Etude des propriétés biochimiques et adhésives des souches de candida spp. isolées de la station de traitement des lixiviats de Djebel Chakir

II-Identification biochimique des espèces de Candida

spp. isolées

II. 1. Echantillonnage

Les échantillons analysés dans cette étude ont été prélevés dura nt trois campagnes d'échantillonnage à partir des différentes phases de traitement des lixivi ats de la station de Borj Chakir. La période de c ollecte s'est étendue du mois de Novembr e 2011 au mois de Février 2012, date au cours de laquelle la station est mise hors service. Les échantillons de lixiviats sont prélevés stérilem ent dans des bouteilles en verre (1 L) préa l ablement stérilisées par la chaleur sèche (volume fi nal 1 L) et conservées dans des glacières contenant de la glace. Les échantillons sont analysés d ès le retour au laboratoire puis conservés à

-20°C.

Candida

II.2. Isolement et caractéris ation biochimique des espèces de II.2.1. Isolement des es pèces de Candida sur milieu chromogénique

L'isolement des espèces de Candida à partir des différents prélèvements a été réalisé sur gélose CHROMagar^TM Candida (BioMérieux, France). Cette gélose est un milieu

La floculation des isolats de Candida a été testée en incubant les cellules (DO600nm=1) dans 10 ml de bouillon YPD pendant 24h à 37°C. La lecture visuelle des résultats est réalisée

Méthodologie & Protocoles

chromogénique qui sert pour l'isolement sélectif des levures et l'identification directe des espèces de Candida. L'identification des isolats de C. albicans est caractérisée par une coloration des colonies de cette espèce en vert par l'hydrolyse spécifique d'un substrat chromogène après une incubation de 24 à 48 h à 37°C. L'hydrolyse d'un deuxième substrat permet de différencier les cultures mixtes et d'orienter l'identification vers d'autres espèces à savoir C. tropicalis de couleur «bleu métallique» et C. krusei caractérisée par des colonies roses (Odds et Bernaerts, 1994; Beighton et al., 1995; Pfaller et al., 1996). Ce milieu permet de discriminer entre ces trois espèces et de les isoler même si elles sont en culture mixte et à faible quantité (UFC/ml).

Pour cela, dix millilitres de chaque prélèvement sont enrichis dans 90 ml de bouillon YPD (10g extrait de levure; 10g peptone et 20g glucose) et sont incubés pendant 48h à 37°C (Noumi et al., 2011a). Après incubation, l'isolement sur le milieu chromogénique a été réalisé selon la méthode d'isolement par cadrons.

II.2.2. Purification des espèces de Candida sur gélose Sabouraud-chloramphénicol

La purification des espèces de Candida poussant sur milieu CHROMagar^TM Candida a été réalisée sur des boites de gélose de Sabouraud supplémentée par un antibiotique à large spectre, le chloramphénicol (Bio-rad, France). En effet, la gélose de Sabouraud constitue un milieu sélectif classique pour la culture et l'isolement des levures et des moisissures en particulier les espèces du genre Candida. Pour cela, 45,5 g de la gélose de Sabouraud-chloramphénicol (pH=7) sont chauffés dans un litre d'eau distillée puis autoclavés pendant 15 min à 120°C. Le milieu est coulé dans des boites de Pétri, laissé refroidir puis mises dans l'étuve (37° C) pendant une nuit (Chabasse et al. ,1999). Une fois ensemencées, les boites sont incubées à 37°C pendant 24 à 48h.

II.2.3. Observation microscopique

Après isolement des souches de Candida sur gélose Sabouraud-chloramphénicol, une colonie bien individualisée a été étalée sur une lame contenant une goutte d'eau physiologique stérile et puis fixée par la flamme du bec Bunsen et colorée à la fuschine 1%. Les observations ont été réalisées par un microscope optique (hund H 500 WETZLAR, Germany) au fort grossissement (Gx100) après ajout d'une goutte d'huile à immersion.

II.2.4. Test de floculation

Méthodologie & Protocoles

après la sortie des tubes de l'étuve d'une à deux heures. Le dépôt des cultures cellulaires au fond des tubes en verre témoigne d'un test positif (Noumi et al., 2012). II.2.5. Etude des caractères biochimiques sur galeries Api Candida

Les caractères biochimiques des différents isolats purifiés sur gélose Sabouraud-Chloramphénicol sont déterminés en utilisant le système de galerie Api Candida représenté par une galerie constituée de 10 microtubes contenant des substrats déshydratés pour réaliser 12 tests d'identification. Les réactions produites pendant la période d'incubation se traduisent par des virages colorés spontanés. Après incubation, la lecture de ces réactions se fait à l'aide du tableau de lecture et l'identification est obtenue à l'aide du catalogue analytique ou d'un logiciel d'identification (Tableau I).

Tableau I. Caractères enzymatiques étudiés sur les galeries Api Candida

Tests Composants actifs

1) GLU D-glucose

2) GAL D-galactose

3) SAC D-saccharose

4) TRE D-tréhalose

5) RAF D-raffinose

6) BMAL 4-nitrophényl-BD-maltopyranose

7) áMAL 2-chloro-4-nitrophényl-áD-maltotrioside

8) BXYL 4-nitrophényl-BD-xylopyranoside

9) BGUR 4-nitrophényl-BD-glucuronide

10) URE Urée

11) BNAG (dans tube n°8) 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-acétyl-BDglucosminide

12) BGAL (dans tube n°9) 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-BD-galactopyranoside

Pour cela, le fond et le couvercle d'une boîte Api sont réunis et de l'eau distillée stérile est ajoutée dans les alvéoles pour créer une atmosphère humide. Ensuite, la galerie est déposée stérilement dans la boîte d'incubation. Une suspension fongique très dense est alors préparée à partir de colonies séparées pures et jeunes sur gélose Sabouraud-Chloramphénicol dans une ampoule d'NaCl 0,85% Medium qui sera répartie uniquement dans les tubes en évitant de faire des bulles. Les 5 premiers tests et le dernier sont recouverts d'huile de paraffine stérile. Les galeries sont par la suite incubées pendant 24 h à 37°C.

