25
II.2. Types de biodégradation
26
II.2.1. Biodégradation aérobie
Selon ZHENPENG et al.,(2002), La biodégradation
aérobie d'une substance organique est le degré de modification
physique et chimique que subit cette matière organique par les
microorganismes. Celle-ci peut être affectée par la modification
de l'un des facteurs suivants :
· Vitesse de dégradation des composés
organiques.
· Quantité de l'oxygène consommée.
· Produits résultant de la dégradation.
· Activité microbienne.
Figure 4 : Dégradation du naphtalène en
salicylate par voie intradiol par des bactéries
aérobies du
genre Pseudomonas (VANDECASTEELE, 2005).
II.2.2. Biodégradation
anaérobie
La biodégradation anaérobie d'une substance
organique est le degré de modification physique et chimique que subit
cette matière organique par les microorganismes en conditions
d'anaérobiose. La figure 2 illustre les processus de
biodégradation que subit la matière organique en condition
anaérobie (HONGWIE et al., 2003).
II.3. Facteurs affectant la biodégradation des
hydrocarbures dans l'environnement
La biodégradation des hydrocarbures est l'un des
premiers mécanismes conduisant à la transformation de ces
polluants en produits moins toxiques. Les travaux de recherche sur l'oxydation
des hydrocarbures par les microorganismes ont montré que ce processus
dépend de la structure chimique des hydrocarbures et des conditions
environnementales (COSTES et DRUELLE, 1997). Les facteurs
physicochimiques influant sur la vitesse de biodégradation microbienne
sont :
A.
27
La structure du sol et leur nature (composition structure et
surtout diffusion d'oxygène).
B. La composition du polluant selon SOLTANI (2004)
(la vitesse de biodégradation est plus élevée pour
les hydrocarbures saturés, viennent en suite les aromatiques
légers, les aromatiques à haut poids moléculaire).
C. Température (entre 25°C à
37°C.)
D. Ressources en oxygène ; sous forme d'oxygène
pure, air atmosphérique ou le peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2)
E. La pression et l'humidité
F. Les nutriments (azote et phosphore en particulier)
G. Le potentiel d'hydrogène (entre 6 et 8)
H. Effet de la salinité
II.4. Biodégradation du pétrole
brut
La spécificité des substrats à l'attaque
microbienne a été largement étudiée. ATLAS 1981
et LEAHY et COLWELL (1990), ont classé les composés du
pétrole en quatre familles. Ces composés différents par
leur susceptibilité à l'attaque microbienne. Ainsi la vitesse de
biodégradation est plus élevée pour les saturés,
viennent ensuite les aromatiques légers, les aromatiques à haut
poids moléculaire, les composés polaires ayant la vitesse de
dégradation la plus faible.
Les hydrocarbures saturés incluent les n-alcanes, les
alcanes ramifiés et les cycloalcanes. Les alcanes à chaines
linéaires sont les plus abondants des hydrocarbures totaux dans le cas
du pétrole léger et peuvent atteindre dans certains cas 60%, les
plus rapidement dégradable tels les n-alcanes à nombre de carbone
supérieur à 44 peuvent être métabolisés par
les microorganismes et ceux ayant de 10 à 24 atomes de carbone (C10-4)
sont généralement les plus facilement dégradables. Les
alcanes ramifiés sont plus récalcitrants à la
biodégradation que les n-alcanes et plus le nombre de ramification
augmente, moins ces composés sont susceptibles à la
biodégradation microbienne. Les hydrocarbures cycliques constituent une
fraction importante des hydrocarbures dans la plupart des bruts
pétroliers, ils sont difficilement dégradables que les deux
séries précédentes à cause de leur toxicité
suite à l'interaction avec la membrane cellulaire des microorganismes
(SIKKEMA et al., 1995).
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Les expériences montrent de façon
équivoque que la biodégradation des cycloalcanes est très
limitée (ATLAS 1981). La non accumulation des hydrocarbures
cycliques dans l'environnement implique des phénomènes non
conventionnels de dégradation telle que l'intervention des
phénomènes de Co-oxydation impliquant plusieurs souches
microbiennes dont l'équipement enzymatique est complémentaire
(BERTRAND et al., 1989, ROTANI et al.,1992).
