Memoire Online - Epidemiologie et caracterisation moleculaire de salmonella et shigella, chez les patients souffrants de diarrhée aiguë à N'Djamena au Tchad

Epidemiologie et caracterisation moleculaire de Salmonella et Shigella, chez les patients souffrants de diarrhéeaiguë à N'Djamena au Tchad.

Professeur Titulaire, CAMESen Gastro/Enterol/Hepathologue ,Université de CAMES, Université de N'Djaména(Tchad);

Président : ABDELSALAMTidjani, Professeur Titulaire, Nutrition et Technologie Alimentaire Université de N'Djamena (Tchad);

Rapporteur : DJOUM Richard, Professeur Titulaire de Virologie et Biologie Moleculaire, Centre Pasteur de Yaoundé ( Cameroun) ;

Rapporteur : BESSIMBAYE Nadlaou,MC en Microbiologie, Université de N'Djamena ( Tchad);

Examinateur : ABDERRAZZACK ADOUM FOUDA, MC en Microbiologie et Immunologie , Université de N'Djamena ( Tchad);

Directeur de Thèse : ALI MAHAMAT MOUSSA, Professeur Titulaire en Gastro Hepatho/Enterologie,Université de N'Djamena ( Tchad);

DEDICACES

ü A ma mère, pour le soutien incontestable tout au long de ma vie estudiantine,

ü Mon feu Père, N'gare Hassan ; Papa, là où tu es actuellement trouve dans ce travail le résultat de tous tes sacrifices et prières de même que l'expression de tout mon amour à ton égard. J'aurais voulu que tu sois présent pour partager ces moments. Que Dieu t'accepte dans son royaume céleste.

ü A tous les membres de ma famille, recevez à travers ce document ma profonde considération

ü A mes bienfaiteurs, pour votre amour, votre chaleureux soutien et votre enthousiasme à mon égard ;

Remerciements

Ce travail a pu être réalisé grâce au soutien des institutions et aux conseils de nombreuses personnes ; qu'il nous soit permis de les remercier :

Aux autorités de l'Université de N'Djamena en particulier à la Presidence de l'Université de N'djamena, nous exprimons toutes nos salutations et nos remerciements. Ce travail réalisé est le fruit d'une collaboration internationale entre le Laboratoire de Biochimie et ImmunuologieAppliqué(LABIA) à l'Université Joseph Ki-Zerbo au Burkina Faso.

ü Au président de l'université de N'Djamena, MAHAMAT SALEH DAOUSSA HAGGAR maitre de conférences, spécilialitéMathématique, Enseignant à la faculté des sciences exactes et appliqués, qui a donné toute sa vie pour faire de cet institut un pôle africain de référence en matière de recherches scientifique et biomédicale. Merci pour m'avoir permis de poursuivre la réalisation de mes rêves dans la vie scientifique et surtout d'avoir approuvé mon stage de thèse au sein de cette illustre institution de recherche dont vous dirigez. Que le bon Dieu vous accompagne dans votre vie de chaque jour, qu'il vous comble de sa riche bénédiction.

ü A notre Maître et Directeur de thèse Pr Ali Mahamat Moussa, Professeur Titulairede Gastro-EnteroHépatologie,enseignant à la faculté des sciences et santé humaine.Cher Professeur, vous avez su à la fois me laisser toute l'initiative et rester disponible pour me faire profiter de l'entendu de votre savoir et la profondeur de vos idées pour mieux orienter ce travail .Cher Maître, qu'il nous soit permis ici de vous témoigner toute ma reconnaissance de m'avoir accepté comme thésard. Vos qualités sont admirables. Votre amour pour le travail bien fait, votre disponibilité et votre courtoisie nous ont toujours impressionnés. Que le bon Dieu vous accorde sa riche bénédiction et sa protection divine.

ü Pr Aly SAVADOGO, Professeur Titulairede Biochimie-Microbiologie Je vous suis très reconnaissant et exprime toute ma profonde gratitude, Merci pour toutes les remarques que vous nous avez apportées pour l'amélioration du document. Recevez toute ma reconnaissance et gratitude,

ü A la Direction du CHU de la Mère et de l'Enfant de N'Djamena, pour m'avoir accepté dans son institution pour ma recherche et réalisation de mes travaux,

ü M AHMAT MAHAMAT AHMAT, YACOUB MAHAMAT ALLAMINE, AMINA KANIKA, ADOUM MAHAMAT OUMAR, AFFAF IDRISS et Dr OUMALKHER YOUSSOUF, membre du groupe de recherches et d'avoir accepté de nous suivre dans la réalisation de plusieurs de nos travaux de recherches. Que Dieu vous bénisse.

ü A la Direction du Centre Hospitalier Universitaire Mere et EnfantQu'il nous soit permis de remercier très sincèrement les responsables du CHU ME qui nous ont permis de faire la collecte dans leur institution. Merci à vous.

ü Aux Responsables des Hôpitaux des Districts Qu'il nous soit permis de remercier très sincèrement les responsables des Hôpitaux qui nous ont permis de faire la collecte dans leur institution. Merci à vous.

ü Aux Techniciens de Laboratoire de Recherche Diagnostic et expertises Scientifiques (LaboREDES).Qu'il nous soit permis de vous remercier très sincèrement pour vos conseils et votre bonne collaboration.

ü Aux Techniciens de Laoratoire du Centre Hospitalier Universitaire Mere et Enfant (CHU ME)Qu'il nous soit permis de vous remercier très sincèrement pour vos conseils et votre bonne collaboration.

ü A mes Collaborateurs du Programme National de Lutte Contre les Cancers Un grand Merci à vous. Vous avez toujours été à mes côtés pour m'encourager et prodiguer des conseils pour arriver à terme de cette thèse Trouver en ce travail votre récompense,

ü DR CISSE HAMACher Dr et toute votre équipe, retrouver ici l'expression de nos sincères remerciements. Vous nous avez ouvert la porte de votre laboratoire en nous aidant à réaliser la partie moléculaire de ce travail de thèse. Merci infiniment pour votre bonne collaboration.

Grace à vous, nous avons eu à bénéficier d' une bourse de terrain qui nous à permis de nous descendre sur le terrain et payer des reactifs, qu'il nous soit permis de vous adresser toute notre reconnaissance.

Liste des sigles et Abreviations

BLSE/ESBL : Bêta-Lactamases à Spectre Élargi/ Estended-Spectrum-Beta- lactamases.

CA-SFM : Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie.

CDC : Center for Diseases Control and prevention/Centre Américain pour le Contrôle

CLSI : ClinicalLaboratory Standards Institute/Institut de Normes de Laboratoire

CNRVC-IPP : Centre National de Recherche des Vibrions et de Choléra-Institut Pasteur de Paris.

ICMSF : International Commission on Microbiological Specifications for Foods

INSEED : Institut National des Statistiques et des Études Économiques et Démographiques.

MDR : Résistance à de multiples antibiotiques, traduit de l'anglais « Multi-Drug

NCCLS : National Committee for ClinicalLaboratory Standards /Comité National pour les

PFGE : Pulsedfield gel electrophoresis/Electrophorèse Gel d'agarose en champ pulsé.

RPLA : Reverse Passive Latex Agglutination/ Agglutination Inverse Passive du Latex.

UNICEF : United Nations International Children's Emergency Fund/Fonds des Nations

Liste des figure

Figure 1 : Salmonella au microscope électronique........................................................15

Figure2: Shigella sonnei (cliché Wadsworth center, 2007)...............................................34

Figure3:Généralités sur les entérobactéries.................................................................35

Figure 4 : modification morphologique d'une souche Bactérienne............................................46

Figure 5: Schéma récapitulatif des quatre..................................................................47

Figure 6 : Représentation schématique des cinq familles de pompes d'efflux............................48

Figure7; : Centre Hospitalier Universitaire de la Mère et de l'Enfant.............................................51

Figure8;Carte de la zone d'étude..............................................................................52

Figure 9. Prélèvement des selles.............................................................................54

Figure 10 : Ecouvillonnage humide..........................................................................55

Figure11 : pré-enrichissement dans RV avant 24h et après 24h.........................................56

Figure12:RV isolé sur gélose Kektoen.....................................................................57

Figure 13: Hemoculture Negative...........................................................................60

Figure 14: Hemoculture Positive............................................................................60

Figure 15: Salmonella typhi sur Hektoene colonies vertes au centre noir...............................70

Figure 16 : Shigella sur Hektoene colonies vertes transparents..........................................71

Figure17: identification sur galerie API 20 E Salmonella typhi differenciation biochimique.......71

Figure18:identification sur galerie API 20 E Shigella flexneri différenciation biochimique.........71

Figure 19 : Répartition mensuelle des cas de diarrhées et agents bactériens isolé....................72

Figure20:Distribution des germes isolé dans les hôpitaux de districts et CHU ME...................73

Figure 21 : Migration des réplicons de salmonella........................................................80

Figure 22: Dendrogramme basé sur des empreintes de (GTG)5-PCR sur les souches cliniques de Salmonellaselon l'algorithme de l'UPGMA...............................................................81

Liste des tableaux

Tableau II:Taxonomie de Salmonelle ......................................................................17

TableauIII:Pouvoir Pathogène des Salmonella isolé chez l'homme et les animaux..................18

Tableau IV : Description des principales épidémies d'origine alimentaire dues à Salmonella....................................................................................................................24

Tableau V : Distribution des cas confirmés de salmonelloses par serovars chez les humains, 2008-2009 (EFSA Journal, 2011....................................................................................25