La lecture de la galerie doit se faire en se référant au tableau de lecture du guide d'utilisateurs. Les tests sont regroupés en groupe de 3, et une valeur (1,2 ou 4) est indiquée pour chacun. A l'intérieur de chaque groupe, les nombres correspondants aux tests positifs sont additionnés. On obtient un nombre de quatre chiffres qui sert de code d'identification. Le

Méthodologie & Protocoles

code est par la suite entré dans la base de données du logiciel Api Web (BioMérieux, France) et l'isolat est ainsi identifié.

III. Etude phénotypique de la résistance des isolats

de Candida spp. aux agents antifongiques

La résistance des différents isolats a été testée vis-à-vis de deux agents antifongiques utilisés dans le traitement des candidoses buccales (Amphotéricine B) et vaginales (Acide borique) selon deux méthodes: sur milieu solide et milieu liquide.

III.1. Test de résistance à l'acide borique

On prépare un milieu de culture de gélose Sabouraud-Chloramphénicol et on lui ajoute 1,8 g d'acide borique/L par filtration en utilisant un filtre seringue de diamètre 0,22 um (IWAKI, Japan). Le milieu est par la suite coulé dans des boites de Pétri, laissé refroidir à température ambiante. Tous les isolats sont repiqués sur ce milieu (technique d'isolement par cdrons) et les boites sont alors incubées de 24 à 48h à 37°C. Si la colonie pousse, elle est donc résistante à l'acide borique sinon la souche est dite sensible à l'acide borique.

III.2. Test de résistance à l'amphotéricine B

III.2.1. Sur milieu solide

La résistance des différents isolats à l'amphotéricine B a été testée selon la méthode CLSI (Wayne, 1997) sur milieu MHGBM (Mueller-Hinton Glucose Bleu de méthylène de composition: MH 38 g, Glucose 2 % et 0,5 ug/ml Bleu de Méthylène). Des disques de papier Wattman stériles de 6 mm de diamètre (Biolife, Milan, Italie) ont été placés sur les tapis de levures (les suspensions ont été ajustées à une _DO520nm=0,4 équivalent à une charge de 10 cellules/ml). L'amphotéricine B est diluée dans du DMSO (diméthylsulfoxyde) 10% de façon à déposer 100 ug/disque (volume déposé: 10 ul). Les boites sont par la suite incubées à 37°C pendant 24 à 48h. L'apparition d'un halo autour de chaque disque traduit l'inhibition de la croissance des levures. La mesure de cette activité consiste à mesurer le diamètre d'inhibition avec une règle plate (L=20 Cm). Si le diamètre est =9 mm la souche est dite résistante (R), si le diamètre est compris entre 10 et 14 mm la souche est dite Sensible Dose Dépendante (SDD) et si le diamètre et supérieur à 15 mm, la souche est dite sensible à l'amphotéricine B.

Méthodologie & Protocoles

III.2.2.Détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice et (CMI) et de la Concentration Minimale Fongicide (CMF)

Les CMIs et CMFs ont été déterminées selon le protocole décrit par Noumi et ses collaborateurs (2009). Des inocula de chaque souche ont été préparés dans l'eau physiologique à partir d'une culture jeune sur gélose Sabouraud-Chloramphénicol et la densité optique a été ajustée _DO520nm=0,4 équivalente à 10 cellules/ml. Une solution mère d'amphotéricine B de concentration (16ug/ml) a été préparée dans le diméthylsulfoxyde à 10% (DMSO). Des dilutions en cascade sont réalisées dans des tubes à hémolyse stériles de 5 ml contenant le DMSO à 10%. Les plaques ELISA à 96 puits (fond rond) ont été préparées de façon que chaque puits contienne 95 ul de bouillon Sabouraud, 5 ul de la suspension fongique et 100 ul de chaque dilution de l'amphotéricine B. Le puits témoin positif contient 195 ul de bouillon Sabouraud stérile et 5 ul de la suspension fongique. Le volume final dans chaque puits est de 200 ul. Après incubation à 37°C pendant 18 à 24 h, les plaques sont lues à l'oeil nu pour la détermination des CMIs et CMFs.

IV. Etude des activités enzymatiques

La production d'enzymes hydrolytiques telles que les aspartylprotéases, les phospholipases, l'estérase et les hémolysines par les espèces de Candida est un facteur de virulence de cette levure (Ibrahim et al., 1995; Hube, 1998) pour cela, nous nous sommes intéressés à l'étude de ces activités.

IV.1. Détermination de l'activité de la phospholipase

Les souches isolées sont transférées dans les tubes contenant 5 ml du bouillon YPD puis incubées à 37C° pendant 18 h. Après incubation, 1,5 ml de la culture fongique sont transférés dans des tubes eppendorf et centrifugés à 3000 rpm pendant 5 min. Le culot obtenu est lavé deux fois par une solution de PBS stérile (PBS: Na₂HPO₄ 7Mm, NaH₂PO₄ 3Mm et NaCl 130Mm, pH=7,2), puis centrifugé à 3000rpm pendant 5 min. La gélose pour tester l'activité phospholipase est préparée (10 g peptone, 30 g glucose, 57,7 g NaCl, 0,55 CaCl₂ et 20 g d'agar agar dans 1 litre d'eau distillée). Après autoclavage et refroidissement du milieu, 100 ml de jaune d'oeuf sont stérilement récupérés et additionné au milieu préparé. Après ajustement de la densité à 0,5 McFarland, un volume de 1ul est mis en triplicate à des points équidistants sur des boites des Pétri qui sont par la suite incubées à 37°C pendant 4 jours. La présence de la phospholipase est déterminée par la formation d'une zone opaque autour des

Méthodologie & Protocoles

colonies. L'activité enzymatique (Pz) est mesurée en calculant le rapport entre le diamètre de colonie et le diamètre de la colonie avec la zone de précipitation. La valeur de PZ est inversement proportionnelle à la nature de l'activité. En effet, si le Pz est égale à 1, la souche est dite phospholipase négative, si Pz est supérieur à (0,63), la souche est dite phospholipase positive et enfin si Pz est inférieur à (0,63), l'activité de phospholipase est très élevée ou fortement positive (Price et al., 1982).

