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Analyse de la diversité des champignons ectomycorhiziens et des ectomycorhizes du raisinier bord de mer (Coccoloba Uvifera l.) le long d'un gradient de salinité en forêt littorale


par Raymond AVRIL
Université des Antilles et de la Guyane - Master 2 2009
  

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UNIVERSITÉ DES ANTILLES ET DE LA GUYANE

FACULTÉ DES SCIENCES EXACTES ET NATURELLES

MASTER RECHERCHE EN SCIENCES ET TECHNOLOGIES

BIODIVERSITÉ TROPICALE
Spécialité: Écosystèmes Naturels et Exploités

Analyse de la diversité des champignons ectomycorhiziens et des
ectomycorhizes du Raisinier bord de mer (Coccoloba uvifera L.) le
long d'un gradient de salinité en forêt littorale

Raymond Avril

Directeur de stage : Amadou B%o

Laboratoire de Biologie et Physiologie Végétales (LSTM-UMR113), UFR Sciences Exactes et
Naturelles, Université des Antilles et de la Guyane, BP. 592, 97159, Pointe-à-Pitre,
Guadeloupe

Soutenu le : 25 juin 2009

REMERCIEMENTS

Ce stage s'est déroulé au Laboratoire de Biologie et de Physiologie Végétales (LSTM-UMR113) de l'Université des Antilles et de la Guyane. Ce travail de recherche a pu se réaliser gr%oce au soutien de personnes que je tiens à remercier en particulier :

Monsieur Amadou B%o , professeur à l'UAG, d'avoir encadré ce travail avec enthousiasme et de m'avoir fait découvert le monde fascinant des symbioses ectomycorhiziennes.

Mademoiselle Isabelle Boulogne, technicienne au laboratoire, pour son soutien moral mais aussi pour son amabilité et son aide.

Mademoiselle Sandrine Bessard, doctorante au laboratoire, surnommée grande sÏur, pour son aide.

Madame Clémence Chaintreuil, ingénieure de recherche à l'IRD de Montpellier, d'avoir bien voulu nous apporter son aide pour le séquençage de l'ADN.

Mademoiselle Fadul Ra
·ma, stagiaire en M1 au laboratoire, pour ses encouragements, sa gentillesse et son amitié.

Mes camarades de promotion, Lisa Vidil, Pierre-Antoine Faddoul et Anaël Ssosse, pour leur accueil, leur amitié et leur encouragement.

Monsieur Harry-Ozier Lafontaine, directeur de recherche à l'INRA, d'avoir bien voulu faire un rapport sur mon mémoire de stage.

Toute l'équipe du laboratoire de Biologie Marine pour son accueil, en particulier Madame Soazig Lemoine, maître de conférences à l'UAG, qui a aimablement mis à ma disposition l'équipement de biologie moléculaire.

L'AUF Cara
·be pour son soutien financier à travers la bourse de mobilité sans laquelle ce travail n'aurait pas vu le jour. Que les responsables trouvent, ici, l'expression de ma reconnaissance, particulièrement Mme Katty Saint-Louis, pour son attention et son dévouement.

LISTE DES TABLEAUX ET FIGURES

Tableau 1. Les différents types de mycorhizes 4

Figure 1. Principaux types d'associations symbiotiques entre des champignons 5

(en bleu) du sol et des racines de végétaux

Figure 2. Représentation schématique de l'ITS (ITS1, ITS2 et 5.8S) de l'unité 9

répétée de l'ADN ribosomique chez les champignons

Tableau 2. Classification botanique de Coccoloba uvifera 12

Figure 3. Fruits verts immatures, Fruits rouge violacé matures 12

Figure 4. Fleurs m%oles, Graines sans la pulpe 13

Figure 5. Coccoloba uvifera en bordure de mer sur la plage de Bois Jolan 15

Tableau 3. Champignons ectomycorhiziens associés à C. uvifera aux Antilles 16

Figure 6. Plantules de Coccoloba uvifera et sporophores de Russula cremeolilacina 16

sous le houppier d'un arbre-mère

Figure 7. Représentation schématique (vue de profil) des six arbres -mères de Coccoloba 17

uvifera échantillonnés le long d'un gradient de salinité sur la plage de Bois Jolan