Tableau VI : Répartition des 15 sérotypes de Salmonella humains les plus fréquents isolés de quelques pays africains en nombre et en pourcentage ((Hendriksen et al., 2011))....................26

TableauVII:Sérotypes de Salmonella isolés à N'Djamena au Tchad ..................................27

TableauVIII :caractères biochimiques différentiels des entérobactéries pathogènes.................57

TableauIX :Disques des antibiotiques choisis pour les tests de la sensibilité...........................61

TableauX : Répartition des patients selon l'âge et la provenance.........................................69

TableauXI :Aspects et consistance des selles selon l'âge.................................................70

Tableau XII : Répartition des agents bactériens selon le sexe............................................73

Tableau XIII :Analyse de l'efficacité des 14 antibiotiques face aux agents bactériens isolés......76

RESUME

Dans les pays en voie de développement, les maladies infectieuses d'origine alimentaire, principalement attribuables aux genres Salmonella et Shigella, représentent un problème de santé majeur. Les Salmonella et Shigella, sont des espèces bactériennes les plus courantes impliquées dans divers types d'infections, y compris la septicémie et la gastro-entérite. Ceux-ci impliquent plusieurs clones bactériens présentant une résistance aux multimédicaments, ce qui les rend difficiles à traiter. L'objectif de notre étude était détecter les espèces de Salmonella et Shigella dans les échantillons pathologiques de selles et du sang, afin d'évaluer leur prévalence en relation avec les facteurs de risque, de caractériser leur profil de résistance face aux antibiotiques, et de reconstruire leur arbre phylogénétique pour comprendre leur origine.

Les échantillons ont été prélevés auprès de patients hospitalisés et de patients externes dans quatre hôpitaux de district à savoir : hopital de distrisctEst ,Hopital de District Centre , Hopital de district Sud, Hopital de district Nord ainsi qu'au Centre Hospitalier de la Mère et de l'Enfant, sur une période s'étendant de juin 2021 à décembre 2023. Les selles des patients du CHU ME ont été prélevées dans des flacons stériles, tandis que des écouvillons ont été utilisés pour les patients des hôpitaux de district de N'djamena. De plus, le sang des patients présentant une fièvre supérieure à 38 degrés Celsius a été utilisée pour l'hémoculture. Le test de sensibilité antimicrobienne a été réalisé à l'aide de la méthode CA-SFM /EUCAST et les souches ont été identifiées par des tests microbiologiques conventionnels.

L'ADN bactérien a été extrait par méthode d'ébullition. (GTG) -PCR a été utilisé pour le sous-typage de la souche. Le logiciel Dendro- UPGMA a été utilisé pour regrouper les souches à partir des empreintes génétiques obtenues par (GTG) -PCR.

Un total de 1350 patients a été enregistré dans quatre hôpitaux de district ainsi qu'au Centre Hospitalier Universitaire de la Mère et de l'Enfant pour des cas de gastro-entérites aiguës.

cinquante(50) souches ont été isolées, dont trente (30)Shigella et vingt (20) Salmonella. Nous avons observé une différence significative dans l'incidence des infections bactériennes chez les enfants de 0 à 5 ans et les adultes de plus de 21 ans par rapport aux autres groupes (p = 0,01).

Les profils de sensibilité aux antibiotiques des souches Salmonella et Shigella étaient diversifiés : Salmonellaenterica et Shigellabongori. Nous avons constaté que 82,3 % des bactéries étaient résistantes aux antibiotiques de la famille des bêta-lactamines, notamment l'ampicilline, l'amoxicilline et l'amoxicilline + acide clavulanique, ainsi que la céftriaxone. La majorité des souches étaient sensibles à la gamme d'antibiotiques testée, notamment la quinolone (acide nalidixique, ofloxacine et ciprofloxacine), à l'exception de certains antibiotiques de la famille des bêtalactamases, qui ont montré une sensibilité réduite à l'ampicilline et à l'amoxicilline + acide clavulanique. Par ailleurs, pour évaluer les relations phylogénétiques et établir des liens épidémiologiques entre les souches de Salmonella isolées au cours de notre étude, nous avons caractérisé vingt isolats bactériens de Salmonella par PCR (Polymérase Chain Reaction) GTG5, puis regroupé les souches en utilisant le logiciel DendroUPGMA sur la base des empreintes génétiques obtenues par PCR GTG5.

Le den- drogramme obtenu à l'aide de l'empreinte génétique a permis de regrouper les souches de Salmonella en 20 groupes (G1 à G20).

Cette étude souligne l'ampleur du problème de santé publique posé par ces bactéries chez les populations tchadiennes. Elle met en évidence la nécessité de surveiller de près le profil antibiotique afin d'assurer une antibiothérapie efficace et de mettre en place des programmes de prévention adaptés à la santé publique. La circulation de telles souches nécessite des études plus poussées pour mieux connaitre l'origine et leur mode dissémination.

Le test Rep-PCR (GTG) a permis un typage moléculaire rapide des souches de Salmonella. Les souches des Salmonella typées dans cette étude appartiendraient à différents clones.

Mots clés : Diarrhée aigüe, Identification, Antibiotiques, épidémiologie, N'Djamena.

ABSTRACT

In developing countries, foodborne infectious diseases, mainly attributable to the genera Salmonella and Shigella, represent a major health problem. Salmonella and Shigella are the most common bacterial species implicated in various types of infection, including septicaemia and gastroenteritis. These involve several bacterial clones with multi-drug resistance, making them difficult to treat. The aim of our study was to detect Salmonella and Shigella species in pathological stool and blood samples, to assess their prevalence in relation to risk factors, to characterise their antibiotic resistance profile, and to reconstruct their phylogenetic tree to understand their origin.

Samples were collected from inpatients and outpatients in four district hospitals and the Centre HospitalierMère et Enfant, over a period extending from June 2021 to December 2023. Stools from patients at the CHU ME were collected in sterile vials, while swabs were used for patients at district hospitals in N'djamena. In addition, blood from patients with a fever above 38 degrees Celsius was used for blood cultures. Antimicrobial susceptibility testing was performed using the CA-SFM /EUCAST method and strains were identified by conventional microbiological tests.

Bacterial DNA was extracted using the boiling method. (GTG)-PCR was used for strain subtyping. The Dendro- UPGMA software was used to group strains on the basis of the genetic fingerprints obtained by (GTG) -PCR.

Between 1 January 2022 and 30 June 2023, a total of 1370 patients were registered at four district hospitals and the Centre HospitalierUniversitaireMère et Enfant for cases of acute gastroenteritis.

A total of fifty strains were isolated, including thirty Shigella and twenty Salmonella. We observed a significant difference in the incidence of bacterial infections in children aged 0-5 years and adults aged over 21 years compared with the other groups (p = 0.01).

The antibiotic susceptibility profiles of Salmonella and Shigella strains were diverse. We found that 82.3% of the bacteria were resistant to beta-lactam antibiotics, including ampicillin, amoxicillin and amoxicillin + clavulanic acid, as well as ceftriaxone. The majority of strains were sensitive to the range of antibiotics tested, particularly the quinolones (nalidixic acid, ofloxacin and ciprofloxacin), with the exception of certain beta-lactamase antibiotics, which showed reduced sensitivity to ampicillin and amoxicillin + clavulanic acid. In order to assess phylogenetic relationships and establish epidemiological links between the Salmonella strains isolated during our study, we characterised twenty Salmonella isolates by GTG5 PCR (Polymerase Chain Reaction), then grouped the strains using DendroUPGMA software on the basis of the genetic fingerprints obtained by GTG5 PCR.

The den- drogram obtained using genetic fingerprinting was used to group Salmonella strains into 20 groups (G1 to G20).

This study highlights the scale of the public health problem posed by these bacteria in Chadian populations. It highlights the need for close monitoring of the antibiotic profile in order to ensure effective antibiotic therapy and the implementation of prevention programmes tailored to public health. The circulation of such strains requires further study to gain a better understanding of their origin and mode of dissemination.

The 5-PCR test (GTG) has enabled rapid molecular typing of Salmonella strains. The Salmonella strains typed in this study belong to different clones.

Keywords: Acute diarrhoea, Identification, Antibiotics, prevalence, epidemiology, N'djamena.

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Chapitre 3 Techniques moléculaires deSalmonellaet Shigella...........................................40

INTRODUCTION GENERALE

La gastro-entérite est une affection au niveau de l'estomac et des intestins, souvent provoquée par des agents pathogènes tels que les bactéries, les virus ou les parasites (McQuade et al., 2020). Dans les pays en développement, les diarrhées aiguës infectieuses sont à l'origine d'environ un tiers des décès dus à la déshydratation (Canada, 2017). Elles restent fréquentes dans nos régions, comme en témoigne la fréquence des toxi-infections alimentaires familiales ou des collectivités (crèches, etc.) (Mariani-Kurkdjian et al., 2016). La diarrhée aiguë est définie par l'émission d'au moins trois selles liquides et/ou molles par jour depuis moins de 14 jours (Mariani-KurkdJIAN et al., 2016). Les Salmonella et Shigella, deux espèces de bactéries pathogènes, sont souvent liées aux épidémies de gastro-entérite à travers le monde (Rogawski, McQuade et al., 2020). Les infections à parasites intestinaux, à Salmonella et à Shigella sont les principaux problèmes de santé publique dans le monde, en particulier dans les pays en développement, en raison de l'inaccessibilité de l'eau salubre et des pratiques de manipulation d'aliments non hygiéniques des préposés à la manutention des aliments (Mama et al., 2016). Ces micro-organismes peuvent entraîner des infections graves, voire mortelles, surtout chez les populations vulnérables telles que les jeunes enfants, les personnes âgées et les individus immunodéficients (Vu, 2020). Les enfants de moins de cinq ans sont les plus exposés et environ 125 000 meurent chaque année (Organisation mondiale de la Santé, 2018). . En effet, on estime à plus de 91 millions le nombre de cas et à 137 000 celui des décès par an (Organisation mondiale de la Santé, 2018).

