WOW !! MUCH LOVE ! SO WORLD PEACE !
Fond bitcoin pour l'amélioration du site: 1memzGeKS7CB3ECNkzSn2qHwxU6NZoJ8o
  Dogecoin (tips/pourboires): DCLoo9Dd4qECqpMLurdgGnaoqbftj16Nvp


Home | Publier un mémoire | Une page au hasard

 > 

Cristallographie de deux enzymes : mutant de l'uridine monophosphate kinase d' E. coli insensible à la régulation allostérique et la cytokinine oxydase

( Télécharger le fichier original )
par Ahmed Meksem
Institut National Agronomique Paris Grignon - Master en Nutrition Santé 2006
  

précédent sommaire suivant

Bitcoin is a swarm of cyber hornets serving the goddess of wisdom, feeding on the fire of truth, exponentially growing ever smarter, faster, and stronger behind a wall of encrypted energy

I)-L'uridine monophosphate kinase d'Escherichia coli (UMPKeco)

Les nucléotides sont essentiels à tout processus vivant. Les enzymes responsables de leur

synthèse constituent depuis plusieurs années la cible de médicaments antiviraux, antibactériens et antiparasitaires. Parmi ces enzymes figurent les nucléosides monophosphate kinases (NMPK).

A-Les NMPK

1-Définition et Rôles biologiques : Les NMPK sont ubiquitaires, elles représentent une famille de protéines globulaires relativement homologues du point de vue structural et catalytique (Yan & Tsai,

1999). Ces enzymes catalysent la phosphorylation réversible d'un nucléoside monophosphate (NMP)

en un nucléoside diphosphate (NDP) en présence de Mg2+, le phosphate transféré provient d'un nucléoside triphosphate (NTP)(Noda, 1973), [réaction ci-dessous]. Le principal donneur de phosphate

est l'ATP, mais ce n'est pas le seul possible : la spécificité des NMPK vis-à-vis des donneurs de

phosphate n'est pas très étroite.

Phosphorylation réversible des NMP

NMP + ATPMg2+

NMPK

NDP + ADPMg2+

N est une base azotée : A, G, T, U ou C

Cette étape métabolique est critique dans la synthèse des NTP. Ces derniers jouent plusieurs

rôles au sein de la cellule (Vonrhein et al, 1995) :

ils sont les précurseurs dans la synthèse des acides nucléiques et des phospholipides ;

ils interviennent dans la signalisation cellulaire ;

ils jouent un rôle dans le cycle : polymérisation / dépolymérisation des microtubules ;

ils constituent une source importante d'énergie cellulaire ;

ils entrent dans la structure du site actif de certaines coenzymes.

L'échange du phosphate est facilité par les chaînes très conservées d'arginine ; les NMPK suivent une cinétique du type bi-bi aléatoire : ceci implique l'existence de trois formes : libre (sans substrats), semi fermée (avec le NTP ou le NMP) et fermée (avec le NTP et le NMP). Le 1er substrat

fixé peut être indifféremment le NTP ou le NMP.

Les NMPK sont au nombre de 4 chez les eucaryotes (AMP, GMP, TMP et UMP/CMP kinases) et de 5

chez les procaryotes (AMP, GMP, TMP, UMP et CMP kinases) (Dreusicke et al, 1988 ; Zhou et al,

1998) (Figure 4). Chez les eucaryotes l'UMP/CMP kinase phosphoryle avec la même efficacité l'UMP et la CMP, par contre les chez bactéries se sont deux enzymes distinctes qui assurent cette fonction. Ces CMP et UMP kinases bactériennes ont une spécificité et une structure différentes de celles de leurs homologues eucaryotes. Cela en fait des cibles attractives pour la recherche et la

conception de nouveaux antibactériens.