Figure 8. Représentation schématique (vue de face) de la position des six 18

arbres-mères de Coccoloba uvifera échantillonnés le long d'un gradient de

salinité sur la plage de Bois Jolan

Figure 9. Fructifications de Scleroderma bermudense matures ouvertes en étoile .23

libérant la sporée et immatures fermées

Figure 10. Nombre de sporophores récoltés sous Coccoloba uvifera pendant 24

8 mois en milieu peu salé

Tableau 4. Description des neuf morphotypes ectomycorhiziens sur quelques .25

caractères macroscopiques et microscopiques

Figure 11. Morphotypes des arbres-mères et de leurs plantules en milieu peu salé 25

Figure 12. Fréquence des morphotypes des arbres-mères et leurs plantules en milieu peu saléÉ 26

Figure 13. Fréquence des morphotypes des arbres-mères en milieu salé 26

Figure 14. Produits de l'amplification par PCR de la région ITS de l'ADNr des morphotypesÉ 27

Figure 15. Produits de digestion par HinfI de la région ITS de l'ADNr des morphotypes 28

Tableau 5. Polymorphisme de longueur des fragments de restriction de la région ITS .29

(digestion par HinfI) des sporophores et des morphotypes ectomycorhiziens

d'arbres-mères et de plantules de Coccoloba uvifera

Figure 16. Fréquence des six ribotypes (F, E, A, B, D et C) des arbres-mères et de leurs 30

plantules en milieu peu salé.

Figure 17. Fréquence de trois ribotypes (A, B et F) des arbres en milieu salé 31

Figure 18. Arbre phylogénétique basé sur le séquençage de l'ITS des huit taxons 32

fongiques (I à VIII en rouge) de C. uvifera, comparé à des séquences de référence

dans GenBank (en noir)

SOMMAIRE

INTRODUCTION 1

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 3

1. Symbiose mycorhizienne 3

2. Symbiose ectomycorhizienne 6

2.1. Diversité des champignons ectomycorhiziens 6

2.2. Diversité des ECM 7

2.3. Caractérisation moléculaire de la diversité fongique 8

2.4. Les ECM en milieu salé 10

2.5. Importance des réseaux ectomycorhiziens 10

3. Coccoloba uvifera L 11

3.1. Classification et description botanique 11

3.2. Origine et aire de distribution 13

3.3. Quelques usages de C. uvifera 13

3.4. C. uvifera et ses symbiotes 14

MATERIELS ET METHODES 16

1. Description du site 16

2. Plan d'échantillonnage 18

3. Morphotypage, fréquence et conservation des ECM 19

4. Extraction de l'ADN 19

5. Amplification de l'ITS par la réaction de polymérase en cha»ne 20

6. Polymorphisme de longueur des fragments de restriction de l'ITS 21

7. Séquençage de l'ITS 22

8. Analyse statistique 22

RÉSULTATS ET DISCUSSION 23

1. Diversité des sporophores 23

2. Diversité des morphotypes 24

3. Caractérisation moléculaire des MT et des sporophores 27

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 33

BIBLIOGRAPHIE 34

ANNEXES 41

INTRODUCTION

La symbiose ectomycorhizienne, une association mutualiste entre les racines fines des arbres et des champignons du sol, se traduit par la formation d'un organe mixte dénommé ectomycorhize (ECM), et par l'apparition d'organes sporofères appelés sporophores ou carpophores visibles à proximité de la plante hôte (Smith & Read, 2008). L'ECM assure une bonne alimentation en eau, macroéléments (p.ex. P, N, K) et oligo -éléments (p.ex. Zn, Cu) de la plante hôte (Diédhiou et al., 2004; Bandou et al., 2006; Quoreshi & Khasa, 2008). Elle développe, pour ce faire, un réseau mycélien qui explore un grand volume de sol, au-delà de la zone d'épuisement, et mobilise ainsi les nutriments essentiels. En retour, la plante autotrophe fournit au champignon hétérotrophe des photosynthétats nécessaires à son métabolisme.

La symbiose ectomycorhizienne est surtout localisée sous les latitudes tempérées et boréales, et concerne environ 90% des espèces d'arbres de ces régions (Smith & Read, 2008). Beaucoup d'arbres appartenant à la famille des Pinaceae, Fagaceae, Betulaceae, Tiliaceae et Salicaceae sont associés à une diversité d'environ 15000 espèces de champignons ectomycorhiziens appartenant à des Basidiomycota et Ascomycota. En revanche, beaucoup moins d'arbres sont associés à des ECM dans les régions tropicales et subtropicales (B%o et al., 2008; B%o et al., 2009). Il s'agit de familles d'arbres originaires d'Australie (p. ex. Myrtaceae, Casuarinaceae, Acaciaea), d'Afrique (p.ex. Caesalpinioideae, Phyllanthaceae), d'Asie (p. ex. Dipterocarpaceae, Caesalpinioideae) et d'Amérique du Sud (p.ex. Caesalpinioideae, Nyctaginaceae, Polygonaceae).