L'épidémiologie des infections à Salmonella et Shigella est complexe, impliquant divers facteurs tels que la contamination alimentaire, l'eau contaminée et le contact interhumain. Parmi les contraintes sanitaires de l'eau, figurent les bactéries qui sont en général ubiquistes et causent des maladies dites hydriques telles que la diarrhée, la fièvre typhoïde, le choléra (Yesigat et al., 2020). Les eaux de forage sont souvent exposées à de nombreuses contaminations, elles peuvent donc présenter un risque pour la santé des consommateurs (Sawadogo et al., 2023).Comprendre la dynamique de transmission de ces agents pathogènes est crucial pour mettre en oeuvre des stratégies de prévention et de contrôle efficaces. La gravité des infections aux agents bactériens, associées aux conséquences économiques et en santé publique, a entraîné le développement de nombreuses méthodes phénotypiques, puis plus récemment, moléculaires pour la caractérisation des Salmonelles et Shigelles (Grattard et Pozzetto, 1999). Cette caractérisation s'appuie en premier lieu sur la détermination du sérotype, méthode très couramment employée, permettant de suivre les tendances évolutives dans différentes filières en vue de l'épidémiosurveillance des Salmonelles et Shigelles (Laurent &Moez, 2023). Au Danemark, les coûts économiques liés aux salmonelloses sont estimés entre 10,4 et 25,5 millions de dollars US en 200 (René et al., 2011).

A ce problème majeur, s'incarnait au cours de ces dernières décennies, le phénomène de résistance aux antibiotiques est devenu assez fréquent dans le genre Salmonella et Shigella (Li et al., 2024). En effet, plusieurs études ont montré que les Escherichia colientéropathogènes, Salmonella enterica, Shigella spp, Yersinia, Campylobacter et Vibrio cholerae sont de plus en plus résistants aux â-lactamines (ZEBA et al., 2007, HAUKKA,2007). On assiste également à l'apparition de phénomènes de résistance inexpliqués (forte prévalence de bactéries productrices de BLSE chez des enfants dont l'âge était compris entre 0-12 mois à l'origine de l'impasse thérapeutique (Dembélé et al., 2015) Au Tchad, les premières études sur Salmonella datent des travaux de Perpezat et al., (1964), de Le Minor et al., (1969) et de Guard et al., (1973) et ont permis de démontrer l'importance épidémiologique des salmonelloses humaines et animales, ainsi que la diversité des sérotypes rencontrés.

Au Tchad, la situation sanitaire demeure très précaire, imputable au contexte socio-économique et au fonctionnement du système de santé (INSEED, 2014) ;(MSPP, 2022).

Les maladies diarrhéiques demeurent l'une des principales causes de mortalité et de morbidité chez les enfants de moins de 5 ans (BESSIMBAYE et al., 2013). De ce fait, elles constituent un problème majeur de santé publique (MSPP, 2022). L'utilisation sélective des antibiotiques a touché environ 19 000 personnes dont 15 900 enfants de moins de 5 ans, chaque année, atteints de diarrhée (BESSIMBAYE et al., 2013).

Les hôpitaux tchadiens à l'instar des hôpitaux africains ne sont pas du tout épargnés par les phénomènes des infections croisés (Bessimbayeet al., 2021) ; (Hassan et al ;2021) ; (Ouchar al., 2019).

Le Tchad ne dispose d'aucun mécanisme de régulation et de contrôle de l'utilisation des antibiotiques tant dans le domaine vétérinaire qu'en santé humaine (Tabo, 2013). Les antibiotiques de toutes catégories se vendent à tous les coins des rues des grandes villes du Tchad, sans aucun contrôle et dans des très mauvaises conditions de conservation (Tabo,2013).

La caractérisation moléculaire des souches de Salmonella et Shigella revêt une importance particulière pour plusieurs raisons. Elle permet de mieux comprendre la diversité génétique au sein de ces espèces, d'identifier les souches émergentes, et de tracer l'origine des épidémies. De plus, la caractérisation moléculaire peut aider à évaluer la résistance aux antimicrobiens, ce qui est essentiel pour orienter les choix thérapeutiques et mettre en place des mesures de lutte contre la résistance aux médicaments. Ces techniques, en général plus longues et fastidieuses à mettre en oeuvre, sont plutôt réservées aux enquêtes épidémiologiques dans un écosystème donné ou lors d'investigation suite à une toxi-infection alimentaire ou à une épidémie de salmonellose et de shigellose (Ung et al. , 2019).

L'étude pourrait donc se concentrer sur la collecte de données épidémiologiques à partir de cas de gastroentérite provoquée par Salmonella et Shigella , en utilisant des méthodes de surveillance sur le terrain. En parallèle, elle pourrait mettre en oeuvre des techniques de biologie moléculaire pour caractériser les souches isolées, en analysant leur génome, en identifiant les gènes de virulence, en évaluant leurs sensibilités aux antibiotiques et en étudiant la diversité au sein des micro-organismes pour l' obtention de l'empreinte génétique entre les différentes souches étudiées.

Très peu d'études ont été menées sur ces deux (2) germes ( Salmonella et Shigella ) au Tchad,, en dehors de la contribution de Tabo et al., (2013) sur l'état de l'antibiorésistance des souches de Salmonella chez les humains et les poules pondeuses dans la ville de N'Djamena.

Les résultats de cette recherche contribueraient à améliorer la compréhension de l'épidémiologie de la gastro-entérite liée à Salmonella et Shigella, tout en fournissant des informations précieuses pour la prévention, la surveillance et le contrôle de ces infections.

Contribuer à une meilleure prise en charge des garstro entértes causées par les souches de Salmonella et Shifellaau Tchad.

· Determiner la prevalence des Salmonella et Shigellaimpliqué dans les gastroenterite

· Déterminer le profil de resistance aux antibiotiques des Salmonella et Shigella isolés,

· Effectuer la caractérisation moléculaire des agents bactériens Salmonella et Shigella.

Chapitre.1. Généralités sur lesSalmonellaet Shigella

1.1 Définition de la diarrhée

Une diarrhée est la survenue de plus de trois émissions fécales, molles ou liquides, par jour. Ces émissions peuvent être soit glaireuses et plus ou moins sanglantes, soit se présenter sous forme de diarrhée (OMS, 2000). Les épisodes de diarrhée d'une durée inférieure à 14jours sont définis comme des diarrhées aigües (ABBA et al., 2009). Les épisodes de diarrhée d'une durée supérieure à 14jours sont définis comme des diarrhées persistantes (ABBA et al., 2009).

1.2Ampleur des diarrhées

1. 2.1. Dans le monde

Ces vingt dernières années, les problèmes de santé publique et d'ordre économique associés aux maladies d'origine alimentaire ont pris une ampleur croissante dans un certain nombre de pays. Les flambées de maladies provoquées fréquemment par de nouveaux agents pathogènes, l'administration d'antibiotiques au bétail et le transfert de la résistance aux antibiotiques à l'homme, ainsi que les inquiétudes suscitées actuellement par l'encéphalite spongiforme bovine n'en sont que quelques exemples. Les pays munis de systèmes de surveillance ont enregistré une augmentation notable de l'incidence (nombre de cas) des maladies alimentaires au cours de ces deux dernières décennies. La signification de cette augmentation sera discutée ultérieurement. Les estimations annuelles sont de l'ordre de 76 millions de cas de maladies transmises par les aliments, auxquels sont associés 325 000 hospitalisations et 5 000 décès pour les Etats-Unis et de 2 366 000 cas, 21 138 hospitalisations et 718 décès en Angleterre et au Pays de Galles (MEAD et al., 1999). Le nombre de cas rapportés laisse supposer que la charge de morbidité des maladies d'origine alimentaire est probablement du même ordre de grandeur dans la plupart des pays de l'OCDE. Les maladies d'origine alimentaire constituent un vaste groupe de pathologies. Parmi celles-ci, les gastro-entérites, provoquées par tout un ensemble de micro-organismes, bactéries, virus et parasites, sont le syndrome clinique le plus fréquent. Généralement brève, la période d'incubation dure 1-2 à 7 jours. Cette pathologie, qui varie en gravité du simple trouble ne nécessitant pas de traitement médical à l'affection sévère conduisant à une hospitalisation, peut entraîner une incapacité à long terme, voire le décès (la fréquence des hospitalisations s'échelonne entre 0,6 et 29 % et la mortalité atteint 2,5 % aux États-Unis) (MEAD et al., 1999).

