Memoire Online - Etude de la biodiversité microbienne dans un sol polué par les hydrocarbures

La conductivité électrique est mesurée sur l'extrait de sol dilué au 1/5. Elle doit être exprimée en dicisiemens par mètre (ds/m) (BAIZE, 2000). Elle a été déterminée par un conductimètre.

Pour la dilution des échantillons, nous avons besoin d'eau physiologique stérile, tubes Stériles, une micropipette et un vortex, une balance.

Pour l'ensemencement et la purification, nous utilisons des boites de Pétri contenant de la Gélose nutritive ordinaire (GN) et de gélose au cétrimide.

Afin de dénombrer la microflore bactérienne existant dans l'échantillon, la solution mère du Sol est préparé (10gr de sol dans 90mL de bouillon nutritif) suivie d'une série de dilutions Décimales allant de 10 ^-1 (solution mère) à 10^-6en conditions d'asepsie.

On prélève 0,1 ml de chaque dilution préparée qu'on ensemence par étalement sur les boites De Pétri contenant de la GN et de cétrimide à l'aide d'un râteau. L'incubation des boites se fait à 30°C pendant 24h.

Le dénombrement après culture concerne, évidement les cellules viables de l'échantillon Autrement dit, les cellules capables de croitre. Il est basé sur l'aptitude de chaque bactérie, fixée par la solidification du milieu gélosé, à former une colonie visibles à l'oeil nu (AUSTIN, 1988).

Après 24h d'incubation à 30°C, les colonies développées sont dénombrées à l'aide d'un Compteur de colonies en UFC (Unité Formant Colonie).

Arithmétique des résultats obtenus et en tenant compte des facteurs de dilution, selon la formule (MARCHAL et BOURDON ,1982)

Figure 9 : Schéma de l'isolement et de dénombrement des bactéries IIII.3. Observation macroscopique

L'observation macroscopique des colonies permet d'effectuer une première caractérisation (aspect des colonies et de leur revers, la taille et la couleur.

D'après JOFFIN et LEYRAL (2006), les éléments d'identifications macroscopiques sont:

C'est une double coloration qui nous permet de connaître la forme, l'arrangement, la pureté ainsi que la nature biochimique de la paroi des cellules purifiées. Cette coloration est réalisé systématiquement sur les différentes colonies purifiés pour préciser le caractère Gram+ ou Gram-. Avec cette coloration double, les bactéries Gram positive apparaissent en violet foncé tandis que les bactéries Gram négatives sont colorées en rose ou en rouge (DELARRAS, 2008).

-Frotter la pointe dans la goutte d'eau physiologique. Laisser sécher à l'air.

-Passer 3 fois la lame dans la petite flamme du bec Bunsen pour fixer l'échantillon à la

-Déposer quelques gouttes de solution de violet de gentiane (cristal violet) sur le frottis fixé.

-Laisser agir 1 minute. Jeter la solution de Lugol dans un bécher et rincer brièvement à l'H2O.

-Observer au microscope (grossissement 400x ou, avec une goutte d'huile à immersion, au

La coloration au bleu de méthylène permet l'observation de la morphologie cellulaire et la présence ou l'absence de spore (DELARRAS, 2008).

-Chauffer jusqu'à émission de vapeurs sans faire bouillir le colorant ni laisser sécher la

Après 24 h d'incubation, nous passons à l'étape de purification des cultures. Celle-ci

Nous permet d'obtenir des cultures pures à partir des différentes colonies isolées.

La sélection des colonies est basée sur l'aspect macroscopique des colonies à savoir la couleur, la forme, le diamètre, l'opacité. Un échantillon de chaque type de colonie est prélevé et ensuite purifié par repiquages successifs et alternés en milieu liquide, puis en milieu solide jusqu'à l'obtention au sein d'une boite de Pétri de colonies identiques par l'aspect et la couleur (Delarras, 2007).

A partir d'une boite de pétri contient des colonies bien purifie, prélever une colonie bien isolé. -ensemencer dans un milieu BN, incuber a 30 °C /24 avec agitation.

