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Analyse de la diversité des champignons ectomycorhiziens et des ectomycorhizes du raisinier bord de mer (Coccoloba Uvifera l.) le long d'un gradient de salinité en forêt littorale

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par Raymond AVRIL
Université des Antilles et de la Guyane - Master 2 2009
  

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ANNEXES

CTAB 2x

Composition: 100 mM Tris HCl (pH 7,5 à 8); 1,4 M NaCl ; 20 mM Na2EDTA ; 2 % CTAB. Pour 100 ml :

- Dissoudre 2 g de CTAB dans 50 ml d'eau ultrapure en mélangeant et en chauffant légèrement (45 à 50°C) si besoin pour faciliter la dissolution)

- Ajouter ensuite en mélangeant :

10 ml de Tris HCl 1 M pH 7,5 à 8,0

28,6 ml de NaCl 5 M.

4 ml Na2EDTA 0,5 M pH 8,0.

- Ajuster le volume à 100 ml avec de l'eau ultrapure (7,4 ml environ).

- Preparation des diverses solutions:

Tris HCl 1 M :

Mélanger :

121,14 g de Tris Base. 800 ml de H

2 O ultrapure.

Ajuster le pH entre 7,5 et 8,0 avec HCl 37 % (environ 50 ml). Ajuster le volume à 1 l avec H O ultrapure et stériliser à l'autoclave.

2

Na2EDTA 0,5 M pH 8 :

Pour 250 ml :

46,53 g de Na2EDTA.

200 ml de H

2 O ultrapure.

Ajouter des pastilles de NaOH (environ 15) jusqu'à ce que la solution devienne transparente. Ajuster le pH à 8,0 avec NaOH 10 N.

Ajuster le volume à 250 ml avec H O et autoclaver.

2

Chlorure de sodium (NaCl) 5 M :

Pour 1 l, mélanger :

292 g de NaCl.

q.s.p. 1 l de H2O ultrapure.

Bien homogénéiser et stériliser à l'autoclave.

GELS D'AGAROSE

Gel d'agarose à 2% (Verification PCR)

Agar 2 g

TAE(1X) 100 ml

Faire chauffer l'agarose dans le tampon TAE 1X à la micro-onde pour le dissoudre, puis ajouter 1 ou 2 gouttes de BET de 0,624mg/ml (préparation solution BET: 312 jsl de solution-mere de BET à 10mg/ml sont ajoutés à 4688 jsl d'eau déminéralisée).

Gel d'agarose à 3% (Verification RFLP)

Agar 3 g

TAE(1X) 100 ml

Faire chauffer l'agarose dans le tampon TAE 1X à la micro-onde pour le dissoudre, puis ajouter 1 ou 2 gouttes de BET de 0,624mg/ml (préparation solution BET: 312jsl de solution-mere de BET à 10mg/ml sont ajoutés à 4688 jsl d'eau déminéralisée).

COMPOSITION DES TAMPONS

EDTA 0,5M, pH 8 (Solution mere):

EDTA 93,075 g

Eau déminéralisée 300 ml

Ajuster avec de l'eau jusqu'à 500ml. Le pH est ajusté à 8 avec des cristaux de soude NaOH, puis la solution est filtrée (0.2jsm) et stérilisée 20 min à 120°C.

TAE 50X (solution mere):

Tris Base 242 g

Acide Acétique glacial 57,1 ml

EDTA (0,5M, pH 8) 100 ml

Ajuster avec de l'eau déminéralisée en chauffant pour le dissoudre

TE (Tampon Tris base 10mM, EDTA 1mM):

Tris Base 242g

EDTA (0,5M, pH 8) 57,1ml

Eau déminéralisée 100ml
Ajuster le pH à 8 avec HCL.

Tris HCl pH 8:

Tris Base 121,1g

Eau déminéralisée 800ml

Ajuster le pH à 8 avec HCL.

Preparation des dNTP

Solution mere dNTP 10mM.

Pour avoir une solution de 2,5 mM de dNTP pour la rection de PCR, il faut: 50ul de solution mere de dNTP dans 150ul d'eau ultrapure stérile

A conserver a -20°C

Preparation des amorces ITS1 et ITS4

Solution mere ITS1/ ITS4 300 moles/ul.

Pour avoir une solution de 20 pmoles/ul de ITS1 ou ITS4 pour la réaction PCR, il faut: 10ul de ITS1 ou ITS4 de solution mere dans 140ul d'eau ultrapure stérile.

A conserver à -20°C.

Mettre une étiquette oü figure le nom de l'amorce, sa concentration et la date.

Kit PCR Master Mix PROMEGA

Préparation du MIX pour échantillons + 1 témoins + 1 erreur = É. tubes

Produits

Volume/ tube

Volume pour É.. tubes

Nuclease Free-water

9,5ul

 

PCR master mix

12,5 ul

 

ITS1

1 ul

 

ITS4

1 ul

 

ADN total (extrait)

1 ul

 

Volume final

25 JAl

 

Kit RFLP PROMEGA

Préparation du MIX pour échantillons + 1 erreur = É tubes

Produits

Volume/ tube

Volume pour É.. tubes

Enzyme (Hinf I)

0,5ul (10 unités/ul)

 

Tampon B

2 ul

 

Eau ultra-pure

2,3 ul

 

BSA

0,2 ul

 

Amplifiat d'ADN

15 ul

 

Volume final

20 JAl

 

UNIVERSITÉ DES ANTILLES ET DE LA GUYANE

FACULTÉ DES SCIENCES EXACTES ET NATURELLES

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