Les conséquences de l'exposition par voie alimentaire à des agents pathogènes provoquant des diarrhées dépendent de plusieurs facteurs relevant de l'hôte, notamment son état immunitaire sous-jacent, sa capacité à générer une réaction immunitaire, son état de nutrition, son âge, et de facteurs non spécifiques de l'hôte comme les facteurs environnementaux. Par suite, l'incidence, la gravité et la létalité des diarrhées aiguesd'origine alimentaire sont plus élevées chez certaines catégories particulièrement vulnérables de la population, comme les enfants de moins de cinq ans, les femmes enceintes, les personnes immunodéprimées (patients subissant une transplantation d'organe, une chimiothérapie contre le cancer, atteints du SIDA, etc.) et les personnes âgées (GERBA et al., 1996). À côté de ces facteurs prédisposant bien connus, de nouveaux facteurs sont régulièrement identifiés [atteinte hépatique pour septicémies à V. paraheamoliticus, thalassémie pour les infections à Yersinia enterocolitica (HLADY et al., 1996, ADAMKIEWICZ et al., 1998). Ces maladies peuvent entraîner des complications importantes, notamment des atteintes intestinaux et systémiques, comme le syndrome urémique hémolytique (SHU) (dysfonctionnement rénal et troubles neurologiques) pour 10 % des infections à Escherichia coli 0157 :H7 accompagnées de diarrhées sanglantes, ou le syndrome de GuillainBarré (atteinte dégénérative du tissu nerveux, suivi d'une récupération lente et d'une incapacité résiduelle prononcée) après une infection à Campylobacter jejuni, des arthrites consécutives à une salmonellose ou encore une encéphalite toxoplasmique chronique (GRIFFIN et al., 1988, THOMSON et al., 1995). Plusieurs auteurs estiment que des complications à long terme (séquelles) peuvent survenir chez 2 à 3 % des maladies d'origine alimentaire (LINDSAY, 1997). Tandis que la diarrhée est le syndrome le plus fréquent après la consommation d'aliments contaminés, d'autres affections sont beaucoup plus sévères.

1.2.2. En Afrique

Dans les pays en voie de développement tels que la plupart des pays africains, l'incidence des diarrhées aiguës infantiles est nettement plus élevée : le nombre d'épisodes varie de 3 à 9 par an et par enfant (BUISSON, 2001). Quant à la situation au Burkina Faso, elle indique 6 à 8 épisodes par enfant et par an (OUERMI et al., 2007). Les maladies diarrhéiques sont encore plus fréquentes et plus sévères dans les parties les plus pauvres des pays en voie de développement surtout dans les régions tropicales et subtropicales.

Par exemple, selon l'OMS, le climat et les conditions socio-économiques de l'Afrique occidentale favorisent le développement des diarrhées infantiles.

1.3. Epidémiologie des diarrhées infantiles

Un rapport de l'Organisation mondiale de la Santé (OMS), établi en 2020, avançait le chiffre de 3,3 millions de décès par diarrhée aiguë chez des enfants de moins de 5 ans en Afrique. Cependant, grâce aux campagnes de prévention, ce chiffre était nettement inférieur à celui rapporté en 1980 qui faisait état de 4,6 millions de décès dans les mêmes régions.

1.3.1. Les bactéries :Salmonella et Shigella

Les principales causes de Toxi-infections Alimentaires Communautaires (TIAC) déclarées sont les salmonelles (70 % des TIAC), Clostridium perfringens pour les plats en sauce et Staphyloccus aureus pour les préparations ayant nécessité des manipulations et des produits laitiers. D'autres bactéries comme Escherichia coli entéropatogène, Shigella spp, Campylobacter jejuni, Les maladies diarrhéiques sont en général transmises par l'eau et les aliments contaminés. Il s'agit essentiellement d'un manque d'hygiène dans le traitement des denrées alimentaires. Les principaux vecteurs de ces maladies sont : Escherichia coli, Salmonella spp, Shigella, Yersinia et Campylobacter Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Clostridium difficile et Bacillus cereus sont également agents de troubles transmis par l'eau et les aliments souillés.

1.3.2 facteurs environnementaux favorisant les infections diarrhéiques

L'hygiène se réfère aux pratiques associées à l'assurance d'une bonne santé et de la propreté. Le terme scientifique "hygiène" se réfère au maintien de la santé et d'une vie saine. Il apparait dans des phrases comme hygiène personnel, hygiène domestique, hygiène dentaire, et hygiène occupationnelle et est fréquemment utilisé en rapport avec la santé publique (ANDERSON et LACHAN, 2008). Selon GAUCI et al. (2008), les mesures d'hygiène ne constituent pas un luxe mais une nécessité pour aider à réduire l'expansion des maladies infectieuses. Or, dans la plupart des pays en développement, ces mesures sont encore ignorées, non respectées et constituent donc de sérieux problèmes de santé publique. Une des graves conséquences du non respect des mesures élémentaires d'hygiène est la hausse de prévalence des maladies diarrhéiques ces dernières années notamment en ce qui concerne les enfants. L'OMS estime que 98,8% des cas de décès liés au manque d'hygiène surviennent dans les pays en voie de développement dont les enfants représentent les 90% (OMS, 2003). En effet, les enfants de moins de cinq ans constituent la population vulnérable à ces agents. Ils sont responsables de gastroentérites qui se manifestent par des diarrhées aiguës nécessitant le plus souvent une hospitalisation (WHO/UNICEF/USAID/CCCD, 2003). Certains microorganismes persistent dans la l'environnement et réémergent grâce à leur multi résistance. Ce fait a été observé chez les bactéries isolées des vidanges et des eaux (MALIK et AHMAD, 1994). 4.2. Mode alimentaire

L'évolution des maladies diarrhéiques reste étroitement liée aux habitudes et modes alimentaires des populations rurales. En effet, l'eau et les aliments sont réputés être des réservoirs non négligeables des entéropathogènes agents de ces pathologies infectieuses. Certains germes comme les norovirus peuvent survivre dans l'environnement durant un long temps et accroître alors le risque de contamination (GAUCI et al., 2008). Les maladies causées par les entérobactéries pathogènes à travers les eaux de consommation sont en majeure partie d'origine fécale (ASHBOLT, 2004; HUNTER et al., 2002). Les obstacles majeurs pour la santé des populations des pays en voie de développement sont liés à la consommation de l'eau non potable, à la pauvreté des districts sanitaires et au manque d'hygiène (OMS, 2003). Ces facteurs contribuent ainsi à l'émergence et à la réémergence de certaines maladies induisant des épidémies voire des pandémies. Les risques de contamination par le mode alimentaire sont énormes. Ils peuvent résulter de la qualité des aliments en ce qui concerne la matière première, du traitement dont ces aliments ont fait l'objet (manquement aux règles d'hygiène, mauvaise conservation des repas, etc....).

1.3.2Lutte contre les maladies diarrhéiques

Dans le domaine des diarrhées infantiles, la prévention comprend deux étapes successives qui sont fréquemment rencontré en Afrique :

ü La première est d'éviter, devant une diarrhée simple, une aggravation par le suivi d'un traitement correct, appliqué à temps. Ceci relève essentiellement du médecin et du personnel paramédical.

ü La deuxième consiste à éviter la dissémination de la maladie en pratiquant une politique d'assainissement (approvisionnement en eau potable, évacuation des matières et eaux usées, amélioration de l'habitat), une politique d'éducation sanitaire et enfin une politique en matière de nutrition : contrôle des aliments et mise au point d'aliments adéquats.

Dans cette tâche, le médecin collabore avec les représentants d'autres services. Pour bien réussir ces mesures préventives, quelques précautions élémentaires s'imposent. En restauration collective, les principales mesures préventives sont le respect des bonnes pratiques de transport, de stockage et de préparation des aliments, le respect strict des chaînes du chaud et du froid. En milieu familial, il est recommandé de conserver les produits sensibles (viandes, oeufs, poissons, etc.) dans le réfrigérateur et de les y placer rapidement après achat, de bien cuire les oeufs destinés aux personnes vulnérables (enfants, personnes âgées, femmes enceintes), de préparer les aliments à base d'oeufs non cuits (mayonnaise, pâtisserie) le plus près possible de la consommation et de consommer les viandes hachées et les volailles cuites à coeurs (absence de teinte rosée). Les règles d'hygiène (lavage des mains à la sortie des toilettes, avant de préparer les repas) et les bonnes pratiques permettant d'éviter les contaminations croisées au moment de la préparation des aliments (par exemple, ne pas utiliser le même couteau pour couper de la viande et les crudités, nettoyage des plans de travail) ou lors du stockage doivent être rappelées.

2. Genre Salmonella

2.1 Définition

Les Salmonelles sont des bactéries entériques en forme de bâtonnet, anaérobies facultatifs, à Gram négatif, avec des flagelles péritriches, de 0,7-1,5 ×2,0-2,5 ìm ; elles sont généralement mobiles, mais certains sérovars sont immobiles comme Salmonella Gallinarumpullorum et d'autres ont perdu leurs flagelles. Les Salmonella appartiennent à la famille des Enterobacteriaceae et possèdent toutes leurs caractéristiques biochimiques.

2.2Historique

L'agent pathogène de la fièvre typhoïde fut découvert par Eberth en 1880 dans des coupes de rate et des ganglions lymphatiques d'un malade mort de typhoïde (AVRIL et al., 1988). En 1886, l'américain Daniel Salmon et ses collègues ont découvert les bactéries responsables de la fièvre porcine : Salmonella choleraesuis. Ensuite, Widal fût le premier en 1896 à montrer que le sérum des malades atteints de fièvre typhoïde agglutinait des cultures du bacille d'Eberth (premier sérodiagnostic de l'histoire) (AVRIL et al., 1988). Le terme de Salmonella ne fut créé qu'en 1900 par Lignières, en l'honneur de Daniel Elmer Salmon, directeur des services vétérinaires des États-Unis à cette époque.