II.5. Biodégradation par type
d'hydrocarbure
En aérobiose, de nombreuses bactéries ont
développé des stratégies enzymatiques qui leur permettent
d'incorporer un ou deux atomes d'oxygène à la molécule
cible. Cette réaction d'oxydation rend l'hydrocarbure plus hydrophile et
par conséquent plus facilement dégradable par le
métabolisme bactérien. Les réactions impliquées
dans ces processus font le plus souvent appel à l'action
d'oxygénases (mono- ou dioxygénase). L'acquisition par les
organismes des gènes de dégradation des hydrocarbures se fait le
plus souvent par transfert horizontal via des plasmides, des transposons
(PHALE et al., 2007).
II.5.1. Biodégradation des hydrocarbures
saturés II.5.1.1. Voies de dégradation des alcanes
linéaires
La dégradation aérobie des alcanes est
amorcée par l'introduction d'un atome d'oxygène sur la
chaîne aliphatique via l'action d'une monooxygénase pour former un
alcool linéaire. Cette réaction peut être
réalisée par des cytochromes P450 (SARIASLANI et OMER, 1992),
des méthanes monooxygénases et des systèmes
d'hydroxylases à fer non hémique appelés « alcane
hydroxylase » qui semblent être les plus répandus dans la
dégradation des alcanes (VAN BEILEN et al., 2001).
II.6. Biodégradation oxydative des HAPs par les
bactéries
Une grande variété de bactéries à
Gram-positif et Gram-négatif ont été isolées et
caractérisées pour leur capacité à
métaboliser les HAPs. Si la dégradation bactérienne des
HAPs à faible poids moléculaire tels que le naphtalène, le
phénanthrène, ou encore l'anthracène est clairement mise
en évidence et présente des similarités importantes
(CERNIGLIA, 1992), les mécanismes intervenants dans celle des
HAPs à cinq cycles aromatiques ou plus tels que le Benzo Pyrène
restent encore à explorer. Les HAPs peuvent être
dégradés et minéralisés par un seul organisme ou
par cométabolisme. Les bactéries oxydent initialement les HAPs
par l'incorporation de deux atomes d'oxygène via l'action d'une
dioxygénase entraînant ainsi l'oxydation d'un cycle aromatique.
L'étape initiale d'attaque des HAPs peut être
réalisée via
29
une monooxygénase, une dioxygénase, ou par
oxydation du groupement substitué par l'action de monooxygénase
(GIBSON et PARALES, 2000 ; KHAN et al., 2001 ; WILLIAMS et SAYERS, 1994).
A l'issu de plusieurs réactions biochimiques, l'attaque par une
dioxygénase conduit à un cis-dihydrodiol caractéristique
de la dégradation bactérienne. Les produits sont par la suite
minéralisés ou incorporés en biomasse cellulaire
(dépendant du nombre de cycles et de substitutions). La
dégradation du naphtalène par clivage intradiol est la mieux
connue et constitue la référence pour la dégradation des
HAPs. L'étape initiale de la dégradation du naphtalène,
catalysée par la naphtalène dioxygénase (NahAc) implique
l'incorporation de deux atomes d'oxygène pour former le
cis-1,2-naphtalène dihydrodiol. Les étapes enzymatiques suivantes
aboutissent à la formation de salicylate et sont spécifiques des
composés polyaromatiques (EATON, 1994).
II.7. Microbiologie classique
La microbiologie, selon la technique utilisée, permet
de définir les trais morphologiques, physiologiques et/ou
métaboliques des microorganismes d'un écosystème
donné (HEITKAMP et al., 1988). La majeure partie des
connaissances concernant la biodégradation des hydrocarbures dans
l'environnement a été acquise à partir d'études
basées sur l'isolement de microorganismes hydrocarbonoclastes
(WATANBE et HAMAMURA, 2003).
L'isolement présente comme avantage essentiel de
pouvoir travailler sur des souches pures et ainsi d'étudier
précisément un microorganisme et certaines de ses fonctions. Il
est par exemple possible de caractériser in vitro les mécanismes
biochimiques et moléculaires impliqués dans la dégradation
d'un hydrocarbure. Cependant, les souches hydrocarbonoclastes isolées ne
sont pas forcément représentatives des capacités
métaboliques de la communauté naturellement présente
(THOMPSON et al., 2005).
En effet, seul 1% des bactéries d'une communauté
serait cultivable en condition de laboratoire (AMANN et al., 1995), le
principal biais de ces techniques étant une sous-estimation importante
de la diversité soit une sous-estimation des capacités
métaboliques de la communauté étudiée. Aussi, les
cinétiques de biodégradation d'un polluant in vitro sont
très différentes de celles observées dans l'environnement
(WATANBE et BAKER, 2000).