IV.2. Détermination de l'activité de l'aspartylprotéase secrétée

Les étapes de détermination de l'activité de l'aspartylprotéase sont similaires à celles de la phospholipase, la seule différence réside au fait qu'après ajustement de la densité à 0,5 McFarland, un volume de 1 ul est mis en triplicate à des point équidistants sur des boites de gélose préalablement préparées (2g de BSA: Sérum Bovine Albumine; 1,45 g sulfate d'ammonium, 20 g glucose, 20 g agar-agar dans 1 litre d'eau distillée). Les boites de Pétri contenant l'inoculum des différentes souches sont incubées à 37 C° pendant 7 jours (Aoki et al., 1990).

La sécrétion de l'aspartylprotéase par les isolats testés est déterminée par la formation d'un halo clair autour des colonies et l'activité enzymatique (Pz) est mesurée de la même façon que celle pour la phospholipase tout en divisant le diamètre de la colonie par le diamètre total (le diamètre de la colonie avec la zone de précipitation). Nous différencions quatre classes d'activité de cette enzyme: une activité très faible (0,9<Pz<1), une activité faible (0,8<Pz<0,89), une activité élevée (0,7<Pz<0,79) et une activité très élevée (Pz<0,69).

IV.3. Détermination de l'activité de l'estérase

La détermination de cette activité a été réalisée en adoptant la méthode décrite par Ge et al. (2011). Les étapes de détermination de l'activité de l'estérase sont similaires à celles de la phospholipase. Après ajustement de la densité à 0,5 McFarland, un volume de 1ul est mis en triplicate à des points équidistants sur des boites de gélose d'estérase préalablement préparée (10 g peptone, 5 g NaCl, 0,1 g CaCl2 et 15 g agar-agar dans 1 litre d'eau distillée; pH 6,8). Après autoclavage et refroidissement du milieu, 50 ml de Tween 80 sont stérilement additionnés au milieu préparé. Les boites de Pétri contenant l'inoculum des différents isolats sont incubées à 37°C pendant 10 jours. La présence de l'estérase est déterminée par la formation d'une zone opaque autour des colonies. L'activité enzymatique (PZ) est mesurée en calculant le rapport entre le diamètre de la colonie et le diamètre de la colonie avec la zone de précipitation (Diamètre total). La valeur de PZ est inversement proportionnelle à la nature

Méthodologie & Protocoles

de l'activité. En effet, si la valeur du PZ est égale à 1, la souche est dite estérase négative, si PZ est supérieur à 0,63, la souche est dite estérase positive, enfin si PZ est inférieur à 0.63, l'activité estérase est très élevée ou fortement positive.

IV.4. Etude de pouvoir hémolytique

La production d'hémolysines par les espèces de Candida isolées des différentes phases de traitement des lixiviats à Borj-Chakir a été évaluée en utilisant la technique décrite par Manns et ses collaborateurs (1994). Les souches purifiée sur gélose sabouraud-chloramphénicol sont récupérées et lavées avec une solution saline stérile (PBS, pH 7,2). Une suspension de 10 cellules /ml a été préparée en ajustant sa densité optique à 0,4 sous une longueur d'onde de 520nm (Samaranayake et Mac Farlane, 1981). Un microlitre de cette suspension est inoculé sur gélose au sang du mouton enrichie par du glucose (3%). La gélose au sang du mouton enrichie par du glucose a été préparée en ajoutant 7 ml de sang frais de mouton à 100 ml de gélose de sabouraud-chloramphénicol supplémentée avec 3% de glucose (m/v). Le pH final du milieu ainsi préparé est de 5,6#177;0,2.

Les boites sont incubées à 37 °C sous atmosphère à 5% de CO₂ pendant 48 h. La présence d'halo translucide autour de l'inoculum témoigne d'une activité hémolytique positive. Le rapport des diamètres de la zone de lyse et celui de la colonie est considéré comme un indice hémolytique pour présenter l'intensité de la production d'hémolysines par les différentes espèces de Candida (Wu et al., 1996). L'analyse est réalisée en triplicate et à deux occasions séparées pour chaque isolat. Trois différents types d'hémolyse peuvent être observés sous la lumière autour de la colonie de Candida (Yigit et Aktas, 2009). Le premier type est caractérisé par un anneau translucide relatif à une bêta hémolyse et le second est un halo verdâtre à noirâtre correspondant à l'alpha hémolyse et le dernier qualifié de gamma hémolyse (pas d'activité). Le calcul de l'indice d'hémolyse a été fait en adoptant la formule proposée par Yigit et Aktas (2009) tout en divisant le diamètre de la colonie par le diamètre total (diamètre de la colonie additionné du diamètre de la zone d'hémolyse). Cet indice donne une idée sur l'intensité de production des hémolysines par les souches de Candida.

IV.5. Identification des enzymes par les galeries Api ZYM

Le système Api ZYM est une micro méthode semi quantitative pour la recherche des activités enzymatiques applicable à des différents types d'échantillons (microorganismes, suspensions cellulaires, tissus, liquides biologiques, etc.). Il permet d'étudier rapidement et simultanément 19 activités enzymatiques à partir de très faibles quantités d'échantillons. La

Méthodologie & Protocoles

galerie Api ZYM contient 20 cupules spécialement adaptées à l'étude des réactions enzymatiques. Les tests enzymatiques sont inoculés avec une suspension dense, qui réhydrate les substrats. Les réactions produites pendant la période d'incubation (4h) se traduisent par des virages colorés révélés par l'addition des réactifs Zym A et Zym B (Tableau II).