Dans les écosystèmes forestiers, des champignons sont capables de coloniser à la fois les racines des plantules et des arbres-mères de la même espèce ou d'espèces différentes, et d'établir ainsi des réseaux ectomycorhiziens communs (Read & Smith, 2008). Par le biais des réseaux ectomycorhiziens, les arbres établis peuvent aider les plantules de deux façons : (1) les champignons déjà nourris par les adultes représentent un inoculum peu couteux en photosynthétats pour les plantules dont ils assurent la régénération et la survie (Onguene & Kuyper, 2002; McGuire, 2007), (2) des transferts d'eau, de substrats carbonés et azotés sont possibles entre arbres matures et plantules en régénération (Tedersoo et al., 2007 ; Warren et al., 2008) ; de tels échanges sont bien établis chez certaines plantes de sous-bois non chlorophylliennes dites mycohétérotrophes ou des plantes mixotrophes qui, en plus de leur photosynthèse, s'alimentent en C et N issus de plantes photosynthétiques (Julou et al., 2005 ; Selosse et al., 2006 ; Tedersoo et al., 2007).

Parmi les arbres des forêts néotropicales, Coccoloba uvifera (L) est l'une des rares espèces à ECM qui fait l'objet de plantations ornementales (p.ex. haies -vives) en bordure de route et de plage sur les côtes atlantiques, caribéennes et pacifiques de l'Amérique tropicale et subtropicale (Parrota, 1994; Bandou, 2005). Cet arbre appartient à la famille des Polygonaceae et doit son nom de Raisinier bord de mer (en anglais Ç seagrape È) à son fruit comestible ressemblant à des grappes de raisins. Il pousse souvent sur des sols salés et pauvres en éléments minéraux. Il est associé à plusieurs espèces de champignons ectomycorhiziens (Pegler, 1983 ; Miller et al., 2000 ; Guzman et al., 2003; Bandou, 2005 ; Bessard et al., 2008) avec lesquels ses racines forment des ECM, une association symbiotique vitale pour la nutrition des plantes (Bandou et al., 2006). En effet, les ECM jouent un rôle majeur sur la croissance et l'adaptation des plantules de C. uvifera aux stress salin et hydrique (Bandou et al., 2006). Un inventaire des sporophores fructifiant sous le houppier de C. uvifera a été réalisé en Guadeloupe (Bandou, 2005). Cet inventaire mycologique devait être complété par un inventaire des ECM pour avoir une bonne image de la diversité des communautés de champignons ectomycorhiziens de C. uvifera. De plus, sous le houppier des arbres-mères de cette espèce prolifèrent des plantules issues de semis qui pourraient se lier aux réseaux ectomycorhiziens préexistants. L'existence de réseaux ectomycorhiziens communs aux arbres - mères et plantules pourrait contribuer à la régénération naturelle par semis.

Notre étude avait pour but (i) d'évaluer l'impact de la salinité sur les communautés de champignons ectomycorhiziens des arbres-mères et des plantules de C. uvifera, (ii) de déterminer à quel point les arbres-mères et leurs plantules partagent un cortège ectomycorhizien commun.

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

1. Symbiose mycorhiñenne

Le terme de mycorhize vient de l'association de deux mots grecs, Ç mykes È qui signifie champignon et ÇrhizaÈ qui signifie racine (Gagné, 2005). Il fut créé par Franck en 1885 pour définir l'organe mixte plante-champignon. Les mycorhizes se définissent comme des associations durables impliquant des échanges à bénéfices réciproques, au sein de structures spécifiquement mises en place par les partenaires de la symbiose au niveau des racines des végétaux (Smith & Read, 2008). Elles favorisent l'absorption par les racines des éléments minéraux de la mycorhizosphère et améliorent ainsi la nutrition de la plupart des espèces végétales. En retour, le végétal fournit le carbone nécessaire sous forme de sucres issus de la photosynthèse, à son partenaire fongique hétérotrophe (Gagné, 2005). Dans la nature, l'état de mycorhization est la règle et celui de la nonmycorhization est l'exception (Strullu, 1991).