-centrifuger a 6000 rpm pendant 10 min dans des tubes Eppendorf (1ml de la suspension bactérienne)

-ajouter 0.8ml BN stérile et 0.2 solution glycérol stérile a l'Eppendorf qui contient le culot. -vortexer et conserver a -20 °C (congélation).

Elle comporte une série de tests permettant de mettre en évidence le type respiratoire des souches, leur métabolisme énergétique et celle du sulfure d'hydrogène (H2S), la réduction des nitrates. Des activités enzymatiques telles que l'oxydase, la catalase, et les enzymes de transformation des acides aminés (ADH et LDC) ont été également recherchées. Les souches ont été testées aussi pour l'utilisation des citrates, du glucose et de lactose.

La catalase est une enzyme ayant la propriété de décomposer le peroxyde d'hydrogène (H2O2 ) Avec dégagement d'oxygène (Marchal et Bourdon, 1982).

Sur une lame et à l'aide d'une pipette Pasteur, on dépose une colonie bactérienne à laquelle On ajoute de l'eau oxygénée (à 10 volumes = 3%).

La présence d'une catalase est révélée immédiatement par des bulles de gaz qui

Ce test permet la détection de la phénylène-diamine-oxydase ou le cytochrome oxydase Enzyme entrant dans divers couples d'oxydoréduction (Singleton, 1999).

Pour réaliser ce test, un disque d'oxydase préalablement imbibé d'une goutte d'eau distillée Stérile est déposé sur une lame et mis en contact avec une colonie bactérienne fraîchement cultivée.

L'apparition d'une coloration violette immédiatement indique que le test est positif.

- Faire une suspension dense en eau physiologique de la souche à étudier, puis ajouter un disque ONPG

(Utilisation du citrate comme seule source de carbone) Pour réaliser ce test :

Ensemencer la pente selon une strie longitudinale avec une pipette chargée de suspension (préparée à partir d'une culture sur milieu gélosé, en prenant soin de ne pas racler le milieu pour ne pas apporter d'éléments nutritifs susceptibles de fausser les résultats).

-Ensemencer un milieu Clark et Lubs avec quelques gouttes de suspension bactérienne.

-Transférer a l'aide d'une pipette Pasteur environ 0,5 ml de milieu Clark et Lubs dans un tube

- Transférer dans un tube à hémolyse à l'aide d'une pipette Pasteur, environ 0,5 ml de milieu

Ensemencer la gélose par une strie ou un spot de 3 à 5 mm de diamètre, à l'aide de l'anse de platine chargée de culture (plusieurs souches possibles sur la même boîte).

Ensemencer par piqûre centrale à l'aide du fil droit chargé de suspension de la culture à étudier.

-Régénérée la gélose VF par ébullition au bain-marie bouillant pendant environ 30 minutes.

-Ensemencer lorsque le milieu est encore liquide, vers 45°C. L'ensemencement se fait à la pipette Pasteur scellée (ou boutonnée) et chargée. On introduit la pipette Pasteur au fond du tube et on remonte en spirale.

-On place ensuite le tube à l'incubateur (à 37°C) pendant 24 heures (JOFFIN et LEYRAL, 2006).

- Ensemencer chaque milieu avec quelques gouttes de suspension de la culture à étudier. - incuber à 37°C/24h

IIII.6.I. Sélection des bactéries par utilisation de milieux de culture spécifiques IIII.6.I.1.Croissance sur milieu King (King A et King B)

Les milieux de King (milieu King A et milieu King B permettent de différencier entre elles les différences espèces du genre Pseudomonas, par la mise en évidence de la production de pigments spécifiques (MARCHAL et BOURDON, 1982).

- A partir d'une culture sur gélose (faire une suspension), ensemencer le milieu en faisant une strie à la surface de la gélose avec l'anse (ou en déposant une goutte de suspension).

Ensemencer un milieu nitraté avec quelques gouttes de suspension bactérienne. Après incubation (culture visible), ajouter:

Le réactif de Greiss est un mélange des réactifs nitrites 1 & 2 (MARCHAL et BOURDON, 1982).