Les salmonelles sont des bactéries entériques, acquises par voie orale et adaptée à la vie dans le mucus du tractus digestif. Elles ont un tropisme particulier pour le tube digestif des animaux en général, et des volailles en particulier, qui constituent sans doute le réservoir d'origine. Ce tropisme est lié à l'évolution de ces bactéries avec leur niche écologique durant des millénaires, qui a abouti à une sélection de gènes adaptés, notamment liés à leur caractère microaérobie, à leur métabolisme et à leurs caractères physiques, leur permettant de se mouvoir dans le mucus digestif. Elles ont été isolées dans l'intestin de porc par Theobald Smith et Daniel Elmer Salmon '(Jajere, 2019) et compte depuis 2004, 3 espèces : Salmonella bongori, Salmonella subterraneaet Salmonella enterica ''''''''''''(Nau et al., 2010). La maladie humaine la plus fréquemment associée au salmonellose est, par conséquent, une entérite aiguë causée par une infection intestinale qui peut se compliquer par des localisations secondaires et d'un syndrome post-infectieux(Fresney, 2007). A l'exception de Salmonella Typhi et des sérotypes paratyphiques (A, C et certaines souches de B) qui sont spécifiques de l'homme, toutes les autres infections dues aux salmonelles non typhiques peuvent être considérées comme des zoonoses(Michel et al., 2018). La salmonellose est sans doute la zoonose d'origine alimentaire la plus répandue dans le monde. En général, l'homme se contamine en ingérant des aliments contaminés, le plus souvent d'origine animale (viande, et en particulier de volailles, produits carnés, oeufs et produits laitiers) consommés crus, insuffisamment cuits ou recontaminés après cuisson. Il est de transmission oro-fécale, verticale et horizontale-(Mares, 2017). Différents sérovars de Salmonella enterica sont zoonotiques et responsables de toxi-infections alimentaires dans le monde. D'autres sont responsables de salmonelloses mineures transmises par contamination alimentaire'(Deguenon et al., 2019).

C'est la maladie la plus importante en termes d'impact sur la morbidité et la mortalité chez l'Homme. Les salmonelles humaines surviennent sous forme sporadique ou de TIA mais elles peuvent aussi entraîner des épidémies régionales, voire internationales (Delmas & Fuhrman, 2010);(Rahman, 2015).

2.3.Caractéristiques morphologiques des salmonelles

Les salmonelles sont des bacilles Gram négatif, mobiles péritriches à l'exception de Salmonella Gallinarumet Salmonella Pullorum(A. Andino & I. Hanning, 2015).

Les Salmonelles ont une paroi épaisse de 8 à 12 nm. En microscopie optique, elles apparaissent comme des bâtonnets à Gram négatif de 2 à 3 ìm de longueur et de 0,6 à 0,8 ìm de largeur. Le constituant le plus essentiel dans une membrane des bactéries à Gram-négatif, est un lipide complexe ; lipopolysaccharide (LPS). Celipopolysaccharide est un complexe macromoléculaire toxique présent de manière constitutive dans la membrane externe. (Avril et al., 1992). Les Salmonella sont des bactéries mobiles grâce à de fins filaments protéiques capilliformes : les flagelles. Ils présentent trois parties :

Un corpuscule basal, il correspond à la zone d'insertion du flagelle dans le corps cellulaire. Cette structure est douée d'un pouvoir pathogène par l'intermédiaire de l'antigène flagellaire H, celui-ci est constitué de sous-unités protéiques : flagelline (Avril et al, 1992)

Elles sont aéro-anaérobies facultatives et se cultivent sur milieu ordinaire. Après des étapes de pré-enrichissement, d'enrichissement sélectif et de culture sur milieu, elles présentent après une incubation de 24 heures à 37°C, des colonies caractéristiques.

Ces colonies apparaissent roses à centre noir sur gélose Xylose Lysine Deoxycholate, incolores sur gélose Salmonella-Shigella et ambrées translucides sur gélose Eosine Methylene Blue (Nau et al., 2010 ; Jajere, 2019).

2.4Taxonomie et nomenclature

Sur la base de tests phénotypiques et de tests sérologiques, Kauffmann, pionnier de l'analyse du genre Salmonella, avait individualisé plusieurs sous-genres et de très nombreuses espèces de Salmonella. Depuis quelques années sur le plan international, grâce aux études moléculaires basées sur l'analyse comparative des gènes codant les ARN ribosomaux et sur des techniques d'hybridation ADN-ADN, il fut proposé que le genre Salmonella soit subdivisé en deux espèces distinctes : Salmonella enterica, espèce majoritaire et Salmonella bongori. La première espèce est, elle-même subdivisée en 6 sous-espèces : enterica, salamae, Arizona, diarizonae, houtenae et indica (Grimont et al., 2000 ; Olsen, 2005). Chacune des sous-espèces est subdivisée en sérovars sur la base de caractères antigéniques, somatiques et flagellaires. L'association de ces facteurs antigéniques permet alors de définir une structure antigénique complète, qui selon le schéma de Kauffmann-White, caractérise une souche (Brisabois et al, 2016).

La sous-espèce enterica comprend la plus grande majorité des souches isolées chez l'homme et les animaux à sang chaud ; les sous-espèces salamae, Arizona, diarizonae sont fréquemment retrouvées dans la flore commensale de l'intestin des animaux à sang froid mais peuvent être aussi isolées de l'environnement ou des animaux à sang chaud. Les sous- espèces houtenae, indica et l'espèce bongori sont très rarement retrouvées et n'ont pas d'habitats préférentiels (Brisabois et al, 2016). Bien que toute Salmonella isolée soit considérée comme potentiellement pathogène pour l'homme, la détermination du sérovar permet de mieux caractériser la souche et de la restituer dans son contexte écologique ou épidémiologique (Brisabois et al, 2016). Les Salmonella peuvent se multiplier à une température comprise entre 5°C à 45°C avec un optimum 35°C - 37°C, et à des pH de 4,5 à 9. L'optimum est entre 6,4 à 7,5. On peut diviser les Salmonella en trois groupes distincts : Les Salmonella spécifiques de l'homme : Salmonella Typhimurium ; Salmonella paratyphi A et Salmonella sendai responsables de fièvres typhoïdes et paratyphoïdes. Les sérovars adaptées à des espèces animales : Salmonella Gallinarumpullorum chez la volaille, Salmonella abortusovis chez le mouton, Salmonella abortuse chez le cheval, Salmonella Typhisuis et Salmonella choleraesuis chez le porc. Les autres sérovars sont ubiquistes et peuvent infecter aussi l'homme que l'animal et sont à l'origine de la plupart des salmonelloses humaines et animales.

2.6 Caractères biochimiques

Les Salmonella ont des caractères biochimiques communs fondamentaux. Lescaractéristiques biochimiques générales de la plupart des sérotypes isolés chez l'homme et les animaux à sang chaud sont :

· L'absence d'une uréase active, de tryptophane ou de phénylalanine désaminase,

· L'absence de production d'indole et d'acétoine (test de Voges-Proskauer négatif),

· La production d'hydrogène sulfureux à partir du thiosulfate (présence d'un thiosulfate réductase) H2S : +,

· La décarboxylation fréquente de la lysine et de l'ornithine (pas le sérovarTyphy), LDC : + En plus de ces caractères différentiels intrinsèques, les Salmonella possèdent les caractères généraux de la famille des Enterobacteriaceae qui sont :

ü Souvent mobiles grâce à leur ciliature péritriche (rarement immobiles), non sporulés;

2.7 Pouvoir pathogène des Salmonelles

Le tableau II nous a permis de connaitre les différents les sérovars et les problèmes de santé causés aux hôtes (animal et homme).

Tableau III : Pouvoir Pathogène des Salmonella isolé chez l'homme et les animaux

2.8 Caractéristiques antigéniques :

Chez Les salmonelles ont été distinguer par trois types d'antigènes présentant un intérêt de diagnostic (Dumas, 1958) :

L'antigène O est un antigène de la paroi. Les antigènes O sont portés par les chaînes spécifiques du lipopolysaccharide (LPS). L'antigène O possède des propriétés immunisantes ; C'est un complexe contenant une protéine, un polysaccharide et un composé phospholipidique. On distingue 67 facteurs O selon la nature des sucres entrant dans la constitution des unités oligosaccharidiques du polysaccharide (Humbert et al., 1998). L'antigène O est formé d'une fraction lipidique appelée lipide A qui est responsable des effets toxiques, d'une partie basale et du polysaccharide support de la spécificité (Gledel et Corbion, 1991). Les antigènes sont classés en facteurs O majeurs et en facteurs O accessoires. Les facteurs majeurs sont liés à la présence de certains sucres (abéquose pour O : 4, tyvélose pour O : 9) (Humbert et al.,1998). L'antigène somatique est stable ; il résiste à l'alcool et au phénol pendant deux heures et demi à la température de 100°C (Dumas, 1958).

C'est un polymère de flagelline (protéine de structure des flagelles). Cet antigène est thermolabile, détruit par la chaleur à 100°C, par l'action de l'alcool et par les ferments protéolytiques. Il résiste au formol et perd son agglutinabilité par les anticorps en présence d'alcool et d'acide phénique. Son développement optimum s'obtient sur les milieux liquides après un séjour de 8 heures à 37°C (Dumas, 1958). La grande majorité des sérovars possèdent deux systèmes génétiques et peut exprimer alternativement deux spécificités différentes pour leur antigène flagellaire. On dit que les antigènes flagellaires de Salmonella sont diphasiques (Humbert et al., 1998).