Les mycorhizes à arbuscules (MA) et les ECM sont les principaux types de mycorhizes des écosystèmes forestiers et cultivés (B%o, 2008). Elles se distinguent par leur structure et leur morphologie (Tableau 1; Figure 1). Les MA ne sont pas visibles à l'oeil nu. Elles sont éclaircies et colorées pour révéler deux structures typiques observées en microscopie photonique : les vésicules et les arbuscules. Les vésicules sont un lieu de stockage des lipides nécessaires au métabolisme du champignon alors que les arbuscules sont le lieu d'échanges entre les deux partenaires de la symbiose. Les vésicules peuvent être intraracinaires et extraracinaires. Les arbuscules sont intraracinaires logées dans l'espace périplasmique de la cellule. Les ECM sont, en revanche, visibles à l'oeil nu gr%oce à la couleur du manteau fongique qui recouvre la racine (Figure 1). Les hyphes pénétrent entre les cellules corticales pour former le réseau de Hartig, lieu d'échanges bidirectionnels entre les deux partenaires.

Les MA, apparues en même temps que les végétaux terrestres, concernent plus de 80% des taxons végétaux. Les champignons sont des symbiotes obligatoires, ubiquistes et rattachés au phylum des Glomeromycota. Les ECM, d'apparition plus récente, sont associées à environ 5% des plantes vasculaires. Les champignons sont des Basidiomycota et des Ascomycota apparus plusieurs fois indépendamment à partir des phylums de saprophytes (Hibbett et al., 2000). En général, les forêts boréales sont dominées par les arbres à ECM, les forêts tempérées par les arbres à MA et

ECM, et les forêts tropicales humides par les arbres à MA. Cependant, on trouve des peuplements d'arbres à ECM dominants dans les forêts tropicales humides d'Asie du Sud-Est, d'Afrique et d'Amérique du Sud (Torti et al., 2001 ; McGuire, 2007 ; Rivière et al., 2007). Ces arbres sont des légumineuses (Caesalpinioideae) associées également aux MA. Les ECM, à cause de leur origine saprophyte, participeraient à la décomposition de la matière organique et seraient donc plus efficaces que les MA pour mobiliser les nutriments des sols pauvres (Smith & Read, 2008).

Tableau 1. Les différents types de mycorhizes

 

MA

ECM Ectendo-

mycorhizes

Mycorhizes arbuto
·des

Mycorhizes monotropo
·des

Mycorhizes érico
·des

Mycorhizes
orchido
·des

Champignons Hyphes

 
 
 
 
 
 

cloisons

-

+ +

+

+

+

+

Arbuscules

+

- -

-

-

-

-

Vésicules

+ ou -

- -

-

-

-

-

Pelotons

-

- +

+

+

+

+

Manteau

-

+ + ou -

+ ou -

+

-

-

Réseau de Hartig

-

+ +

+

+

-

-

Taxonomie

Glom.

Basidio. Basidio.

Basidio.

Basidio.

Asco.

Basidio.

 
 

Asco. Asco.

 
 
 

Asco.

 
 

Zygo.

 
 
 
 

Plantes hôtes

Bryo.

Gymno. Gymno.

Erica.

Monotropa.

Erica.

Orchida.

 

Pterido.

Angio. Angio.

 
 

Bryo.

 
 

Gymno.

 
 
 
 
 
 

Angio.

 
 
 
 
 

Photosynthèse + + + + ou - - + + ou -

MA= Mycorhizes à arbuscules; ECM= Ectomycorhizes; - = absent; + = présent; + ou - = présent ou absent; Glom.= Glomeromycota; Basidio.= Basidiomycota; Asco.= Ascomycota; Zygo. = Zygomycota; Bryo. = Bryophyte; Pterido. = Pteridophyte; Gymno. = Gymnosperme; Angio. = Angiosperme; Erica. = Ericaceae; Monotropa. = Monotropaceae; Orchida. = Orchidaceae. (Smith & Read, 2008).

Sporophore

Figure 1. Principaux types d'associations symbiotiques entre des champignons (en bleu) du sol et des racines de végétaux; (A) racine sans mycorhize, (B) endomycorhizes à vésicules et à arbuscules, (C) endomycorhizes à pelotons, (D) ectendomycorhizes, (E) ectomycorhizes chez les Angiospermes, (F) ectomycorhizes chez les Gymnospermes (Duhoux & Nicole, 2004).