En effet, 100 ìl de la suspension de chaque isolat de levure sont utilisés pour inoculer les différentes cupules des galeries Api Zym. Après 4 h d'incubation à 37°C, les réactifs Zym A et Zym B sont ajoutés dans les différentes cupules et les galeries sont soumises après 5 min de réaction à la lumière blanche pour la révélation des différentes réactions enzymatiques (variation de couleurs). Les couleurs obtenues sont comparées à celles décrites dans le manuel d'utilisation fourni par le fabriquant.

Tableau II. Caractères enzymatiques étudiés sur les galeries Api Zym (BioMérieux).

N°	Enzyme recherchée	Substrats
1	Témoin
2	Phosphatase alcaline	2-naphtol phosphate
3	Estérase (C4)	2-naphtol butyrate
4	Estérase Lipase (C8)	2-naphtol caprylate
5	Lipase (C14)	2-naphtolmyristate
6	Leucine arylamidase	L-leucyl-2-naphtylamide
7	Valine arylamidase	L-valyl-2- naphtylamide
8	Cystine arylamidase	L-cyctil-2- naphtylamide
9	Trypsine	N-benzoyl-DL-arginine-2- naphtylamide
10	á-chymotrypsine	N-glutaryl-fenylalanine-2- naphtylamide
11	Phosphatase acide	2-naphtyl phosphate
12	Naphtol-AS-BI -phosphohydrolase	Naphtol-AS-BI-phosphate
13	á-galactosidase	6-Br-2-naphtyl-áD-galactopyranoside
14	3-galactosidase	2-naphtyl-3D- galactopyranoside
15	3-glucuronidase	Naphtol-AS-BI-3D-glucuronide
16	á-glucosidase	2-naphtyl-áD-glucopyranoside
17	3-glucosidase	6-Br-2-naphtyl-3D-glucosaminide
18	N-acétyl-3-glucosaminidase	1-naphtyl-N-acétyl-3D-glucosaminide
19	á-mannosidase	6-Br-2-naphtyl-áD-monnopyranoside
20	á-fucisidase	2-naphtyl-áL-fucopyranoside

V. Etude qualitative et quantitative de l'adhésion des

souches de Candida isolées

Pour expliquer la persistance des souches de Candida dans les différentes phases de traitement des lixiviats, nous avons testé la capacité de ces levures à s'adhérer et à former un

Méthodologie & Protocoles

biofilm sur une surface inerte qui est le polystyrène ainsi que la production de « slime » ou exopolysaccharides sur milieux liquide et solide.

V.1. Etude qualitative de l'adhésion V.1.1. Coloration à la safranine

La production de « slime » ou exopolysaccharides a été déterminée selon la technique décrite par (Noumi et al., 2011). Brièvement, quelques colonies de Candida cultivées sur gélose Sabouraud dextrose agar ont été inoculées dans les tubes contenant 10 ml de bouillon Sabouraud supplémenté avec du glucose à 8%. Les tubes ont été incubés pendant 24 h à 35°C, puis égouttés et colorés avec 5 ml de safranine 1% pour vérifier la présence ou l'absence d'un culot. La production de slime par chaque isolat est considérée faible (+), moyenne (++), ou forte (+++) selon l'intensité du culot obtenu. Le résultat a été lu par trois observateurs différents.

V.1.2. Production de « slime » sur gélose préparée au rouge Congo

L'aptitude de souche de Candida à produire un biofilm a été évaluée sur milieu rouge Congo en utilisant la technique décrite par Dag et al. (2010). Ce milieu est préparé en ajoutant 0,8 g de rouge Congo (Sigma, France) et 80 g de glucose (Labosi, France) à un 1itre de gélose coeur cervelle (Bio-rad, France). Le milieu a été autoclavé à 115 C° pendant 10 min. Les boites sont incubées pendant 24 h à 37°C en aérobie, suivi d'une nuit à l'obscurité à température ambiante. Les souches productrices de biofilm « slime Producer » apparaissent sous forme de colonies noires, tandis que les souches biofilm négatif sont non pigmentées (blanches, roses avec un point noir au centre).

V.2. Etude quantitative de l'adhésion V.2.1. Test de hydrophobicité

L'hydrophobicité des souches de levures est mesurée selon le protocole décrit par Rosenberg et ses collaborateurs (1983). Le test consiste à mesurer l'adhésion de cette levure au cyclohexane (hydrocarbure) et au xylène .Pour cela, les isolats de levures sont incubés toute une nuit dans 5 ml de bouillon YPD à 28 C°. Les cellules de Candida sont par la suite lavées avec du PBS et leur densité optique (DOi) est ajustée à 1 (DO600 nm =1). Pour le test d'adhésion, 3 ml de la suspension de levure sont mélangés avec 150 ul de cyclohexane ou xylène et dans un tube en verre lavé avec de l'acide sulfurique.

Méthodologie & Protocoles

Le mélange est agité (vortex) durant 1 min puis laissé à température ambiante de 20 min à 1 h. L'absorbance (Af) de la phase aqueuse est mesurée à 600 nm puis comparée avec l'absorbance initiale (A ). Le pourcentage des cellules adhérentes formant une membrane fine à la surface des solvants testés (le cyclohexane et le xylène) est déterminé pour estimer le pourcentage l'hydrophobicité des souches de levure selon l'équation suivante (I).

(I) % d'hydrophobicité= [(DOi-DOf)/DOi] x 100

V.2.2. Adhésion des Candida spp. sur les plaques en polystyrène

Afin de quantifier la formation de biofilm formé par les différentes espèces de Candida isolées, nous avons recours à une première méthode basée sur un dosage spectrophotométrique du Cristal violet 1% dans des plaques ELISA 96 puits à font rond et une deuxième technique colorimétrique basée sur la réduction du 2,3- bis (2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5 [(phénylamino) carbonyl]-2H-tétrazolium (XTT) en un composé coloré hydrosoluble (le formazan) sous l'effet de la déshydrogénase mitochondriale des Candida dans des plaques ELISA de 96 puits à font plat (Hawser, 1998b).