C'est un antigène de l'enveloppe ; Il a été identifié chez trois types de sérovars : Typhi, Paratyphi C et Dublin mais toutes les souches de ces sérovars ne possèdent pas forcement cet antigène (Humbert et al.,1998). Cet antigène est considéré comme un antigène de surface (Dumas, 1958), il est distinct de l'antigène somatique et de l'antigène flagellaire. L'antigène Vi rend les germes inagglutinables par les anticorps O quand il est abondant. Il ne se développe pas si les cultures sont effectuées au-dessous de 25°C et au-dessus de 40°C. Un chauffage à 100°C pendant dix minutes le détruit et les germes deviennent agglutinables par les anticorps O. Il est de nature glucidolipidopolypeptidique. A côté de ces antigènes il existe dans le genre Salmonella, des structures protéiques de surface : les pilis qui se différencient en pilis communs (intervenant dans l'hémagglutination mannose dépendante) et en pilis sexuels (intervenant dans la conjugaison bactérienne) et dontla présence est codée par des plasmides (Gledel and Corbion, 1991).

2.9 génome de Salmonella

Le génome de la bactérie est composé d'un ADN chromosomique et d'un ou de plusieurs plasmides. La taille du chromosome de Salmonella varie d'un sérotype à l'autre et elle est comprise entre 4,5 et 4,9 Mbp (méga-paires de base). La membrane cytoplasmique de la bactérie est entourée par le peptidoglycane puis par la membrane externe qui porte les flagelles, pili, glycocalix et lipopolysaccharide. Ces structures ont des rôles importants pour la survie de la bactérie et comme facteurs de virulence.

2. 10 Mécanismes de virulence

Après ingestion d'aliments contaminés par Salmonella, cette dernièrese retrouve au niveau de l'estomac puis atteint l'intestin. Dans la plupart des cas, elles colonisent la partie inférieure de l'intestin appelé l'ileum (Galan, 1996). Après attachement aux cellules épithéliales intestinales, différentes portes d'entrée permettent la colonisation du tractus intestinal : les cellules M, les entérocytes et les phagocytes CD18+ (Cossart and Sansonetti, 2004). Les portes d'entrée utilisées varient en fonction des sérotypes de Salmonella à titre d'exemple prenons le S. Typhimurium. Très rapidement après l'infection de souris ou de veau (Manon, 2011), il a été décrit que S. Typhimurium se retrouvait principalement associée aux plaques de Peyer et plus précisément aux cellules M (Jepson and Clark, 2001; Jones et al., 1994; Santos et al., 2002). Ces cellules M, localisées au niveau de l'épithélium associé aux follicules, ont la capacité d'échantillonner et de transloquer les antigènes ou micro-organismes de la lumière intestinale vers les tissus sous-jacents (Neutra, 1998). Salmonella peut aussi traverser la barrière intestinale par l'invasion des entérocytes (Finlay and Falkow, 1990 ; Santos et al., 2002). Lors du franchissement de la barrière intestinale par les cellules M ou les entérocytes, les bactéries sont ensuite phagocytées par les macrophages de la lamina propriaqui sont en contact avec les cellules M des plaques de Peyer (Cossart and Sansonetti, 2004). Les bactéries sont alors transportées jusqu'aux ganglions mésentériques sous-jacents. Enfin, une autre voie permet à Salmonella de franchir l'épithélium intestinal. Il s'agit de la capture luminalevia les cellules phagocytaires CD18+ telles que les cellules dendritiques. En effet, ces cellules projettent leurs dendrites à travers l'épithélium intestinal, ce qui permet de transporter la bactérie vers le pôle basolatéral de l'épithélium (Santos and Baumler, 2004). Les phagocytes CD18+, tout comme les macrophages, transporteraient aussi les salmonelles jusqu'aux ganglions mésentériques. A ce stade, l'infection peut rester localisée et entrainer une pathologie de type gastroentérite. Dans ce cas, l'invasion cellulaire induit la mise en place d'une réponse inflammatoire (Galan, 2001). Une infiltration importante entraine alors la destruction de l'épithélium intestinal, la formation d'oedème et la sécrétion de fluide au niveau de la muqueuse intestinale (McCormick et al., 1998).

2.11. pouvoir pathogène des Salmonelles

La salmonella est un groupe de bactérie capable de causer une maladie infectieuse appelé salmonellose, les personnes qui consomment des aliments contaminés par Salmonella sont susceptibles de contracter la maladie. On distingue trois types de symptômes de Salmonellose.

2.11.1 gastro-entérites

Les gastro-entérites sont provoquées par des Salmonella non typhiques ubiquistes telles que S. Enteritidis et S. Typhimurium présentes chez l'homme et les animaux.Comme un grand nombre d'animaux sont porteurs de Salmonella, la contaminationhumaine peut se faire par le biais de divers produits alimentaires (viande, et particulièrementvolailles, produits carnés, oeufs et produits laitiers). Les sérotypes majoritairement incriminéest S. Enteritidis (rapport EFSA, 2008 publié en 2010). Cependant, il y a l'émergence d'autres sérotypes tels que S. Infantis, 3e sérotype le plus fréquemment incriminé (International surveillance network for the enteric infections Salmonella, VTECO157 and Campylobacter. Annual Report 2004). Ce sérotype est passé de la 5e à la 1èreposition en termes de prévalence. La durée d'incubation est le plus souvent de un à deux jours. Elle dépend de la santé de l'hôte, de la dose ingérée et de la virulence de la souche de Salmonella. Les gastro-entérites à Salmonella se manifestent par une diarrhée, des vomissements, de la fièvre et des douleurs abdominales qui surviennent généralement 12-36 heures après l'ingestion. Ils sont la conséquence d'une inflammation de la muqueuse intestinale et conduisent à une déshydratation importante. Chez des adultes de condition physique normale, une gastro-entéritedisparaît sans traitement après 3 à 5 jours en moyenne. Le traitement employé repose essentiellement sur la réhydratation (AVRIL et al., 1992).

2.11.2 infections systémiques ou fièvre typhoïde

Chez l'homme, il s'agit de la fièvre typhoïde ou paratyphoïde et elles sont respectivement dues à S. Typhi et S. Paratyphi. Ces sérotypes sont strictement adaptés à l'homme. La maladie se transmet par ingestion d'aliments ou d'eau contaminés par l'urine ou les fèces de personnes infectées (malades, convalescents ou porteurs asymptomatiques). La plupart des personnes infectées sont infectieuses jusqu'à la première semaine de convalescence mais 10% des personnes non-traitées excrètent la bactérie pendant plus de 3 mois. De plus, de 2 à 5% des personnes non-traitées deviennent des porteurs asymptomatiques (Crumpet al., 2004 ;Panget al., 1998). Cette maladie, qui constitue la forme la plus grave de salmonellose, touche chaque année 22 millions de personnes dans le monde et conduit à 217 000 décès (OMS, 2016). Elle a pratiquement disparu des pays industrialisés mais reste un vrai problème de santé publique dans les pays en voie de développement (Crump et al., 2004). De plus, des souches S. Typhi multirésistantes aux antibiotiques apparaissent de plus en plus, augmentant ainsi l'incidence des fièvres typhoïdes mais aussi la gravité des cas humains (OMS, 2015). En l'absence de traitement, la fièvre typhoïde évolue sous forme de septicémie avec des taux de mortalité de 24 plus de 10%. Cependant, grâce à des antibiothérapies appropriées, les taux de mortalité liés à la fièvre typhoïde sont de 1 à 4% (OMS, 2015). La fièvre paratyphoïde causée par S. Paratyphi présente des symptômes similaires à ceux observés lors de fièvre typhoïde mais elle est en général moins sévère avec des taux de mortalité plus faibles. Les animaux peuvent aussi développer des infections systémiques à salmonelles : les bovins lorsqu'ils sont infectés par S. Dublin, les porcins par S. Choleraesuis, les souris par la plupart des sérotypes ubiquistes ainsi que les volailles par S. Gallinarum.

2.11.3. Toxi-infections alimentaires collectives

La consommation simultanée par plusieurs personnes d'un aliment massivement contaminé par des Salmonella « mineures » (Salmonella typhi murium, S. enteritidis, S. dublin, etc...) entraîne une cascade des cas de gastro-entérites, qui, simulant un véritable empoisonnement, est appelé toxi-infection alimentaire collective (TIAC). La période d'incubation est de 10 à 18 heures. Les troubles durent en général 2 à 5 jours. Les complications sont rares sauf chez les sujets à faibles moyens de défense. L'aliment responsable est identifié par enquête épidémiologique (enquête cas-témoin). Le diagnostic se fait par la recherche de Salmonella dans les selles des malades et dans l'aliment incriminé (s'il est encore accessible). Le traitement est le même que celui des gastro-entérites (Avril et al., 1992). La prévention repose essentiellement sur l'hygiène des cuisines collectives (détection des porteurs sains, techniques de préparation, techniques de conservation : « chaîne du chaud » ou « chaîne du froid », etc....).

2.12. Cycle infectieux de Salmonelle

Le cycle infectieux de Salmonella fait intervenir 3 grandes étapes : (i) l'attachement, (ii) l'invasion cellulaire et (iii) la survie et la multiplication intracellulaire.

