Cristallographie de deux enzymes : mutant de l'uridine monophosphate kinase d' E. coli insensible à la régulation allostérique et la cytokinine oxydase

Abréviations

aa : acide aminé

ADN : acide désoxyribonucléique AMP : adénosine monophosphate ATB : antibiotique

ATP : adénosine triphosphate

CKO : cytokinine oxydase

CKOm : cytokinine oxydase de maïs

CMP : cytidine monophosphate

CMPK: cytidine monphosphate kinase

CNRS : centre national de recherche scientifique

CTP : cytosine triphosphate

FAD: flavine adenine dinucléotide

GMP: guanosine monophosphate

GTP: guanosine triphosphate

MM : masse moléculaire

^{MPD : 2-méthyl-2,4-pentanediol ; C}6^H14^O2

NAGK : N-acétyl glutamate kinase

NDP : nucléoside diphosphate NMP : nucléoside monophosphate NTP : nucléoside triphosphate

NDPK : nucléoside diphosphate kinase

NMPK : nucléoside monophosphate kinase pI : point isoélectrique

PCR: polymerase chain reaction

SDS-PAGE : sodium dodecyl sulphate - polyacrylamide gel electrophoresis

TMP : thymidine monophosphate

UDP : uridine diphosphate

UMP : uridine monphosphate

UMPK: uridine monphosphate kinase

UMPKeco : uridine monphosphate kinase d'E. coli

UTP : uridine triphosphate

Liste des Encadrés / Figures / Tableaux

Encadrés-----------------------------------------------------------------------------

Encadré 1 : Vérification de la concentration protéique par absorption dans l'UV........................... ²⁹

Encadré 2 : Concentration de la protéine............................................................................ ²⁹

Figures-------------------------------------------------------------------------------

^{Figure 1 : Nombre de structures 3D résolues par cristallographie, déposées et accessibles dans la PDB...} 8

^{Figure 2 : Evolution de la cristallographie des protéines...........................................................} 10

^{Figure 3 : De la protéine à sa structure 3D...........................................................................} 11

^{Figure 4 : Les NMPK et la phosphorylation des NMP.............................................................} 13

^{Figure 5: Les trois domaines des NMPK..................................................................................} 15

^{Figure 6 : Régulation de l'activité de l'UMPKeco...................................................................} 16

^{Figure 7 : Repliement global de l'UMPKeco : le monomère......................................................} 18

^{Figure 8 : Repliement global de l'UMPKeco : l'hexamère fonctionnel..........................................} 18

^{Figure 9 : Formules de quelques cytokinines et d'un inhibiteur ...................................................} 20

^{Figure 10 : Dégradation des cytokinines par la CKOm.............................................................} 20

^{Figures 11 a) et b) : Structure 3D et sites de mutagenèse de la CKOm..........................................} 22

^{Figure 12 : La cristallisation..................................................................................................} 24

^{Figure 13 : Mosaïcité d'un cristal.....................................................................................} 24

^{Figure 14 : Diagramme de phase bidimensionnel...................................................................} 25

^{Figure 15 : Technique de la goutte assise............................................................................} 25

^{Figure 16 : Photos du robot de Cristallisation et de la boite Linbro............................................} 30

^{Figure 17 a): Méthode de cristallisation en goutte suspendue.....................................................} 33

^{Figure 17 b) : Montage des cristaux sur des boucles en nylon....................................................} 33

^{Figure 17 c) : Collecte des données de diffraction..................................................................} 33

^{Figure 18 : Suivi de la pureté de l'UMPKeco D159N D93A par SDS-PAGE.....................................} 35

^{Figure 19 : Cristaux de l'UMPKeco D159N D93A................................................................} 36

^{Figure 20 : Cristaux de la CKOm.....................................................................................} 39

^{Tableaux-----------------------------------------------------------------------------}

^{Tableau 1 : Structures 3D résolues par les différentes techniques analytiques déposées dans la PDB......} 8

^{Tableau 2 : Résumé de la variabilité des conditions de cristallisation de l'UMPKeco D159N D93A.......} 35

^{Tableau 3 : Cristaux de l'UMPKeco D159N D93A : Conditions d'obtention et dimensions.................} 35

^{Tableau 4 : Résumé de la variabilité des conditions de cristallisation de la CKOm...........................} 38

^{Tableau 5 : Cristaux de la CKOm : Conditions d'obtention et dimensions.....................................} 38

^{Tableau 6 : Enregistrement des données de diffraction............................................................} 39

^{Tableau 7 : Résultats du traitement des données....................................................................} 40