Conclusion
Les techniques d'amplification en chaîne par
polymérase ou PCR occupent de nos jours une importance capitale dans le
contrôle et le diagnostic de la trypanosomose animale africaine (TAA).
Toutefois, en dépit de sa bonne sensibilité et
spécificité, la PCR basée sur l'utilisation des couples
d'amorces spécifiques d'espèces présente un sérieux
handicap à cause de son coût élevé. Ceci
réduit par conséquent son usage et affaiblit ainsi les efforts de
lutte. Le développement d'une PCR unique amplifiant les espaceurs
internes transcrits (ITS) de l'ADN ribosomal des trypanosomes est une option
prometteuse pour trouver un compromis entre un diagnostic sensible et
spécifique d'une part et d'autre part un diagnostic accessible pour un
coût raisonnable. Notre travail s'intègre dans cette dynamique et
a consisté dans un premier temps à l'évaluation des
amorces polyspécifiques (Tryp 4R et Tryp 4S) pour la PCR directe et dans
un second temps à l'étude de la PCR-ELISA sur les ITS des
trypanosomes.
Ainsi, pour la PCR directe, 425 échantillons de
terrain dont 311 couches de globules blancs du sang de bovins (buffy coats) et
114 organes de mouches ont été analysés en PCR
monospécifique et en PCR-ITS. Les amorces polyspécifiques ont
détectés sur les 425 échantillons, 127 signaux positifs
soit 29,88 %.Par contre, les amorces spécifiques d'espèce ont
identifié 168 cas positifs soit 39,53 %. Pour les infections à
Trypanosoma vivax, le couple d'amorces Tryp 4R et Tryp 4S totalise 97
cas positifs sur l'ensemble des échantillons, soit une prévalence
de 22,82 %, tandis que les amorces TVW 1 et 2 ont identifié 51 cas
positifs soit 12 %. Avec les amorces TCS 1 & 2, 99 cas positifs, soit
23,29 % de l'ensemble des échantillons sont rapportés à
Trypanosoma congolense type savane, contre seulement 5,41 %
représentant 23 échantillons révélés
positifs à cette espèce en PCR-ITS.
Au regard de ces résultats, la PCR utilisant le
couple d'amorces polyspécifiques demeure globalement moins sensible que
la PCR monospécifique. Cette faible sensibilité est
particulièrement observée dans la détection des
trypanosomes du sous genre Nannomonas (T.
congolense). En revanche, sur des ADN purifiés, aucune
différence de sensibilité n'a été notée
entre les amorces amplifiant les ITS1 et les amorces monospécifiques. En
plus, malgré la présence limitée du segment ITS1 dans le
génome parasitaire comparativement à l'ADN satellite, la PCR-ITS
bénéficie d'un gain de sensibilité dans la
détection de Trypanosoma vivax. Ce qui constitue un
avantage assez important, car T. vivax est une espèce
non seulement transmise par la voie cyclique, mais aussi par la voie
mécanique (Desquesnes et Dia, 2004), elle est de ce
fait l'une des espèces la plus largement répandue en Afrique
tropicale.
Pour la PCR-ELISA, les cinq sondes
oligonucléotidiques spécifiques aux ITS1 ont identifié
avec une spécificité totale les échantillons d'ADN de
référence. Mais la sensibilité de cette technique sur des
échantillons de terrain s'est avérée inférieure
à celle observée avec la révélation sur gel
d'agarose. Par conséquent, la PCR-ELISA n'a pas fait l'objet d'une large
évaluation sur des prélèvements sanguins de bovins et des
organes de mouches.
Par ailleurs, l'application de la PCR-ELISA dans nos
conditions reste limitée par son coût élevé. En
effet, le coût de l'analyse d'un échantillon par PCR-ELISA sur les
ITS a été estimé à 1,8 € (environ 1180 Fcfa)
pour 4 espèces de trypanosomes détectées. Ce coût
représente plus du double de celui de la PCR-ITS directe estimé
à 0,72 € soit 472,30 Fcfa. Par conséquent, la PCR-ITS
directe constitue une méthode de choix et à privilégier
pour un diagnostic de routine.
Au vu de ce qui précède, il conviendra
pour améliorer davantage les résultats des tests de PCR directe
sur les ITS des trypanosomes :
Ø de poursuivre la recherche d'amorces plus
adaptées à la détection des trypanosomes du sous genre
Nannomonas (Trypanosoma congolense), ou à
défaut ;
Ø d'associer le couple d'amorces Tryp 4R et Tryp 4S et
le couple d'amorces TCS1&2, afin d'avoir un diagnostic plus sensible et
hautement spécifique de Trypanosoma congolense type
savane ;
Ø d'améliorer le programme d'amplification en
augmentant par exemple le temps d'élongation, ce qui permettra
l'amplification des segments les plus longs tels que ceux de
Trypanosoma congolense.
En outre, dans le but de réduire davantage le
coût de l'analyse par PCR-ELISA, mais aussi d'augmenter sa
sensibilité, il serait important :
Ø d'envisager la réduction du volume du
mélange réactionnel, d'effectuer avec plus de précautions
les tests de révélation dans un seul puits de la plaque ELISA et
d'utiliser pour la révélation des produits PCR les mêmes
tubes ayant servi pour l'amplification des échantillons ;
Ø d'essayer la technique de PCR-ELISA avec d'autres
modes de préparation d'échantillons, mais pour un coût
raisonnable ;
Ø de poursuivre l'évaluation de la PCR-ELISA sur
les ITS des trypanosomes avec un plus grand nombre d'échantillons.
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