aide du spectrophotomètre à 280 nm. Une unité (U) de l'activité protéase est définit comme la quantité de micromole d'acide aminé libéré par minute sous les conditions de l'essai. Les résultats sont exprimés en UI/ml.

? Cellulase

L'activité endoglucanase est mesurée en utilisant le substrat hydroxyéthylcellulose (10 g/l) dans le tampon citrate (50 mM ; pH 4,8) (Bailey & Nevalainen, 1981). Le substrat (900 ul) est équilibré à 50 °C, 100 ul d'échantillon sont additionnés, et après 10 min 1500ul de réactif de DNS sont ajoutés (Ghose, 1987). Pour les standards, 100ul glucose (2.5-10 mM) sont additionnées au 900 ul de substrat et au 1500ul de DNS. L'échantillon et le standard sont bouillis à 100 °C pendant 5 minutes et refroidie à la glace. L'absorbance est mesurée à l'aide du spectrophotomètre à 540 nm

? Papier Filtre

L'activité papier filtre est mesuré en suivant la méthode détaillé par Ghose, 1987. On utilise le papier filtre Wattman N°1 dans le tampon citrate (50 mM ; pH 4,8) et à 50 °C. L'activité papier filtre est exprimée en UPF (umol/min de substrat convertis)

? Xylanase

L'activité xylanase est déterminée par la méthode de Bailey et al. (1992). Une unité (U) de l'activité xylanase est définie comme la quantité d'enzyme libérant 1umol de xylose équivalent par minute sous des conditions de pH égale à 5 et de température de 50 °C. Le substrat de l'enzyme est préparé à la concentration de 1% de xylane dans le tampon acétate pH 5.

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Matériel et Méthodes