Etude cristallographique de l'UMPKeco et de la CKOm

Phosphorylation des nucléotides

Chez les procaryotes : une NMPK pour chaque NMP

NMP

AMP GMP dTMP

UMP

CMP

dCMP

AMP

kinase

GMP

kinase

TMP

Phosphorylation des nucléotides

Chez les procaryotes : une NMPK pour chaque NMP

AMP GMP dTMP UMP CMP dCMP

AMP GMP TMP UMP kinase UMP/CMP CMP kinase

kinase kinase kinase bactérienne kinase bactérienne

eucaryote

ADP GDP UDP CDP

RR RR RR RR

dADP dGDP dTDP dUDP dCDP

Phospho- rylation

oxydative, Nucléoside diphosphate kinase

Glycolyse

...

dATP dGTP dTTP dUTP dCTP

ATP GTP UTP CTP

RR : Ribonucléoside diphosphate Réductase

NDP dNDP RR

kinase

UMP kinase bactérienne

UMP/CMP

kinase eucaryote

CMP kinase bactérienne

NMPK

ADP GDP

UDP

CDP

RR RR

RR RR

dADP

dGDP

dTDP

dUDP

dCDP

NDP

Phospho-

rylation oxydative, Glycolyse

...

Nucléoside diphosphate kinase

NDPK

dATP

dGTP

dTTP

dUTP

dCTP

ATP GTP

UTP

CTP

NTP

RR : Ribonucléoside diphosphate Réductase

NDP dNDP RR

Figure 4 : Les NMPK et la phosphorylation des NMP

La production de NTP dans la cellule à partir des NMP passe par deux étapes : (1) phosphorylation

des NMP en NDP par des NMPK spécifiques ; (2) transformation des NDP en NTP par la NDPK non spécifique de chaque base azotée.

2-Structure 3D : Les NMPK partagent la même structure 3D globale comprenant trois domaines : le

domaine CORE, le domaine LID et le domaine NMPbind (Figure 5). Le domaine CORE, rigide et très conservé, comporte un feuillet â à cinq brins parallèles, des hélices á (généralement au nombre de 8 ou

9) et une P-loop. Le domaine LID (flexible) joue le rôle de « couvercle » en venant recouvrir le site donneur de phosphate, permettant l'échange du phosphate ã à l'abri des molécules d'eau. Le domaine flexible NMPbind lie l'accepteur de phosphate. (Yan & Tsai, 1999).

B-L'UMPKeco : modèle intéressant de la régulation enzymatique et cible potentielle de

nouveaux ATB

1-Une NMPK atypique : Avec un point isoélectrique (pI) de 7,24 et une MM de 156 kDa (28,5kDa / sous unité), l'UMPKeco représente environ 0,05 % des protéines totales d'E. coli. Elle est codée par le gène pyrH découvert en 1992, ce gène très conservé est propre aux bactéries est sans homologue chez

les eucaryotes (Serina et al, 1995). L'UMPKeco ne présente aucune similarité significative de séquence ou de repliement avec les autres NMPK. Elle ressemble d'avantage aux aspartokinases (30 % d'identité de séquence), et à un degré moindre (moins de 20% d'identité) à la N-acétyl glutamate kinase (NAGK) et la carbamate kinase (Bucurenci et al, 1996). Elle est présente dans le cytoplasme et près de la membrane bactérienne.

2-Structure 3D et propriétés catalytiques : A la différence des NMPK classiques, généralement monomériques [sauf la TK qui est homodimérique : Haouz et al, 2003], l'UMPKeco est hexamérique

(Serina et al, 1995). La régulation de son activité et assez complexe (Figure 6) : (1) l'UTP est un inhibiteur, cette inhibition est levée par des concentrations élevées de Mg2+ (2) le GTP agit comme

un activateur allostérique, il se fixe sur un site allostérique distinct du site actif, indépendamment de

Mg 2+ (Briozzo et al, 2005).

Une propriété de l'UMPKeco, qui a empêché pendant plusieurs années la détermination de ses structures cristallographiques, est sa très basse solubilité : < 0,1 mg de protéines/ml (Bucurenci et al,

1996).

Nucléoside monophosphate kinases

NMP + ATP-Mg2+ NDP + ADP-Mg2+

Domaines flexibles

LID

NMP-bind

NMP kinases

ADP NMP

-P-

Domaine rigide

- Courtes : AMPK eucaryotes, GMPK, TMPK, UMP/CMPK eucaryotes

Insert

CORE

-Les AMPK des bactéries, plantes et

mitochondries ont un insert supplémentaire dans le LID

- Longues : AMPK des bactéries, plantes et mitochondries : grand LID avec insert

CMPK et GMPK ont un NMPbind plus long

-Les CMPK bactériennes et GMPK ont un insert au niveau du NMP bind

Figure 5 : Les trois domaines des NMPK.