-Lancer une culture des souches isolées dans du bouillon nutritif et incuber pendant 24heures. -Centrifuger la culture à 3000t/min pendant 10 minutes, récupérer le culot et effectuer un lavage avec msm liquide 5 fois.

-Laver l'agar puis préparer MSM solide, le couler dans des boites préalablement numérotées et les laisser solidifier.

-Après solidification de la gélose (verser une grande couche de la gélose), étaler 100 ul de pétrole filtré sur la surface des boites puis laisser sécher devant le bec benzène 3heures de temps.

- A partir des différents culots, prendre avec une ance stérile une goute et déposer sous forme de spots le concentré de culture dans les carreaux appropriés a chaque souche.

-Laisser sécher devant le bec benzène puis incuber a l'abri de la lumière à 30°C pendant 7 à 15jours et la lecture doit se faire quotidiennement

-Faire la lecture des boites tous les jours pour voir s'il y apparition de zones claire.

(HOHZOH K, 1982) (JYOTHI K, K SURENDRA BABU 2012) IIII.8.Détection de l'activité de biodégradation des bactéries

La croissance bactérienne a été suivie par mesure de la DO par spectrométrie à une longueur d'onde de 595nm de 0heure jusqu'à 15 jours et a des intervalles réguliers de 2 jours (avec MSM comme Blanc).

Echantillon		Site de prélèvement	Description
1		Mascara	Couleur marron foncée.
2		Ouargla	Couleur orange, sableux, sèche.
3		Raffinerie d'Arzew	Couleur noir avec des particules marron foncé, forte odeur de polluant
4		Sfisef	Couleur marron.

				E4
	E3 E1 E2



Figure 10 : Différents échantillons des sols étudiés.

Les valeurs de pH obtenues pour les 4 sols étudiés varient entre 6.08 et 6.73. Les échantillons de sol appartenant à E1, E3, E4 sont des sols acidifiés mais présente des valeurs proche de la neutralité alors que E2 est un sol acidifié. On constate aussi une diminution de la valeur de pH pour E2.

Le pH apparait ainsi comme un paramètre qui influence de manière majeure la structure et la diversité des communautés bactériennes dans les sols, et impose directement une contrainte physiologique sur les bactéries du sol. (NICOLAS T., 2013).

L'activité biologique d'un sol varie avec le pH, la diversité, l'abondance et l'activité de la microflore (bactéries) sont en effet influencées par le pH. Chaque espèce possède une plage optimale de pH, par exemple, Un pH de 7 est optimal pour l'activité des bactéries responsables des transformations de la matière organique, et par conséquent il assure un bon déroulement de la biodégradation des hydrocarbures.

Les échantillons de sols étudiés sont aussi caractérisés par une humidité relative variant de 0.95 à 4.4%. Les valeurs les plus élevées sont celles de l'échantillon d'E4 (4.4%), de l'échantillon d'E3 (4.3%) et d'E1 (4%), l'échantillon E2 présente la valeur d'humidité la plus faible 0.95%.

Les faibles teneurs en eau des échantillons peuvent d'une part être expliquées par les faibles humidités relatives des sols sahariens (MONOD, 1999), il est à noter qu'un faible taux d'humidité peut avoir un effet négatif sur l'activité microbienne en limitant le contact microorganisme / polluant et en inhibant le processus de dégradation enzymatique (LECOMTE, 1995).

ERIKSON et al. (2001) ont montré l'influence de la structure du sol sur le transport de l'oxygène dans ce dernier. Ces auteurs indiquent que plus un sol est dense, moins les nutriments et l'O 2 sont transportés vers la flore indigène du milieu, responsable de la

biodégradation. De même, NAM et al. (2003) ont observé que les agrégats de sols réduisaient la biodégradation. Cependant, dans les zones arides où le sable est la fraction dominante, les micro-organismes et leurs produits de synthèse sont faiblement reliés aux particules du sol (DOMMERGUES ET MANGENOT, 1970).

La valeur de la conductivité électrique de l échantillon E2 est très élevée 14.7 dS/m, les trois autres échantillons présentent des valeurs de conductivité électrique similaires variables de 2.5 à 3 dS/m.

