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Cristallographie de deux enzymes : mutant de l'uridine monophosphate kinase d' E. coli insensible à la régulation allostérique et la cytokinine oxydase

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par Ahmed Meksem
Institut National Agronomique Paris Grignon - Master en Nutrition Santé 2006
  

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Abréviations

aa : acide aminé

ADN : acide désoxyribonucléique AMP : adénosine monophosphate ATB : antibiotique

ATP : adénosine triphosphate

CKO : cytokinine oxydase

CKOm : cytokinine oxydase de maïs

CMP : cytidine monophosphate

CMPK: cytidine monphosphate kinase

CNRS : centre national de recherche scientifique

CTP : cytosine triphosphate

FAD: flavine adenine dinucléotide

GMP: guanosine monophosphate

GTP: guanosine triphosphate

MM : masse moléculaire

MPD : 2-méthyl-2,4-pentanediol ; C6H14O2

NAGK : N-acétyl glutamate kinase

NDP : nucléoside diphosphate NMP : nucléoside monophosphate NTP : nucléoside triphosphate

NDPK : nucléoside diphosphate kinase

NMPK : nucléoside monophosphate kinase pI : point isoélectrique

PCR: polymerase chain reaction

SDS-PAGE : sodium dodecyl sulphate - polyacrylamide gel electrophoresis

TMP : thymidine monophosphate

UDP : uridine diphosphate

UMP : uridine monphosphate

UMPK: uridine monphosphate kinase

UMPKeco : uridine monphosphate kinase d'E. coli

UTP : uridine triphosphate

Liste des Encadrés / Figures / Tableaux

Encadrés-----------------------------------------------------------------------------

Encadré 1 : Vérification de la concentration protéique par absorption dans l'UV........................... 29

Encadré 2 : Concentration de la protéine............................................................................ 29

Figures-------------------------------------------------------------------------------

Figure 1 : Nombre de structures 3D résolues par cristallographie, déposées et accessibles dans la PDB... 8

Figure 2 : Evolution de la cristallographie des protéines........................................................... 10

Figure 3 : De la protéine à sa structure 3D........................................................................... 11

Figure 4 : Les NMPK et la phosphorylation des NMP............................................................. 13

Figure 5: Les trois domaines des NMPK.................................................................................. 15

Figure 6 : Régulation de l'activité de l'UMPKeco................................................................... 16

Figure 7 : Repliement global de l'UMPKeco : le monomère...................................................... 18

Figure 8 : Repliement global de l'UMPKeco : l'hexamère fonctionnel.......................................... 18

Figure 9 : Formules de quelques cytokinines et d'un inhibiteur ................................................... 20

Figure 10 : Dégradation des cytokinines par la CKOm............................................................. 20

Figures 11 a) et b) : Structure 3D et sites de mutagenèse de la CKOm.......................................... 22

Figure 12 : La cristallisation.................................................................................................. 24

Figure 13 : Mosaïcité d'un cristal..................................................................................... 24

Figure 14 : Diagramme de phase bidimensionnel................................................................... 25

Figure 15 : Technique de la goutte assise............................................................................ 25

Figure 16 : Photos du robot de Cristallisation et de la boite Linbro............................................ 30

Figure 17 a): Méthode de cristallisation en goutte suspendue..................................................... 33

Figure 17 b) : Montage des cristaux sur des boucles en nylon.................................................... 33

Figure 17 c) : Collecte des données de diffraction.................................................................. 33

Figure 18 : Suivi de la pureté de l'UMPKeco D159N D93A par SDS-PAGE..................................... 35

Figure 19 : Cristaux de l'UMPKeco D159N D93A................................................................ 36

Figure 20 : Cristaux de la CKOm..................................................................................... 39

Tableaux-----------------------------------------------------------------------------

Tableau 1 : Structures 3D résolues par les différentes techniques analytiques déposées dans la PDB...... 8

Tableau 2 : Résumé de la variabilité des conditions de cristallisation de l'UMPKeco D159N D93A....... 35

Tableau 3 : Cristaux de l'UMPKeco D159N D93A : Conditions d'obtention et dimensions................. 35

Tableau 4 : Résumé de la variabilité des conditions de cristallisation de la CKOm........................... 38

Tableau 5 : Cristaux de la CKOm : Conditions d'obtention et dimensions..................................... 38

Tableau 6 : Enregistrement des données de diffraction............................................................ 39

Tableau 7 : Résultats du traitement des données.................................................................... 40

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