2. Symbiose ectomycorhizienne

2.1. Diversité des champignons ectomycorhiziens

Les champignons ectomycorhiziens sont présents dans le sol sous forme de propagules de conservation et de dissémination (p.ex. spores, vieilles mycorhizes, cordons mycéliens) (Bâ et al., 1991). C'est sous ces différentes formes que les champignons se maintiennent dans le sol à l'état de vie ralentie en période sèche notamment. Quand les conditions sont favorables en période humide, les propagules produisent des hyphes qui poussent et se ramifient pour donner un mycélium capable de coloniser le système racinaire pour former des ECM. La germination des propagules marque le début du cycle de développement des Basidiomycota auxquels appartient la plupart des champignons ectomycorhiziens. Ce cycle se résume en deux phases principales: une phase végétative comprenant la formation et le développement du mycélium ou thalle à partir de la germination des spores, et une phase fructifère marquée par l'apparition de sporophores épigés ou hypogés, et la production de spores.

Chez les champignons supérieurs, le sporophore est la partie visible de l'organisme que l'on appelle couramment Ç champignon È. Il est constitué de filaments ou d'hyphes groupées en amas ou mycélium. La présence de sporophores est associée automatiquement à la présence de mycélium à la base du pied, mais l'absence de sporophores ne signifie pas nécessairement l'absence de mycélium dans le sol. Le sporophore, constitué d'un chapeau et d'un pied, est un organe éphémère oü se déroule la reproduction sexuée.

Les champignons ectomycorhiziens sont des symbiotes obligatoires qui bouclent leur cycle de développement en fructifiant notamment grâce aux ECM qu'ils contractent avec la plante hôte. La formation de sporophores requiert donc la présence d'ECM alors qu'à l'inverse on peut observer des ECM sans sporophores correspondants. En effet, des champignons comme Thelephora et Cenoccocum forment des ECM avec peu ou pas de fructifications et sont souvent dominants sur les racines de leurs plantes hôtes (Henkel et al., 2002 ; Diédhiou et al., 2004). La fructification des champignons est un processus complexe et coüteux en énergie pour la plante, qui dépend de l'espèce de champignon, de facteurs climatiques, de l'âge des peuplements et de traitements sylvicoles (p.ex. fertilisation, éclaircies). La formation de sporophores, difficile à obtenir en conditions contrôlées, dépend du champignon impliqué, de la qualité du substrat, des conditions de culture (p.ex. humidité, lumière, température) et de la production de métabolites par la plante hôte.

Hebeloma cylindrosporum en symbiose avec Pinus pinaster, fructifie in vitro sur un milieu de culture approprié et dans des conditions de lumière et de température bien définies (Débaud & Gay, 1987).

Dans la nature, les sporophores épigés sont la manifestation visible de la présence d'une espèce donnée en symbiose avec une ou plusieurs plantes hôtes. Dans la plupart des cas, les sporophores sont d'apparition fugace de quelques heures à quelques jours, rarement davantage. Leur apparition fluctue d'une année à une autre selon l'état hydrique du sol et l a périodicité des cycles biologiques des champignons souvent méconnus. L'inventaire des sporophores hypogés pose davantage de problèmes que les épigés dans la mesure oü ils sont souterrains et non visibles. Ils sont en général sous -évalués dans les inventaires mycologiques. Pour avoir un inventaire exhaustif de la fonge d'un biotope donné, il faut compter plusieurs récoltes étalées sur 7 à 10 ans au moins (Guinberteau & Courtecuisse, 1997).

Dans les régions boréales et tempérées, de nombreuses communautés de champignons ectomycorhiziens ont été décrites sur la base d'inventaires de sporophores (Ferris et al., 2000). L'avantage de cette approche réside dans la simplicité d'échantillonnage avec peu de perturbation du milieu et dans l'identification de l'espèce fongique à partir de la description du sporophore. Elle a cependant l'inconvénient de nécessiter plusieurs récoltes dans l'année, et d'une année à une autre pour prendre en compte les champignons résupinés peu visibles dans les écosystèmes forestiers (Erland & Taylor, 1999). Malgré tout, on estime que la diversité des sporophores de champignons ectomycorhiziens est comprise entre 10000 et 15000 espèces (Smith & Read, 2008). Ce chiffre est loin d'être exhaustif car il ne prend pas en compte la diversité encore peu connue des champignons des régions tropicales. Les champignons sont le plus souvent des Basidiomycota (p.ex. Russules, Lactaires, Amanites, Bolets, Girolles) et plus rarement des Ascomycota (p.ex. Truffes, Cenoccocum). Certains champignons sont comestibles et à forte valeur ajoutée (p.ex. Truffes, Matsutake).

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