I-2-3 Identification au CG-SM des produits obtenus
L'identification des différents phénols
libérés suite au traitement enzymatique des margines est
achevée par la technique de CG-SM et par la comparaison avec des
composés phénoliques de références (Fig. 22). Les
majeurs composés phénoliques identifiés sont : le tyrosol,
HT, l'acide p-coumarique et l'acide caféique (Fig. 22). Les
autres composés à savoir les acides gras ont été
aussi détectés (Fig. 22).
Temps (min)
99
Résultats et Discussion
Temps (min)
Figure 22: Chromatogramme d'ion total gaz des
produits extrait à l'acétate d'éthyle obtenu à
partir des margines (a) et margine hydrolysé (b). Les composés
identifiés par la masse tout en respectant leur temps de
rétention sont les suivants : 15,69: tyrosol (1); 21,05: hydroxytyrosol
(2); 25,16: acide para-coumarique (3); 27,59: acide palmitique (4); 29,9: acide
caféique (5);
31,39: acide oléique (6).
J-2-4 Effet de la nature de biocatalyseur, le temps de
la réaction et le temps d'incubation de culture d'A. niger sur la
biotransformation en hydroxytyrosol
Pour améliorer la production d'hydroxytyrosol,
plusieurs facteurs efficients pourraient être étudiés,
principalement la nature du biocatalyseur, le temps de la réaction de
bioconversion et le temps d'incubation de culture d'A. niger. Les
enzymes d'A. niger peuvent se présenter libres dans le
surnageant de la culture ou fixé à la biomasse. Dans cette partie
d'étude, nous avons cherché la caractérisation de
l'emplacement d'enzymes actives : libre ou fixé à la biomasse qui
est considéré comme le biocatalyseur pour la biotransformation.
C'est pourquoi,
100
Résultats et Discussion
les réactions de bioconversion des margines par la
biomasse (mycélium), le filtrat de culture (jus de culture) et la
culture entière (mixte) ont été étudiées. La
Fig. 23 illustre le temps de formation d'hydroxytyrosol pendant ces
réactions. Le contrôle sans enzyme a été aussi
exécuté et aucune production significative d'hydroxytyrosol n'a
été observée (Fig. 23). La quantification d'hydroxytyrosol
du contrôle a montré une concentration de 0.05 g/l qui correspond
seulement à 6,25% de sa valeur finale dans les margines
hydrolysées. Il devrait noter qu'en absence de jus de culture d'A.
niger, le substrat n'a pas été converti en hydroxytyrososl
même avec la condition à haute température (50 °C). La
bioconversion des margines par le filtrat a été
caractérisée par une production d'hydroxytyrosol rapide avec des
concentrations plus élevé que ceux obtenus dans des
expériences semblables en présence de la culture entière
et la biomasse lavée. La quantité de l'hydroxytytrosol produit en
présence de filtrat (0,80 g/l) augmente de 42,8 % comparé
à la culture entière (0,56 g/l). Ici, nous pouvons expliquer
cette différence par la dégradation de l'hydroxytyrosol par la
biomasse. L'utilisation de biomasse, précédemment lavée
par le tampon citrate pH 4,8 a abouti à moins de libération
d'hydroxytyrososl (0,08 g/l) pendant les premiers temps de réaction.
Cependant, la concentration en hydroxytyrosol a augmenté à 0.27
g/l après 6 h de réaction de bioconversion (Fig. 23). Cela peut
être expliqué par le fait que le mycélium a continué
sa production d'enzyme pendant l'incubation avec les margines. Dans ce cas nous
avons noté qu'une augmentation d'activité 3-glucosidase dans le
réacteur enzymatique de bioconversion (220 UI/ml).