Toutes les espèces de Candida spp. ont été cultivées pendant 18h à 37°C sur milieu Sabouraud- Chloramphénicol. Par la suite, les souches ont été incubées dans un bouillon YNB (Yeast Nitrogen Base; Sigma - Aldrich, St Louis, Mo, India) supplémenté par 100 Mm de glucose (18g/l). Après une nuit de culture, les levures ont été récupérées à la fin de la phase exponentielle de croissance et lavées deux fois avec 5 ml d'une solution saline tamponnée (PBS; pH 7,2). Une suspension de 10 cellules/ ml a été préparée en ajustant la densité optique à 0,4 mesurée à 520 nm.

Les biofilms ont été produits sur des plaques ELISA en polystyrène à 96 puits et à fond plat pour le XTT et à fond rond pour le Cristal violet 1% (Nunc, Roskilde, Danemark) selon le protocole précédemment décrit par Noumi et ses collaborateurs (2010). Cent microlitres de la suspension cellulaire (10 cellules/ml) sont transférés dans les puits de chaque type de plaques à l'aide d'une micropipette. Les plaques sont incubées à 37°C durant 1 h 30 min dans un shaker à 75 rpm pour permettre à la levure d'adhérer aux surfaces des puits (Kuhn al., 2002). Pour chaque plaque, trois puits ne renfermant pas la suspension de Candida sont considérés comme témoin négatif.

Après la phase d'adhésion, les suspensions de cellules ont été aspirées et les plaques ont été lavées deux fois avec 150 ul de PBS stérile pour enlever les cellules non adhérentes. Cent microlitres du bouillon YNB ont été alors transférés dans chaque puits et les plaques ont

Méthodologie & Protocoles

été incubées à 37° C dans un shaker à 75 rpm. Les biofilms ont été développés durant 66 h et la viabilité cellulaire a été mesurée par analyse de la réduction du XTT (cellule viables) et au Crystal violet (cellules fixées). Le milieu a été renouvelé quotidiennement par aspiration du milieu épuisé et addition d'un nouveau milieu chaque jour. Toutes les analyses ont été effectuées en triplicate (Melo et al ., 2006).

L'analyse de la réduction du XTT est réalisée selon la technique décrite par Kuhn et ses collaborateurs (2002). Brièvement, la solution de XTT (1 mg/ml de PBS; Sigma-Aldrich, Inc.Germany) a été préparée et stérilisée par filtration à travers un filtre de 0,22 um de porosité (Millipore, Satorius Minisart CE 0297, Germany) puis stockée à -70°C. La solution de ménadione (0,4 mM dans l'acétone; Sigma-Aldrich, St Louis, Mo., Switzerland) a été préparée et stérilisée par filtration (filtre 0,22 um juste avant chaque analyse). Avant chaque essai, la solution de XTT et décongelée et mélangée avec la solution de ménadione (5 :1; v/v). Les biofilms ont été lavés cinq fois avec 200 ul de PBS stérile puis nous avons ajouté 200 ul de PBS additionnés par 12 ul de la solution de XTT-ménadione. Les plaques ont été incubées à l'obscurité pendant 2 h à 37 °C.

Pour la méthode au Cristal violet 1%, les biofilms ont été lavés cinq fois avec 200 ul de PBS stérile et colorés avec 200 ul de Cristal violet 1% pendant 15 min. Les plaques sont séchées en position inversée. Les puits sont lavés de nouveau avec du PBS stérile et le Crystal violet a été solubilisé dans 200ul d'une solution éthanol-acétone (80:20 v/v).

Après incubation, 100 ul de la solution ont été transférés dans de nouveaux puits et le changement de couleur de la solution a été mesuré avec un lecteur ELISA (BioRad, France) à 492 nm pour les plaques contenant le XTT et à 595 nm pour le Cristal violet 1%. Les valeurs des absorbances pour les puits témoin ont été alors soustraites des valeurs des puits inoculés par les suspensions pour éliminer les faux résultats dus à l'interférence de fond (Ramage et

al., 2001).

RÉSULTATS

Résultats

I. Caractérisation phénotypique des espèces de

Candida spp. isolées

1. Etude morphologique

1.1. Caractéristiques macroscopiques

Sur milieu chromogénique, plusieurs morphotypes sont décrits pour les échantillons analysés (Tableau III): colonies de couleur bleue, colonie de couleur blanche et colonies de couleur rose ou blanche à centre rose, colonies de couleur mauve et colonies de couleur beige (Figure 5).

Figure 5. Les principaux morphotypes obtenus sur milieu CHROMagar^TM Candida (A): colonies de couleur bleue; (B): colonies de couleur blanche à centre rose; (C): clonies de couleur turquoise.

L'examen macroscopique des espèces de Candida cultivées en aérobiose à 37°C sur gélose Sabouraud-Chloramphénicol (pH 7,2) montre qu'il s'agit de colonies crémeuses, lisses, rondes et bombées (Figure 6) ayant une odeur de levure. La croissance de Candida sur ce milieu sélectif nous a permis de remarquer que la couleur des colonies est variable selon l'espèce. En effet, sur la gélose Sabouraud-Chloramphénicol, C. albicans est blanchâtre.

Figure 6. Observation microscopique des colonies de Candida sur gélose Sabouraud-Chloramphénicol. (A): colonies blanches ou crémeuses et lisses; (B): colonies grandes et

sèches.

Résultats

Tableau III. Couleur des isolats obtenue sur milieu CHROMagar^TM Candida en fonction de l'origine d'isolement.