Le résultat du dénombrement sur gélose nutritive obtenus pour les différentes dilutions a permis d'avoir une idée sur la charge bactérienne du site pollué ainsi que de sa diversité. Les valeurs sont rapportées dans les tableaux suivants.

Le dénombrement a montré une charge bactérienne aux alentours de 11.4×10⁶ UFC/g de sol pour l'échantillon 3 et de 59.1×10⁶ UFC/g de sol pour l'échantillon 1, cela ne s'explique que par les conditions éco-climatique du site et la présence des polluants.

En tenant compte uniquement des bactéries cultivables, la variété des aspects, par contre n'est pas très élevée, cela nous a permis de sélectionner à partir de 17 isolats 5 seulement qui sont vraiment différentes sur le plan macroscopique.

Un sol qui contient des hydrocarbures va modifier l'activité des microorganismes. Ceux-ci doivent donc adapter leur activité enzymatique afin de pouvoir s'y attaquer. Les bactéries vont ensuite subir une période de forte croissance au cours de laquelle ils seront capables d'assimiler les produits de la dégradation des hydrocarbures. Cette biodégradation peut prendre plusieurs mois. Une fois qu'ils ont consommé les composés les plus facilement dégradables, leur nombre diminue jusqu'à atteindre de nouveau la taille d'une population normale. (Ce qui explique l'écart au niveau de nombre des souches isolées entre les deux échantillons). Parfois, seule une partie des polluants est dégradés car les hydrocarbures se lient partiellement à la matière organique du sol et deviennent alors moins accessibles aux microorganismes. Le niveau de dégradation des pétroles (mélange de composés facilement dégradables et de composés récalcitrants) est donc totalement dépendant de la diversité métabolique des bactéries hydrocarbonoclastes présentes dans l`environnement pollué. La diversité des espèces bactériennes est un facteur décisif dans la réponse des communautés bactériennes à ce type de variation environnementale. (SAURET C.,2011).

Les colonies sont généralement lisses et ont un diamètre de plus de 1mm, de tous les microorganismes du sol, les bactéries sont les plus nombreuses et les plus petites : la taille de leurs colonies ne dépasse pas en général, 0.5 à 2 mm de diamètre. (ROGET et al,.2001) cité dans (DJAOUD M.,2013).

Les caractères macroscopiques des souches isolées sont regroupés dans le tableau 9. Tableau 9 : Caractères macroscopiques des colonies isolées sur gélose nutritive.

Souche	Taille	Forme	Aspect de surface	Contour	Opacité	Consistance	Couleur
SC	Petite	Allure bombé	Lisse	Régulier	Translucide	Grasse	Banche
SG	Grande	Allure bombé	Lisse	Régulier	Translucide	Grasse	Verte
SH	Grande	Allure bombé	Lisse	Régulier	Translucide	Grasse	Verte
SI	Petite	Allure Demi bombé	Lisse	Régulier	Translucide	Crémeuse	Banche
SJ	Moyenne	Allure Demi bombé	Lisse	Régulier	Opaque	Grasse	Rouge
SL	Grande		Rigoureuse	Dentelé	Opaque	Sèche	Beige

L'observation macroscopique montre des colonies bien séparées avec des caractères spécifiques qui différencient les souches.

Critères	Coloration de Gram		Présence de spores
Critères	Gram	Forme des cellules	Présence de spores
SC	+	Cocci	Spore -
SG	-	Bacille	Spore -
SH	-	Bacille	Spore -
SI	-	Coccobacille	Spore -
SL	+	Bacille	Spore +
SJ	-	Petit bacille	Spore -

D'après les observations, il ressort que les souches isolées sont de forme et de Gram différents. La souche (SB) est une Cocci à Gram positive. Les souches (SG) et (SH) sont des bacilles à Gram négative, la souche (SI) Coccobacille à Gram négative alors que la souche (SJ) appartient à des petits bacilles à Gram négative, tandis que la souche (SL) est bacille à Gram positive.

La coloration de spore a révélé la présence de spore uniquement chez les bacilles, les coques et les colibacilles en sont dépourvus.