Toutes les NMPK ont un repliement de base similaire, organisé en trois domaines. Un domaine

principal et central CORE qui est rigide et qui contient la P-loop. Un domaine LID et un domaine

NMPbind qui se referme sur le site de l'accepteur du phosphate.

Excès de NTP

puriques : A et G

Excès de NTP

puriques : A et G

Excès de NTP

Excès de NTP

pyrimidiques : C, T et U

pyrimidiques : C, T et U

GTP

Activation

UTP

?? Inhibition

Allostérique

Allostérique

Site allostérique C

UMPK Bactérienne

ompétitif

Site allostérique

Compétitif

de P

UMPK Bactérienne

neur de P P Site accepteur

Site don

Site donneur de P

P Site accepteur de P

ADP

ATP UMP

UDP

Figure 6 : L'UMPKeco / impliquée dans la synthèse de novo des nucléotides pyrimidiques

Figure 6 : Régulation de l'activité de l'UMPKeco

3-Rôles : L'UMPKeco est essentielle à la croissance bactérienne, elle est indispensable à la synthèse

des nucléotides pyrimidiques en catalysant la transformation spécifique de l'UMP en UDP. Les CMP

et UMPK bactériennes n'ont pas d'équivalents chez l'homme, des inhibiteurs pourraient être conçus pour inhiber ces enzymes et bloquer ainsi la croissance bactérienne, sans pour autant entraîner des effets secondaires chez le malade. Cependant, des E. coli sans activité CMPK restent viables (Fricke et

al, 1995). Ceci s'explique par le fait que ces bactéries peuvent produire le CTP à partir de l'UTP grâce

à la CTP synthétase. Au contraire, l'UMPK est essentielle à la croissance bactérienne et constitue de

ce fait une cible privilégiée pour la recherche et la conception (« drug design ») de nouveaux antibiotiques (ATB) (Kholti et al, 1998 ; Fassy et al, 2004).

En plus de son rôle dans la conversion de l'UMP en UDP, l'UMPKeco participe à la régulation

de la transcription et joue très probablement un rôle dans la division des cellules bactériennes (Londais

et al, 1999).

4-Contexte et objectifs du stage : Avant 2005, il n'existait aucune structure 3D de l'UMPKeco (faible solubilité / cristallogenèse impossible). Après la découverte par A.-M. Gilles et al du mutant ponctuel soluble qui a les mêmes caractéristiques catalytiques que l'enzyme sauvage : mutant D159N.

P. Briozzo et al ont résolu sa structure 3D sous différentes formes : avec l'UTP / inhibiteur, l'UMP / substrat naturel et l'UDP / produit (Figures 7 & 8). Le caractère hexamèrique et le repliement de son monomère distinguent l'UMP kinase d'E. coli des autres NMPK. La structure avec l'UTP montre de

manière surprenante que ce nucléotide se fixe sur le même site accepteur de phosphate que l'UMP et l'UDP (c'est la première fois qu'un NTP est retrouvé sur ce site). Cela suggère fortement que l'UTP

est un inhibiteur compétitif, et pas allostérique comme il a été décrit par les auteurs travaillant sur les NMPK. En conséquence, seule la structure avec GTP permet de visualiser et de décrire le site allostérique. La structure de l'UMPKeco avec le GTP est connue depuis 2005 (article en préparation), mais elle n'explique pas clairement le phénomène d'allostérie. Nos collaborateurs de l'Institut Pasteur

ont constaté que le mutant D93A n'est plus régulé allostériquement par le GTP (D93 est impliqué dans

les interactions de maintien de l'hexamère). Résoudre sa structure 3D pourrait nous permettre de mieux comprendre le phénomène de régulation allostérique.

7 6 2

C 7 5

9 1 3

6 8

1 2 4

7 6 2

7 5

9 1 3

6 8

1 2 4

3

8 4 5

1

3

8 4 5

1

Figure 7 : Repliement de l'UMP kinase d'E. coli : le monomère avec l'UMP (Briozzo et al, 2005)

Figure 8 : Repliement de l'UMP kinase d'E. coli : l'hexamère fonctionnel avec l'UMP (Briozzo et al, 2005)

précédent sommaire suivant






La Quadrature du Net