ANNEXES
CTAB 2x
Composition: 100 mM Tris HCl (pH 7,5 à 8); 1,4 M NaCl ; 20
mM Na2EDTA ; 2 % CTAB. Pour 100 ml :
- Dissoudre 2 g de CTAB dans 50 ml d'eau ultrapure en
mélangeant et en chauffant légèrement (45 à
50°C) si besoin pour faciliter la dissolution)
- Ajouter ensuite en mélangeant :
10 ml de Tris HCl 1 M pH 7,5 à 8,0
28,6 ml de NaCl 5 M.
4 ml Na2EDTA 0,5 M pH 8,0.
- Ajuster le volume à 100 ml avec de l'eau ultrapure (7,4
ml environ).
- Preparation des diverses solutions:
Tris HCl 1 M :
Mélanger :
121,14 g de Tris Base. 800 ml de H
2 O ultrapure.
Ajuster le pH entre 7,5 et 8,0 avec HCl 37 % (environ 50 ml).
Ajuster le volume à 1 l avec H O ultrapure et stériliser à
l'autoclave.
2
Na2EDTA 0,5 M pH 8 :
Pour 250 ml :
46,53 g de Na2EDTA.
200 ml de H
2 O ultrapure.
Ajouter des pastilles de NaOH (environ 15) jusqu'à ce que
la solution devienne transparente. Ajuster le pH à 8,0 avec NaOH 10
N.
Ajuster le volume à 250 ml avec H O et autoclaver.
2
Chlorure de sodium (NaCl) 5 M :
Pour 1 l, mélanger :
292 g de NaCl.
q.s.p. 1 l de H2O ultrapure.
Bien homogénéiser et stériliser à
l'autoclave.
GELS D'AGAROSE
Gel d'agarose à 2% (Verification
PCR)
Agar 2 g
TAE(1X) 100 ml
Faire chauffer l'agarose dans le tampon TAE 1X à la
micro-onde pour le dissoudre, puis ajouter 1 ou 2 gouttes de BET de 0,624mg/ml
(préparation solution BET: 312 jsl de solution-mere de BET à
10mg/ml sont ajoutés à 4688 jsl d'eau
déminéralisée).
Gel d'agarose à 3% (Verification
RFLP)
Agar 3 g
TAE(1X) 100 ml
Faire chauffer l'agarose dans le tampon TAE 1X à la
micro-onde pour le dissoudre, puis ajouter 1 ou 2 gouttes de BET de 0,624mg/ml
(préparation solution BET: 312jsl de solution-mere de BET à
10mg/ml sont ajoutés à 4688 jsl d'eau
déminéralisée).
COMPOSITION DES TAMPONS
EDTA 0,5M, pH 8 (Solution mere):
EDTA 93,075 g
Eau déminéralisée 300 ml
Ajuster avec de l'eau jusqu'à 500ml. Le pH est
ajusté à 8 avec des cristaux de soude NaOH, puis la solution est
filtrée (0.2jsm) et stérilisée 20 min à
120°C.
TAE 50X (solution mere):
Tris Base 242 g
Acide Acétique glacial 57,1 ml
EDTA (0,5M, pH 8) 100 ml
Ajuster avec de l'eau déminéralisée en
chauffant pour le dissoudre
TE (Tampon Tris base 10mM, EDTA 1mM):
Tris Base 242g
EDTA (0,5M, pH 8) 57,1ml
Eau déminéralisée 100ml
Ajuster le pH
à 8 avec HCL.
Tris HCl pH 8:
Tris Base 121,1g
Eau déminéralisée 800ml
Ajuster le pH à 8 avec HCL.
Preparation des dNTP
Solution mere dNTP 10mM.
Pour avoir une solution de 2,5 mM de dNTP pour la rection de PCR,
il faut: 50ul de solution mere de dNTP dans 150ul d'eau ultrapure
stérile
A conserver a -20°C
Preparation des amorces ITS1 et ITS4
Solution mere ITS1/ ITS4 300 moles/ul.
Pour avoir une solution de 20 pmoles/ul de ITS1 ou ITS4 pour la
réaction PCR, il faut: 10ul de ITS1 ou ITS4 de solution mere dans 140ul
d'eau ultrapure stérile.
A conserver à -20°C.
Mettre une étiquette oü figure le nom de l'amorce, sa
concentration et la date.
Kit PCR Master Mix PROMEGA
Préparation du MIX pour échantillons + 1
témoins + 1 erreur = É. tubes
|
Produits
|
Volume/ tube
|
Volume pour É.. tubes
|
|
Nuclease Free-water
|
9,5ul
|
|
|
PCR master mix
|
12,5 ul
|
|
|
ITS1
|
1 ul
|
|
|
ITS4
|
1 ul
|
|
|
ADN total (extrait)
|
1 ul
|
|
|
Volume final
|
25 JAl
|
|
Kit RFLP PROMEGA
Préparation du MIX pour échantillons + 1
erreur = É tubes
|
Produits
|
Volume/ tube
|
Volume pour É.. tubes
|
|
Enzyme (Hinf I)
|
0,5ul (10 unités/ul)
|
|
|
Tampon B
|
2 ul
|
|
|
Eau ultra-pure
|
2,3 ul
|
|
|
BSA
|
0,2 ul
|
|
|
Amplifiat d'ADN
|
15 ul
|
|
|
Volume final
|
20 JAl
|
|
UNIVERSITÉ DES ANTILLES ET DE LA
GUYANE
FACULTÉ DES SCIENCES EXACTES ET NATURELLES
| 