Selon PELMONT, (1995), Les caractéristiques des bactéries aptes à biodégrader les hydrocarbures sont les suivantes :

Les figures en dessous illustrent les différents aspects macroscopiques et quelques aspects microscopiques.

Le dégagement des bulles de gaz par les souches (SG), (SI), (SJ), et (SL) révèle la présence de l'enzyme catalase sauf pour les souches (SC), et (SH) qui ne possède pas d'enzyme.

Pour le test de l'oxydase toutes les souches ont un résultat négatif à part les deux souches (SG), et (SH).

Le tableau 12 regroupe les résultats des tests que nous avons effectués sur chacune des souches isolées.

Souches /tests		SC	SG	SH	si	SJ	SL
Enzymes Respiratoires	Catalase	-	+	+	+	+	+
	Oxydase	_	+	+	_	-	-
	Viande foie	Ana Fac	AS	AS	AAF	Ana Fac	AAF
	Nitrate	+	+	_	+	+	+
Métabolismes glucidique	Glucose	-	+	-	-	+	+
	Diholoside	-	-	-	+	-	-
	Gaz	+	-	-	+	+	+
	H2s	-	-	-	+	-	-
	ONPG	+	+	-	-	+	-
	RM	+	+	+	+	-	-
	VP-		-	-	-	-	-
	Mannitol	+	+	+	+	+	+
	Citrate perméase	-	+	+	-	+	+
Métabolisme protéique	ADH	_	+	+	_	_	_
	LDC	+	+	+	+	+	_
	ODC	_	+	+	_	+	_
King A		/	_	_	/	/	/
King B		/	+	+	/	/	/

Mannitol

TSI

Citrate

Clark et Lubs

ONPG

Figure 20 : Résultats des tests biochimiques obtenus (métabolisme glucidique).

ADH

LDC

ODC

Figure 21 : Résultats des tests biochimiques obtenus (métabolisme protéique).

L'identification a pu être réalisée à l'échelle du genre ou de la famille. En effet, parmi les cinq bactéries isolées, nous avons pu affilier les souches comme appartenant aux familles suivantes (BERGEY, 1984 ) :

D'après sa morphologie macroscopique, les souche SG et SH ont été affiliées au genre Pseudomonas en raison de la morphologie de ses petites colonies circulaires, lisses et brillantes. Ces souches ont une forme bacillaire, isolées ou en amas avec les caractéristiques suivantes : Gram négatif, oxydase positive, catalase positive, non sporulées. Ceci nous a orientés vers la culture de ces souches sur milieux King A et King B spécifiques des Pseudomonas.

La révélation d'une couleur bleu verte sur King A et un jaune verdâtre fluorescent sur King B confirme l'appartenance au genre Pseudomonas (Figure 22). Ces bactéries ont un caractère aérobie strict, ADH et citrate positif (BERGEY, 1984 ;LARPENT, 1992 ; PREVOT, 1961 et SINGLETON, 1999). Une identification biochimique (tableau 12) a permis de différencier ces souches bactériennes et de les identifier au tant que : Pseudomonas putida (SH) et Pseudomonas fluorescens (SG).

L'incapacité de la souche SH à dégrader le mannitol avec ONPG positive (tableau 12) nous permet de supposer qu'il s'agit de Pseudomonas putida. (LEYRAL et JOFFIN, 1998).

Les colonies de la souche SG sont incolores dans le milieu King A et elles sont de couleur jaune dans le milieu King B. A coté de ce paramètre, les caractères biochimiques permettent de déduire que cette souche correspondrait à P.fleoresens. (LEYRAL et JOFFIN,1998).

Ce sont de petits Coccobacille G- de 0,9 um sur 1,36 um, immobiles. La souche (SI) répond positivement au catalase et de nitrate réductase, ainsi que l'ONPG. Elle n'utilise pas le glucose. Elle produit l'H2S, et peut utiliser les nitrates. Elle est LDC positive mais ADH et ODC négative. D'après les résultats des tests biochimiques (tableau 12) et par comparaison avec ceux établis par BERGEY (1984), il est probable que la souche (SD) correspondrait à l'espèce Acinetobacter sp.