Code	Origine	Milieu	Couleur obtenue
M1	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie blanche à centre rose
M2	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie bleue
M5	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie bleue
M7	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie bleue
M8	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie beige
M9	E8	CHROMagar^TM Candida	Colonie blanche à centre rose
M10	E8	CHROMagar^TM Candida	Colonie blanche à centre rose
M11	E8	CHROMagar^TM Candida	Colonie rose
M13	E7	CHROMagar^TM Candida	Colonie blanche à centre rose
M14	E7	CHROMagar^TM Candida	Colonie blanche
M16	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie beige
M17	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie beige
M18	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie blanche à centre rose
M19	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie bleue
M20	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie mauve
M21	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie bleue
M22	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie blanche
M23	E10	CHROMagar^TM Candida	Colonie mauve
M24	E2	CHROMagar^TM Candida	Colonie bleue
M25	E2	CHROMagar^TM Candida	Colonie bleue
M28	E10	CHROMagar^TM Candida	Colonie mauve claire
M30	E1	CHROMagar^TM Candida	Colonie mauve claire
M31	E1	CHROMagar^TM Candida	Colonie grande blanche
M32	E4	CHROMagar^TM Candida	Colonie blanche
M36	E2	CHROMagar^TM Candida	Colonie beige
M39	E2	CHROMagar^TM Candida	Colonie bleue
M40	E2	CHROMagar^TM Candida	Colonie blanche
M41	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie mauve
M42	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie mauve
M43	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie blanche à centre rose
M44	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie blanche à centre rose
M45	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie mauve
M46 M47	E5 E5	CHROMagar^TM CandidaCHROMagar^TM Candida	Colonie mauve Colonie bleue
M49	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie grande blanche à centre
M50	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie grande blanche à centre
M56	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie mauve
M57	E5	CHROMagar^TM Candida	Colonie bleue

1.2. Caractéristiques microscopiques

L'aspect microscopique de toutes les espèces de Candida est semblable. L'observation microscopique des cellules de Candida au grossissement (*100) a montré qu'on a 62,16 % de souches de forme ovalaire (Figure 7A) de 2 à 8 um de diamètre. Les autres 37,83% de souches ont une forme allongée ou en forme de grain de riz (Figure 7 B).

Résultats

Figure 7. Observation microscopique des cellules de Candida colorées à la fushine au microscope optique (G*100). (A) : cellules de Candida de forme ovoïde, (B) : cellules de Candida ayant la forme des grains de riz.

2. Différentes espèces de Candida spp. Isolées à partir de la station de traitement des lixiviats de Djebel Chakir

L'identification des souches a été réalisée par les galeries Api Candida pour 37 isolats. Par la suite, l'interprétation des résultats a été effectuée par le logiciel Api Web (bioMérieux, France). Deux genres sont identifiés : Candida et Saccharomyces regroupent les espèces suivants isolées C. albicans, C. krusei, C. famata, C. tropicalis, C. guilliermondii et C. lusitaniae et l'espèce Saccharomyces cerevisiae (Tableau IV).

Tableau IV. Différentes espèces de levures isolées à partir de la station de traitement des lixiviats de Djebel Chakir en se basant sur les caractères obtenus sur les galeries Api Candida.

Espèces identifiées	Nombre	Codes obtenu sur Api Candida
C. albicans C. krusei	15 14	7512 ; 7712 ; 4512 1000 ; 1010 ; 1020 ; 1030
C. famata	3	2100 ;	3100	; 5100
C. tropicalis	2		7710
C. guilliermondii	1		7320
C. lusitaniae	1		7520
Saccharomyces cerevisiae	1		7300

Nous avons noté au cours de ce travail que les deux espèces isolées est C. albicans (n =15) et C. krusei (n=14) sont majoritairement isolées. Les profils biochimiques des différentes espèces de Candida isolées sont illustrés dans le tableau V ci-dessous.

Résultats

Tableau V. Origine, fo rme et caractères biochimiques des levures isolées et testées par les galeries Api Candida (BioMérieux, France).

Isolats testés Origine	Date de prélèvement	Forme*	Identification biochimique par Api Code Identification (%)
Candida albicans
M2 E5	25/11/2011	Ovale	4512	C. albicans	ND
M5 E5	25/11/2011	Ovale	7712	C. albicans	61,7
M7 E5	25/11/2011	Ovale	7712	C. albicans	61,7
M8 E5	25/11/2011	Ovale	7712	C. albicans	61,7
M16 E5	06/01/2012	Ovale	7512	C. albicans	70,1
M20 E5	06/01/2012	Ovale	7512	C. albicans	70,1
M21 E5	06/01/2012	Ovale	7512	C. albicans	70,1
M24 E2	25/11/2011	Ovale	7512	C. albicans	70,1
M25 E2	06/01/2012	Ovale	7512	C. albicans	70,1
M36 E2	06/01/2012	Ovale	7512	C. albicans	70,1
M42 E5	06/01/2012	Ovale	7512	C. albicans	70,1
M45 E5	06/01/2012	Ovale	7512	C. albicans	70,1
M47 E5	06/01/2012	Ovale	7512	C. albicans	70,1
M56 E5	06/02/2012	Ovale	7712	C. albicans	61,7
M57 E5	06/02/2012	Ovale	7512	C. albicans	70,1
Candida krusei
M13 E7	25/11/2011	Grains de riz	1000	C. krusei	97,6
M22 E5	06/01/2012	Grains de riz	1030	C. krusei	ND
M30 E1	06/01/2012	Grains de riz	1000	C. krusei	97,6
M31 E1	06/01/2012	Grains de riz	1020	C. krusei	87,6
M32 E4	06/01/2012	Grains de riz	1010	C. krusei	99,5
M39 E2	06/01/2012	Grains de riz	1000	C. krusei	97,6
M40 E2	06/01/2012	Grains de riz	1020	C. krusei	87,6
M41 E5	06/01/2012	Grains de riz	1000	C. krusei	97,6
M43 E5	06/01/2012	Grains de riz	1000	C. krusei	97,6
M44 E5	06/01/2012	Grains de riz	1000	C. krusei	97,6
M49 E5	06/02/2012	Grains de riz	1000	C. krusei	97,6
M17 E5	06/01/2012	Grains de riz	1000	C. krusei	97,6
M18 E5	06/01/2012	Grains de riz	1020	C. krusei	87,6
M50 E5	06/02/2012	Grains de riz	1020	C. krusei	87,6
Candida famata
M9 E8	25/11/2011	Ovale	5100	C. famata	99,2
M10 E8	25/11/2011	Ovale	2100	C. famata	57,6
M11 E8	25/11/2011	Ovale	3100	C. famata	57,6
C. tropicalis M28 E10	06/01/2012	Ovale	7710	C. tropicalis	95,7
M46 E5	06/01/2012	Ovale	7510	C. tropicalis	99,9
C. lusitaniae M1 E5	25/11/2011	Ovale	7520	C. lusitaniae	99,3
C. guilliermondii M14 E7	25/11/2011	Ovale	7320	C. guilliermondii	96,5
Saccharomyces cerevisiae M23 E10	06/01/2012	Ovale	7300	S. cerevisiae	98,8