Toutes ces méthodes, à l'exception des comptages
directs, sont dépendantes de la culture des microorganismes. Afin de
s'affranchir de tels biais, des approches biochimiques et moléculaires
ont été développées au cours de ces vingt
dernières années. La simple utilisation de techniques de
microbiologie classique ne permet pas la caractérisation de
communautés complexes. Elles sont aujourd'hui généralement
utilisées en complément d'approches moléculaires afin
d'apporter des informations complémentaires sur la communauté
30
bactérienne étudiée. Au début du
XXème siècle, la classification des microorganismes reposait sur
des critères morphologiques observés par microscopie ou cultures
pures sur boites de Petri. A cette époque, les microbiologistes
étaient conscients que ces méthodes étaient restrictives
et insuffisantes pour distinguer les espèces les unes des autres
(JANSSEN, 2006).
Matériels et méthodes
I. Objectif
Notre travail a pour objectif d'essayer de réhabiliter un
sol agricole contaminé par les hydrocarbures pétroliers en
utilisant des souches bactériennes.
Ce chapitre a pour but de décrire les différents
protocoles et méthodes mis en oeuvre au cours de ce travail. Certains
protocoles sont détaillés en annexe.
II. Milieux de culture
Gélose nutritive : GN (la composition voir annexe) : un
milieu d'isolement et de purification Gélose au cétrimide (la
composition voir annexe) : un milieu sélectif, qui permet l'isolement
des Pseudomonas et notamment de P.aeruginosa. Ce milieu,
proche du milieu King A, favorise aussi la production de pigments par
P.aeruginosa.
BN (la composition voir annexe) : un milieu destiné
à obtenir une croissance rapide du microorganisme
étudié.
MSM (la composition voir annexe) : un milieu des sels
minéraux
III. Matériel biologique :
Pour la réalisation de nos expériences, nous
avons utilisé des échantillons de sols contaminés par les
hydrocarbures prélevés au niveau des champs de Mascara, Ouargla,
la raffinerie d'Arzew (Sonatrach, compagnie Algérienne de
pétrole). Un autre échantillon est prélevé d'un sol
n'ayant pas subit de rejets pétroliers, il s'agit de sfisef. Afin de
déterminer la répartition des bactéries telluriques en
fonction du degré de pollution du sol par les hydrocarbures.
31
Figure 5 : Site d'échantillonnage de Mascara
(Google, 2018)
32
Figure 6 : Site d'échantillonnage d'Ouargla
(Google, 2018)
Figure 7 : Site d'échantillonnage d'Arzew (Google,
2018)
33
Figure 8 : Site d'échantillonnage de Sfisef
(Google, 2018)
IIII. Méthode
IIII.1.Echantillonnage
L'échantillonnage est effectué au centre de
chaque site. Les prélèvements ont été
réalisés à l'aide d'une spatule stérile à
une profondeur de 20 cm. Pour chaque échantillon, 1Kg de sol
prélevé est mis dans des flacons en verre stériles. Les
échantillons de sols obtenus sont ensuite tamisés à 5 mm
puis à 2 mm pour éliminer les éléments grossiers et
les débris organiques. Les échantillons de sols sont
conservés au frais (environ 4°C) (CHAUSSOD et al, 1992 ;
FARDOUX et al, 2000).
IIII.2. Analyses physico-chimiques IIII.2.1. Teneur en
eau ou humidité
Nous avons procédé à la
détermination de la teneur pondérale en eau du sol par la
méthode gravimétrique selon la norme NF ISO 1146. Elle s'exprime
en % c'est-à-dire en gramme d'eau pour 100 g de sol
déshydraté à 105°C. Le taux d'humidité
s'exprime en % selon la formule suivante : H% = P 1 - P 0 / P
0
P 0 : poids de la prise d'essai du sol (g).
P 1 : poids de la prise d'essai de sol
après séchage à 105°C (g).
IIII.2.2. Potentiel d'hydrogène (pH)
Le pH est déterminé selon la norme AFNOR X
31-103 (AFNOR, 1994) par la mesure du pH d'une suspension de sol dans l'eau
à 2/5 (rapport masse/volume) après 1 heure d'agitation puis
décantation à l'aide d'un pH mètre.
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