En raison de la morphologie de leurs cellules en forme de bacilles (figure 6), Gram positif, sporulés (tableau 10) catalase positive, oxydase négative et un citrate perméase positif (tableau 12). La souche (SL) a été affiliée au genre Bacillus.

La souche (SL) a un ONPG, ADH, LDC et ODC négatives, elle oxyde le glucose et le saccharose, ne produit pas H 2 S (tableau 12). D'après ces caractéristiques, cette souche pourrait être Bacillus sp. (BERGEY, 1984 ; LEYRAL et JOFFIN, 1998).

La souche (SC) est apparentée au genre Enterococcus en raison de sa forme de chaînettes. Les colonies blanches, régulières et lisses (figure 22). Cette souche n'oxyde pas le glucose, à mobilité, oxydase négative et résistante (NACL= 6).

D'après les résultats des tests biochimiques et par comparaison avec ceux établis par BERGEY (1984), il est probable que la souche SC correspondrait à l'espèce Entérococcus sp.

La souches (SJ) a été rattachée à la famille des Enterobacteriaceae et présente les caractéristiques suivantes : une forme bacillaire (figure 22), à Gram négatif, catalase positive et oxydase négative. L'étude des caractères biochimiques, nous a permis de rattacher la souche (SJ) au genre Serratia.

La souche bactérienne (SJ) est mobile, capable d'utiliser le citrate de sodium comme unique source de carbone, elle est ONPG positive, LDC, ADH, ODC, indole et VP négatives (tableau12). Compte tenu de ces résultats, l'espèce serait probablement Serratia marcescens (BERGEY, 1984, LEYRAL et JOFFIN, 1998).

La synthèse des résultats obtenus et leur comparaison à ceux de nombreux auteurs (BERGEY, 1974 ; MARCHAL, 1987 ; LARPENT et al., 1990 et LARPENT et al., 1998) nous conduisent aux conclusions suivantes :

Après une incubation de 5 jours à l'obscurité, les colonies qui montrent une dégradation sont entourées de zones claires sur la surface opaque de la gélose. Cette technique s'appelle: (OIL SPREADING THECHNIQUE) (HOHZOH K et al., 1982).

Après l'incubation des boites, la lecture se fait quotidiennement pour voire s'il y a eu apparition de zones clair.

La biodégradation des hydrocarbures se manifeste par l'apparition de zones claires sur le milieu de culture. Cette méthode s'avère, simple et pratique pour l'isolement des bactéries qui ont le potentiel de dégrader les hydrocarbures.

Ces bactéries isolées sont capables de digérer le pétrole et cette méthode peut être applicable pour la détection de souches qui dégradent d'autres hydrocarbures non volatiles.

Cette méthode peut être utilisée aussi pour l'étude de la dégradation du naphtalène, phénanthrène, et l'anthracène en plus de la détection des bactéries mutantes, auxotrophes

Dans quelques cas, il y a eu des colonies qui ont montré une dégradation du pétrole vaporisé sur la gélose, et qui ont donné des zones beaucoup plus importantes que celles observées dans le travail de ce dernier. Le diamètre des zones varie de 2 mm à 10 mm, et cela est important comme résultat par rapport aux résultats cités dans la littérature. (HOHZOH K et al., 1982).

La variation de biomasse au cours de temps (jour) des quatre souches testé au cours de croissance dans le milieu de sels minéraux (MSM) additionné de 1% de pétrole brute comme seul source de carbone et de phénol a été suivi en mesurant la concentration microbienne en fonction du temps ce qui nous a permis de tracer les courbes représentées par les figure (24,

25, 26, 27 et 28). Les valeurs de Log UFC/ml en fonction du temps sont données dans les tableaux (voir annexe).

Figure 24 : Cinétique de croissance d'une souche bactérienne (SI) durant la
biodégradation du pétrole et du phénol.

Figure 25 : Cinétique de croissance d'une souche bactérienne (SL) durant la
biodégradation du pétrole et du phénol.