Nous pouvons conclure que la concentration la plus haute
d'hydroxytyrosol (0,8 g/l) a été obtenue en utilisant le filtrat
d'enzyme produit par A. niger avec une activité 3-glucosidase
de 3000 UI/ml après 2 h de réaction. Selon ces résultats,
le jus enzymatique est le meilleur biocatalyseur pour la libération de
l'hydroxytyrosol. Cette découverte indique que la 3 glucosidase est
l'enzyme clé dans ce processus aussi la concentration 3-glucosidase est
essentielle pour la bioconversion de polymères des margines pour
évacuer l'hydroxytyrosol. La synthèse et la
sécrétion de 3-glucosidase sont très importantes et la
présence relativement des hauts niveaux d'activité 3-glucosidase
avec l'estérase ensemble semble être essentielle pour une
hydrolyse enzymatique efficace des margines.
Pour réaliser le rendement maximal en hydroxytyrosol,
l'état de croissance de culture d'A. niger utilisée pour
la conversion des margines a été aussi optimisé. Les
fermentations en batch de son de blé avec l'A. niger ont
été examinées dans des mêmes conditions
contrôlées. Les filtrats de culture obtenus aux différents
temps d'incubation ont été évalués pour la
bioconversion des margines. Les résultats ont montré que, pendant
les 5 premiers jours de
101
Résultats et Discussion
culture, la libération de l'hydroxytyrosol était
synchrone avec l'activité â-glucosidase présente dans le
jus de culture (les Figues 16 b et 24). Une association entre une
activité élevée de â glucosidase (le jour 2-5) et
une libération de l'hydroxytyrosol a été observée,
confirmant de nouveau le rôle d'hydrolyse de cette enzyme.
Néanmoins, à une activité enzymatique plus importante
(4800 UT/ml) correspondant au jus de culture au huitième jour
d'incubation, la concentration en hydroxytytrosol était uniquement de
0,5 g/l contre 0,8 g/l obtenu au cinquième jour d'incubation. En effet,
la concentration en hydroxytyrosol a diminué lentement, qui pourrait
être en raison du fait qu'il est dégradé par le
mycélium ou les spores du champignon qui ont apparu au sixième
jour.
Figure 23 : Evolution de la concentration de
l'hydroxytyrosol dans les margines durant son hydrolyse par la culture
entière, le filtrat et la biomasse de culture d'A. niger
à 50 °C.
Figure 24 : La concentration d'hydroxytyrosol
après la bioconversion des margines en utilisant le filtrat de culture
du A. niger à différents temps d'incubation.
102
Résultats et Discussion
Ces résultats indiquent que la f3-glucosidase est
l'enzyme clé dans ce processus; également la concentration de
f3-glucosidase est essentielle pour la bioconversion des polymères de
margines pour libérer l'hydroxytyrosol. Cela a été
démontré par Capasso et al. (1997) qui ont étudié
l'hydrolyse enzymatique de l'oleuropéine, extrait de la plante
d'olive, par la f3-glucosidase libre de l'amande. Cela doit
également être pris en compte que la quantité
d'hydroxytyrosol dans le margine ne vient pas seulement de l'hydrolyse de
l'oleuropéine et le verbascoside mais aussi à partir de
l'hydrolyse de l'hydroxytyrosol 4-f3-D-glucoside (Romero et al., 2002)
où la f3-glucosidase est l'enzyme clé pour la
libération
d'hydroxytyrosol. La présence de niveaux relativement
élevés des activités f3-glucosidase et estérase
semble être essentielle pour l'hydrolyse enzymatique efficace des
margines. L'utilisation de préparation enzymatique d'A. niger
obtenue après 5 jours d'incubation est un bio-catalyseur efficace
pour la bioconversion de margine. Dans ces conditions de
biotransformation, de concentration élevée
d'hydroxytyrosol (0,8 g/l) sont collectées par
une procédure très simple (enzymatique hydrolyse
- extraction EA) qui peut s'avérer utile pour une nouvelle demande de
recyclage de margine. La f3-glucosidase recombinante homogène
hyperthermophile archaeon de S. solfactaricus, exprimé dans
E. coli, a été immobilisée sur le support, le
chitosane utilisé pour produire hydroxytyrosol à partir de
l'oléuropéine de commerce (Briante et al., 2000). En outre, les
propriétés antioxydantes du principale produits obtenus ont
été purifiés et caractérisés (Briante et
al., 2001) jusqu'à une production de hydroxytyrosol de 91-94% en poids a
été atteint (Briante et al., 2004).
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