ND : Non Déterminé par le logiciel API WEB;

3. Test de floculation

Après incubation de 24 h dans l'étuve 37 ° C, nous avons pu remarquer que toutes les souches testées floculent dans le bouillon Sabouraud-Chloramphénicol avec dépôt des cellules

au fond des tubes (culot blanc).

Résultats

4. Test de résistance à l 'a cide borique

Le but de la réalisation de ce test est de voir le taux de sensibilité ou de résistance des souches de Candida sur un milieu qui contient de l'acide borique (agent antifongique). On a pu remarquer que 22 souches parmi 43 poussent après incubation de 24 h à 37 °C. En effet, ces dernières sont résistantes à l'acide borique. Les autres souches sont alors considérés sensibles.

II. Activité anti fo

ngique

disque

1. Méthode de diffusion de

Sur milieu MHGBM, nous avons montré que toutes les souches testées ne répondent pas de la même façon à l'amphotéricine B (100 ug/disque). En effet, seize souches sont résistantes à l'amphotéricine B puisque les diamètres d'inhibition de la croissance sont inférieurs à 9 ; treize souches sont sensibles à l'amphotéricine B pu i sque les diamètres d'inhibition de la croissance sont compris entre 10 et 14 mm, alors que q uatorze souches ont une susceptibilité dose dépendante avec des diamètres d'inhibition de la cr oissance supérieurs à 15 mm (Figure 8).

Figure 8. Détermination des diamètres des zones d'inhibition de la croissance des levures sur milieu Mueller-Hinton-Glucose-Bleu de Méthylène par l'amphotéricine B (100 ug/disque). (A): Souche résistante; (B): Souche à Sensibilité Dose Dépendante; (C): Souche sensible.

(CMI) et de la

2. Détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice Concentration Minimale Fongicide (CMF)

La détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMIs) et des concentrations minimales fongicides (CMFs) a été faite selon une lecture visuelle. Les valeurs

Résultats

de CMIs sont comprises entre 0,015 et 0,0312 ug/ml alors que les CMFs varient de >0,5 à >16 ug/ml. Tous ces résultats sont résumés dans le tableau VI ci-dessous.

Tableau VI. Résistance phénotypique

l'amphotéricine B (sur milieu MHGBM et sur

vis-à-vis de

milieu liquide) et à l'acide borique.

des différentes souches testées

Souche

	Résistance à l'acide borique (1,8 g/L)	Amph otéricine B
		Sur milieu MHGBM* Milieu liquide (100ug/disque) (ug/ml) ZI#177;DS* Interprétation CMIs CMFs
Candida albicans
C. albicans ATCC 2091	Sensible	6#177;0	R	0.0312	>16
C. albicans ATCC 90028	Sensible	6#177;0	R	0.0312	>16
C. albicans SC5314	Sensible	6#177;0	R	0.015	>4
M2	Résistante	6#177;0	R	0.015	=8
M5	Résistante	17#177;1	S	0.015	>8
M7	Résistante	15#177;1	S	0.015	>8
M 8	Sensible	20#177;0	S	0.015	>16
M16	Résistante	19#177;1	S	0.0312	>4
M20	Résistante	13#177;1	SDD	0.015	>8
M2 1	Sensible	19#177;0	S	0.0312	>0.5
M24	Résistante	14,33#177;0,5	SDD	0.0312	>4
M25	Résistante	13,33#177;1,52	SDD	0.0312	>4
M36	Résistante	14,33#177;3,21	SDD	0.015	>4
M42	Sensible	16,33#177;0,57	S	0.015	>2
M45	Résistante	18#177;1	S	0.0312	>4
M47	Résistante	16,33#177;2,30	S	0.015	>4
M56	Résistante	17#177;1	S	0.015	>4
M57	Résistante	18#177;1,73	S	0.015	>4
Candida krusei
C. krusei ATCC 6258	Résistante	18#177;1	S	0.015	>16
C. krusei 05 (054)	*	*	*	0.015	>8
M1 3	Sensible	13#177;1	SDD	0.0312	>16
M22	Résistante	11,33#177;0,57	SDD	0.0312	>16
M30	Résistante	7,67#177;0,57	R	0.015	>16
M31	Résistante	9,67#177;1,15	SDD	0.015	>16
M32	Sensible	13,67#177;0,57	SDD	0.015	>16
M39	Sensible	14,67#177;1,15	SDD	0.015	>4
M4 0	Sensible	7,33#177;0,57	R	0.0312	>16
M4 1	Sensible	6,67#177;0,57	R	0.015	>16
M43	Sensible	11,67#177;0,57	SDD	0.015	>4
M44	Résistante	12#177;1	SDD	0.0312	>4
M49	Sensible	9#177;1	R	0.015	>4
M1 7	Sensible	9#177;1	R	0.0312	>16
M18	Résistante	12,67#177;0,57	SDD	0.015	>16
M5 0	Sensible	9#177;0	R	0.015	>2
Candida famata
C. famata V 2	Sensible	6#177;0	R	0.015	>1
M9	Résistante	6,33#177;057	R	0.015	>16
M1 0	Sensible	10,67#177;0,57	SDD	0.015	>16
M1 1	Sensible	18,33#177;1,52	S	0.0312	>16
Candida tropicalis
C. tropicalis 06(085 )	*	*	*	0.015	>16
M28	Résistante	15,67#177;0,57	S	0.015	>4
M46	Résistante	6#177;0	R	0.015	>2