La première étape dans la pathogénie de Salmonella est l'attachement à la muqueuse intestinale dans les parties distales de l'intestin (Lockman and Curtiss, 1992). Les protéines, appelées adhésines, sont des molécules de surface bactériennes qui permettent à la bactérie de cibler et de coloniser les tissus de l'hôte par la reconnaissance d'un récepteur spécifique ou non. Il existe 2 grandes familles d'adhésines décrites ci-dessous : les fimbriae ou pili, et les adhésines non fimbriaires. Le LPS et le flagelle, qui jouent aussi un rôle dans l'adhésion des salmonelles, sont ensuite présentés.

Après avoir adhéré à l'épithélium intestinal, les salmonelles peuvent être transloquées via les cellules M et les phagocytes CD18+, mais elles sont aussi capables d'induire leur propre internalisation à l'intérieur de cellules non phagocytaires professionnelles. Salmonella possède différents facteurs d'invasion. Le mécanisme d'entrée le mieux caractérisé chez Salmonella est un mécanisme de type Trigger, c'est-à-dire qu'un système de sécrétion de type III injecte différents effecteurs bactériens directement à l'intérieur des cellules hôtes. Ces effecteurs vont activer directement différentes protéines cellulaires, amenant à une intense polymérisation d'actine qui va se traduire par la formation de forts renflements membranaires.

Dès que Salmonella entre dans la cellule hôte via son T3SS-1, elle se retrouve dans une vacuole d'endocytose appelée la SCV. Bien que les effecteurs SopB, SipA, AvrA et SptP sécrétés par le T3SS-1 soient impliqués lors de la phase précoce de la biogénèse de la SCV, le principal facteur permettant la survie et la multiplication intracellulaire est un deuxième système de sécrétion de type III, appelé T3SS-2 (Ibarra and Steele-Mortimer, 2009). Malgré le rôle crucial du T3SS-2 dans la virulence des salmonelles, le fonctionnement du T3SS-2 et les interactions de ses effecteurs avec les protéines cellulaires sont moins bien connus que ceux du T3SS-1.

Sérotypes	Nombre	Source	Origine
S. Dublin 1	1	Hémocultures	Humaine
S. Uganda	1	Coprocultures	Humaine
S. Singapore	1	Coprocultures	Humaine
S. Hull	2	Coprocultures H	umaine
S. Branderup	1	Coprocultures	Humaine
S. Colindale	1	Coprocultures	Humaine
S. Infantis	2	Coprocultures	Humaine
S. Manhattan	1	Coprocultures	Humaine
S. Chagoua	2 C	oprocultures	Humaine
S. Enteritidis	5	Ganglions mesenter.	Bovins
S. Dublin	2	Ganglions mesenter.	Bovins
S. Amager	1	Ganglions mesenter.	Bovins
S. Milezi	1	Ganglions mesenter.	Bovins
S. Tchad	1	Ganglions mesenter.	Bovins
S. Dublin	1	Viscères	Caprins
S. Enteritidis	1	Viscères	Caprins
S. infantis	1	Viscères	Caprins
S. Teshie	1	Viscères	Caprins
S. Gallinarum	26	Cadavres	Poules
S. Hull	2	Cadavres	Poules
S. Anatum	1	Cadavres	Poules
S. Virchow	1	Cadavres	Poules

Les salmonelloses d'origine animale provoquent une infection intestinale chez l'homme. Celles-ci sont provoquées par des Salmonella ubiquistes présentes chez l'homme etles animaux et se caractérisent par une période d'incubation de 8 à 48 heures, après l'ingestion d'aliments contaminés et le développement rapide d'une fièvre, de céphalées et de malaises. La durée d'incubation dépend de la dose ingérée, de la santé de l'hôte et des caractéristiques de la souche de Salmonella. Dans la phase d'état, les principaux symptômes sont des douleurs abdominales, des nausées, des vomissements et de la diarrhée. L'évolution clinique est, en général, bénigne et la guérison intervient au bout de 2 à 4 jours. Bien que la salmonellose affecte des sujets de tous âges, la fréquence est beaucoup plus élevée chez les jeunes enfants, les personnes âgées et les malades immunodéprimés chez lesquels l'infection peut être plus sévère, voire mortelle (Weill, 2008). Dans les formes habituelles, la guérison est spontanée en quelques jours et seul un traitement symptomatique est préconisé. Le recours aux antibiotiques est donc à réserver aux patients présentant soit une forme sévère ou des risques de complication. Les fluoroquinolones (FQ) sont considérées comme le traitement de choix chez l'adulte. Chez l'enfant, il fait appel aux céphalosporines de troisième génération (C3G), les FQ étant en général déconseillées pour cette tranche d'âge. Les antibiotiques les plus anciens comme les aminopénicillines, l'association triméthoprime -sulfaméthoxazole (Sxt) et beaucoup plus rarement, les phénicolés, peuvent être utilisés comme solutions alternatives (Weill, 2008).

La meilleure protection contre le risque de salmonellose est une bonne cuisson des aliments, en particulier des viandes, à au moins 65°C pendant 15 à 30 minutes. Pour le steak haché congelé ou surgelé, la cuisson doit être effectuée sans décongélation préalable, car elle augmente le risque de multiplication bactérienne. Le froid bloque le développement des bactéries mais ne les tue pas (Fresney et al., 2007).De 1985 à 1997, la prévalence des infections à Salmonella Enteritidisa fortement augmenté en France : elle touche les élevages de volailles et a la particularité d'être présente non seulement à la surface de la coquille de l'oeuf, mais dans le contenu même d'oeufs intacts. Il est pour cette raison conseillé de conserver les oeufs au réfrigérateur, de maintenir au froid les préparations à base d'oeufs sans cuisson (mayonnaise, crèmes, pâtisseries ...) et de les consommer le plus près possible de leur fabrication. De plus, les personnes les plus vulnérables (personnes âgées, malades, nourrissons, femmes enceintes) devraient éviter la consommation d'oeufs crus ou peu cuits. Enfin, il est conseillé de se laver les mains après contact avec un animal vivant (en particulier les reptiles), voire d'éviter les contacts avec les reptiles de compagnie pour toutes les personnes vulnérables (les nourrissons, les femmes enceintes, les personnes immunodéprimées,

3. GenreShigella

La shigellose est une infection intestinale invasive aiguë provoquée par des bactéries appartenant au genre Shigella ; elle se manifeste cliniquement par une diarrhée souvent sanglante(World Health Organization, 2008). Elle est endémique dans de nombreux pays en développement et survient également sous forme d'épidémies accompagnées d'une morbidité et d'une mortalité élevées. Parmi les quatre espèces de Shigella, Shigelladysenteriae type 1 (Sd1) est particulièrement importante car elle est à l'origine de la forme la plus grave de la maladie et peut occasionner de vastes épidémies à l'échelle régionale(World Health Organization, 2008). Les principaux obstacles à la lutte contre la shigellose sont la facilité avec laquelle Shigella se transmet de personne à personne et la vitesse d'apparition de la résistance de cette bactérie aux anti-infectieux(World Health Organization, 2008). L'incidence mondiale de la shigellose a été signalée à environ 165 millions de cas, mais la mortalité a considérablement diminué au cours des trois dernières décennies. Les présentes directives sont destinées à aider les autorités(Dekker & Frank, 2015) sanitaires nationales, les responsables de la santé publique et les professionnels de santé, y compris les membres d'agences internationales et d'organisations non gouvernementales (ONG), dans leurs efforts de lutte contre la shigellose endémique et épidémique. Le texte décrit l'épidémiologie, les aspects cliniques et la prise en charge de la maladie ainsi que les mesures à prendre pour se préparer aux épidémies dues à Sd1 et les maîtriser(World Health Organization, 2008). Les définitions suivantes s'appliquent aux termes utilisés dans le présent document :

ü Diarrhée sanglante. Il s'agit d'un diagnostic clinique qui désigne tout épisode de diarrhée dans lequel les selles molles ou aqueuses contiennent du sang frais visible(World Health Organization, 2008). Le terme de diarrhée sanglante ne s'applique pas aux épisodes dans lesquels le sang est présent en traînées à la surface de selles moulées, n'est détecté que par examen microscopique ou au moyen de tests biochimiques ou dans lesquels les selles sont rendues noires par la présence de sang digéré (méléna). Bien que la diarrhée sanglante ait de nombreuses causes, cette définition simple est largement utilisée pour la surveillance de la shigellose dans la communauté.

ü Dysenterie. Ce terme à la même signification que celui de diarrhée sanglante. Bien que les textes médicaux l'utilisent souvent pour désigner un syndrome de diarrhée sanglante avec fièvre, crampes abdominales, douleurs rectales et selles contenant du mucus, ces aspects n'accompagnent pas toujours la diarrhée sanglante ni ne définissent nécessairement son étiologie ou déterminent le traitement approprié(World Health Organization, 2008).

ü Dysenterie bacillaire. Il s'agit d'une dysenterie provoquée par Shigella. Ce terme est souvent utilisé pour distinguer la shigellose de la dysenterie amibienne, qui est due à Entamoeba histolytica(McQuade et al., 2020).

ü Diarrhée invasive. Ce terme désigne la diarrhée due à des bactéries pathogènes, dont Shigella, certaines Salmonelles, Escherichia coli et Campylobacter jejuni, qui envahissent la muqueuse intestinale où elles provoquent inflammation et lésions tissulaires(Rogawski McQuade et al., 2020). Lorsque du sang visible est présent, l'épisode peut aussi être qualifié de dysenterie ou de diarrhée sanglante (Mahmoudi et al., 2017).