Figure 26 : Cinétique de croissance d'une souche bactérienne (SH) durant la
biodégradation du pétrole et du phénol.

Figure 27 : Cinétique de croissance d'une souche bactérienne (SG) durant la
biodégradation du pétrole et du phénol.

Figure 28 : Cinétique de croissance d'une souche bactérienne (SJ) durant la
biodégradation du pétrole et du phénol.

Cinétique de croissance des souches bactériennes testées (dégradation du pétrole)

D'après les figures (24, 25, 26, 27 et 28) on observe une similarité de trajet de croissance pour les cinq souches testés toutes presque présentent le même troc .La croissance pour les cinq

souches commence par un DO= 5, puis on observe une augmentation de la croissance de T0 jusqu'à 30 minutes puis une augmentation exprimée par un phase de croissance exponentielle courte .Cette augmentation ralentie correspond a la phase stationnaire pas fixée dans même valeur mais presque stable, observée a partir d'une heure a 24 heures pour les 5 souches et après la 5 éme heure il ya une recroissance de biomasse des souches jusqu`à un valeur maximale (DO SI =6.456) (DO SL =6,453) (DO SH =6,369) (DO SG =6,447) (DO SJ =6,429). Cette DO atteint son maximum à la fin de l`incubation.

Les variations des densités optiques (DO) constatées dans les milieux de culture des différentes souches bactériennes étudiées (SI, SL, SH, SG, SJ) peuvent être dues à la distribution différente de ces bactéries entre les deux phases de notre culture, ou par leur vitesse d`adaptation au substrat utilisé (AKMOUCI, 2009).

L`absence de phase latence démontre une adaptation plus rapide des souches étudiées à la source de carbone utilisée (hydrocarbure pétrole), ils ont dégradé les fractions soluble des hydrocarbures pétrolières.

Par ailleurs, l`augmentation de la biomasse microbienne correspondrait à la phase exponentielle, phase durant laquelle la dissolution du substrat «hydrocarbure pétrole» suffit aux besoins métaboliques des souches. Ainsi, La stabilisation de la concentration microbienne au-delà d'une heure montre que le niveau des exigences nutritionnelles surpassent la vitesse de dissolution du substrat, la biodisponibilité deviendra alors limitant (ROCHA et al. 2007), la diminution explique peut être par la migration de la cellule vers le nutriment par augmentation de hydrophobicité pour facilité l`accession de hydrocarbure. Puis on observe encore une 2 éme phase exponentielle s'explique par la richesse du milieu par des composés facile à dégrader qui s'exprime aussi par un indicateur biologique de croissance élevé.

Cinétique de croissance des souches bactériennes testées (dégradation du phénol)

On observant l'évolution de la croissance pendant 24 heures dans des courbes des (24, 25, 26, 27 et 28). Au temps initial de la croissance, la concentration microbienne diminue pour les souches (SI, SH, SG, SJ) durant le premier temps (30 minutes) au même temps il y a une augmentation notable de croissance de souche SL. Pour 1 heure on remarque une perturbation des valeurs de la concentration microbienne pour toutes les souches et après 3

heures il ya une recroissance de biomasse des souches jusqu`à une valeur maximale (DO SI =5,481) (DO SL =5,610) (DO SH =5,574) (DO SG =5,279) (DO SJ =5,279).

Ce résultat peut être expliqué par l'adaptation des cellules au phénol comme seule source de carbone, la cinétique de biodégradation est plus rapide, et le phénomène de biodégradation se déclenche immédiatement après la mise en culture des cellules adaptées (SL), contrairement aux cellules non adaptées (SI, SH, SG, SJ).

L'amélioration de la capacité des microorganismes adaptés au phénol à le biodégrader se manifeste par l'amélioration de la cinétique de croissance des cellules bactériennes, ainsi que l'augmentation du taux de croissance des bactéries libres Les cellules non adaptés prennent plus de temps à croître et à consommer (biodégrader) le phénol. Ces résultats sont conformes avec les travaux de SHIMP et al .,(1987)

Etude de la biodiversité microbienne dans un sol polué par les hydrocarbures

III.2.3. Conductivité électrique (CE)