Sensible 7,33#177;0,57 R

Sensible 6#177;0 R

Sensible 9,33#177;057 R

14#177;1 S DD

Candida lusitaniae

C. lusitaniae CECT 11458

M1

Candida guilliermondii

M1 4

Saccharomyces cerevisiae

M23 Résistante

0.015 >16

0.015 >1

0.015 >16

0.0312 >4

*MHGBM: gélose Mueller-Hinton Glucose

Bleu de Méthylène; ZI: Diamètre de la zone d'inhibition; DS: Déviation

Standard; R: Résistante; S: Sensible; SDD: Susceptibilité Dose Dépendante; *: Non testé.

de l'aspartylprotéase présente une variation intra et inter-espèces (Figure 1 0).

Résultats

III. Etude de la	virulence des différentes		espèces de
Candida spp. isolées 1. Détermination de l'activité		de la phospholipase

Parmi les 43 souches testées dont celles isolées à partir de la station de traitement des

lixiviats de Borj Chakir, 19

souches ont une activité phospholipase positive (PZ >0,63) révélée par la présence d'un halo opaque autour des colonies sur gélose à base de jaune d'oeuf, 14 souches ont une activité phospholipase négative (PZ = 1) et 10 souches ont une activité fortement positive (PZ<0,63). Les valeurs de PZ qui sont inversement proportionnelles à la nature de l'activité, se sont étendues de 0,48 à 0,63 (Figure 9).

A travers notre étude, nous avons aussi remarqué que la nature de l'activité de cette enzyme varie d'une souche à une autre d'une même espèce. En effet, au sein de l'espèce C. albicans, nous avons décelé deux types d'activité (négative et positive) .(figure9)

Figure 9. Aspect de l'activité de la phospholipase sur gélose à base de jaune d'oeuf. (A):
Souche phospholipase négative; (B): Souche phospholipase positive.

2. Détermination de l'activité de l'aspartylprotéase secrétée

L'incubation des colonies de levures pendant 8 jours à 37 °C sur la gélose à base de BSA a montré que parmi les 43 souches testées, 32 ont une activité protéase très élevée (PZ < 0,69), deux ont une activité élevée (PZ=0,7), trois isolats ont une activité faible (0,8<PZ<0,89) et 6 présentent une activité très faible ou pas d'activité (PZ =1). Pour l'espèce la plus fréquente, C. albicans , les activités varient de très faible à très élevée alors que toutes les souches de C. krusei possèdent une activité aspartylprotéase secrétée très élevée.

Pendant notre étude, nous

avons remarqué que la distribution des valeurs

de l'activité

Résultats

Figure 10. Différents exemples de l'activité de la protéase obtenue sur gélose à base de BSA.
(A): Absence d'une activité; (B): Activité faible; (C): Activité élevée; (D): Activité très

élevée.

3. Détermination de l'activité de l'estérase

L'incubation des colonies de Candida pendant 10 j à 37°C sur l a gélose de base de Tween 80 à montré que parmi les 43 souches testées, 20 souches ont une activité estérase négative (PZ) = (1), 12 souches ont une activité estérase positive (PZ>0.6 3) et 11 souches ont une activité estérase fortement positive (PZ<0,63).

4. Etude de pouvoir hémolytique

Les résultats ont montré qu'après 48 h d'incubation sur gélose au sang du mouton sous atmosphère à 5% CO2, la plupart des espèces de Candida ont la possibilité de dégrader l'hémoglobine par lyse des érythrocytes. Trois différents types d'hémolyse ont été observés sous la lumière autour de la colonie ensemencée: le premier type est caractérisé par un anneau translucide relatif à une hémolyse de type alpha et le second type est caractérisé par un halo verdâtre à noirâtre correspondant à une béta hémolyse (Figure 11 ). Le dernier type caractérisent les souches non hémolytiques (gamma-hémolytiques). En effet, 19 souches sont â hémolytiques, 17 á hémolytiques et sept souches sont de type gamma.

Figure 11. Aspect des

colonies ayant un pouvoir hémolytique de type â sur gélose à base de sang de mouton.

Résultats

L'ensemble des résultats des activités enzymatique est résumé dans le Tableau VII ci -dessous.

Tableau VII. Activités enzymatiques (phospholipase, estérase et aspartylprotéase) et pouvoir hémolytique des différentes souches isolées.

Les différentes enzymes hydrolytiques testées

Isolats testés

Phospholipase

Estérase Aspartyl

protéase Pouvoir

Pz#177;DS Interprétation Pz#177;DS Interprétation Pz#177; DS Interprétation (IH)* Type

C. albicans

C. albicans ATCC 2091 0,76#177;0,09 Positive

C.albicans ATCC 90028 0,73#177;0,06 Positive

C. albicans SC 5314 0,86#177;0,015 Positive

M2 0,78#177; 0,41 Positive

M5 1#177;0 Négative

M7 1#177;0 Négative

M8 0,75#177;0,09 Positive

M16 1#177;0 négative

M20 0,71#177;0 Positive

M21 1,18#177;0,01 Positive

M24 0,62#177;0,09 Fortement positive

M25 0,58#177;0,065 Fortement positive

M36 0,66#177;0,02 Positive

M42 0,62#177;0,04 Fortement Positive

M45 1#177;0 Négative

M47 1#177;0 Négative

M56 0 ,58#177;0,01 Fortement positive

M57 0,57#177;0,08 Fortement positive