Il s'agit de bactéries adaptées au parasitisme du côlon de l'homme grâce à un plasmide responsable de leur invasivité.Le genre Shigella est responsable de la dysenterie, résultat de la destructiondes cellules épithéliales de la muqueuse intestinale et du rectum. Il produit uneentérotoxine. La transmission de Shigella sppse fait d'Homme à Homme ou par l'intermédiaire d'eau ou aliments contaminés par des déjections humaines. C'est une pathologie endémique dans les pays les moins avancés avec une atteinte préférentielle des enfants de moins de 5 ans (Afssaps, 2010).

Quatre espèces sont observées sur la base antigénique du polysaccharide O pariétal : Shigella dysenterae, Shigella flexneri, Shigella boydiiet Shigella sonnei (Delarras, 2014)

Les Shigelles sont des bactéries strictement humaines. Elles ne font pas partie de la flore intestinale normale ; on ne les trouve que chez les malades, les convalescents et les rares porteurs sains. Elles sont responsables de dysenterie bacillaire (Shigella dysenteriae1) qui décimait les armées en campagne. Actuellement, elles sont la cause, chez l'adulte, de colites infectieuses et chez l'enfant, de gastro-entérites sévères avec diarrhée muco-purulente et sanglante, fièvre et déshydratation. Ces infections surviennent par petites épidémies familiales ou des cantines scolaires. En France, c'est Shigella sonneique l'on isole le plus souvent. Les Shigella sont essentiellement rencontrées dans les pays chauds, en Asie (Shigella flexneri, Shigella boydiiet Shigella sonnei), en Afrique particulièrement au Burkina Faso, au Tchad, au Niger, Mali etc... (Le Minor et Veron, 1989).

Il existe quatre espèces de Shigella : Shigella dysenteriae1, Shigella flexneri, Shigella boydii et Shigella sonnei.

Le bacille de Shiga (Shigella dysenteriae 1) est sans contester celui qui détermine la dysenterie la plus grave. Elle est la cause des grandes et longues endémies de dysenterie. En plus de l'endotoxine sécrétée par l'ensemble des Shigelles, Shigella dysenteriae 1 élabore de plus une toxine protéique qui le rend plus pathogène que les autres. Son pouvoir pathogène expérimental est net pour le lapin(Lavergne et Burdin 1969 ; Pilet et al., 1979). L'injection intraveineuse de 1/10 à 2 ml d'une culture de 24 heures en bouillon au lapin, entraîne après deux à trois jours l'apparition d'une parésie, puis d'une paralysie du train antérieur. Des selles diarrhéiques sont émises, le train postérieur se paralyse. L'animal entre en coma, puis meurt. Ce bacille a pour biotope préféré les pays chauds et particulièrement en Asie. Les autres espèces, Shigella flexneri, Shigella boydii et Shigella sonnei provoquent également des diarrhées, mais dont le pronostic est nettement plus favorable (Dupeyron, 1997 ; CDC, 2002, Lavergne et Burdin, 1969). Il ressort que les principales causes des troubles digestifs sont les bactéries (Escherichia coli, Salmonella et les Shigella) (Bessimbaye et al., 2013).

3.1 Caractères morphologiques

Les caractéristiques morphologiques des Shigelles comprennent des bacilles gram négatif, non sporulés et non capsulés. Elles sont généralement mobiles grâce à des flagelles, bien que certaines souches puissent être non mobiles. Leur forme est typiquement en bâtonnet. Ces bactéries peuvent être observées au microscope comme des bacilles courts et arrondis, mesurant environ 0,5 à 1,0 micron de largeur et 1,5 à 3,0 microns de longueur. Elles sont anaérobies facultatives et peuvent se cultiver sur milieu sélectif SS (gélose Salmonella-Shigella), Hectoene, Mac Conkey et milieu lactosé non sélectif (Phe, 2014 ; Bianchi et al., 2019).

En culture, elles peuvent apparaître sous forme de colonies rondes et lisses sur des milieux de culture appropriés.

3.2 Caractères culturaux et biochimiques

Ce sont bacille à Gram négatif immobile, La température optimale de culture est de 37° C, supportent les Ph alcalin, aeroanerobies facultatifs, sur milieu Hektoen les colonies sont vertes de 2-4 mm de diamètre à bord régulier, lisses. Ses caracteres Biochimiques : faible pouvoir métabolique : Fermentent le glucose sans production de gaz, n'utilisent ni le lactose ni le saccharose, pas de production d'H2S, pas d'utilisation du citrate, LDC-, urée-, indole-. Les antigéniques : Ag O : antigène somatique permet la détermination des serovars au sein d'une même espèce .les produits élaborés sont : toxines - LPS : endotoxine des bactéries à Gram négatif. - Exotoxine thermolabile produite essentiellement par S.dysenteriae, constituée de 2 parties : A et B, cette toxine a une action

: cytotoxique : mort des cellules épithéliales du colon Neurotoxique : paralysie des souris Enterotoxique.

L'agent pathogène Shigella est un bacille à Gram négatif, immobile, qui appartient à la famille des Enterobacteriaceae(World HealthOrganization, 2008). Le genre Shigella comprend quatre espèces : S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii et S. sonnei, également désignées par l'appellation de groupes A, B, C et D respectivement(World Health Organization, 2008). Les trois premières espèces possèdent de multiples sérotypes. S. sonnei et S. boydii provoquent habituellement une maladie relativement bénigne avec diarrhée aqueuse ou sanglante(World Health Organization, 2008). S. flexneri est la cause principale de la shigellose endémique dans les pays en développement(World Health Organization, 2008).

L'immunité est spécifique de sérotype. Sd1, ou bacille de Shiga, diffère des autres Shigella par quatre aspects importants :

· il provoque une maladie plus grave, plus longue et plus fréquemment mortelle que les autres Shigella ;

· Il est plus souvent résistant aux anti-infectieux que les autres Shigella ;

· il provoque de vastes épidémies, souvent à l'échelle d'une région, avec souvent des taux d'attaque et des taux de létalité élevés.

Toutes les espèces de Shigella provoquent une diarrhée sanglante aiguë en envahissant et en détruisant par plages l'épithélium du côlon(World Health Organization, 2008). Il s'ensuit la formation de microulcérations et d'exsudats inflammatoires, et l'apparition de cellules inflammatoires (leucocytes polynucléaires) et de sang dans les selles(World Health Organization, 2008). Les selles diarrhéiques contiennent de 10⁶ à 10⁸Shigella par gramme. Une fois excrété, le bacille est très sensible aux conditions environnementales et meurt rapidement, surtout s'il est exposé à la dessiccation ou à la lumière solaire directe(World Health Organization, 2008).

3.4 Epidémiologie

La shigellose est une infection gastro-intestinale causée par l'une des quatre espèces de bactéries Shigella, dont S. sonnei. Il s'agit d'un agent pathogène virulent dont la dose infectieuse est très faible, ce qui signifie qu'il suffit d'un petit nombre de bactéries, soit environ 10 à 100 organismes, pour provoquer la maladie. Les êtres humains constituent le seul réservoir connu et peuvent excréter des bactéries dans les selles pendant des semaines après avoir présenté une diarrhée sanglante.

Les Shigella se trouvent dans le tractus intestinal des personnes infectées et peuvent se transmettre par voie fécale-orale à la suite d'un contact direct entre personnes, d'un contact avec les selles d'une personne infectée ou d'un contact indirect, par exemple par l'intermédiaire de mouches, d'objets souillés ou de la consommation d'aliments ou d'eau contaminés. Les porteurs asymptomatiques peuvent également transmettre la maladie. La transmission sexuelle durable est devenue une voie de transmission importante de la shigellose.

Les symptômes les plus courants associés aux infections à S. sonnei comprennent : diarrhée aqueuse ou sanglante, douleurs et crampes abdominales, fièvre, nausées, vomissements, perte d'appétit, maux de tête et malaise. La plupart des infections à S. sonnei provoquent une maladie de courte durée, avec une guérison en une semaine et un faible taux de létalité, mais ce pronostic n'est pas toujours applicable aux sujets immunodéprimés et des complications peuvent survenir. Les infections modérées à sévères sont habituellement traitées par des antibiotiques, mais compte tenu de l'incidence croissante des Shigella multirésistantes et ultrarésistantes dans le monde, les options thérapeutiques sont de plus en plus limitées. Des cas d'infections à S. sonnei ultrarésistantes ont été signalés précédemment en Australie et aux États-Unis d'Amérique.

La shigellose est endémique dans la plupart des pays à revenu faible ou intermédiaire (PRFI) et est une cause majeure de diarrhée sanglante dans le monde. On estime que chaque année, elle est à l'origine d'au moins 80 millions de cas de diarrhée sanglante et de 700 000 décès. La quasi-totalité (99 %) des infections à Shigella se produisent dans les PRFI et la majorité des cas (~70 %) et des décès (~60 %) concernent des enfants de moins de cinq ans. On estime que <1 % des cas bénéficient d'un traitement en milieu hospitalier.

La shigellose est endémique dans la plupart des pays en développement et constitue la première cause de diarrhée sanglante dans le monde(World Health Organization, 2008). On estime qu'elle provoque chaque année au moins 80 millions de cas de diarrhée sanglante et 700 000 décès(World Health Organization, 2008). Quatre-vingt-dix-neuf pour cent des infections dues à Shigella surviennent dans les pays en développement, et la plupart des cas (environ 70 %) et des décès (environ 60 %) concernent des enfants de moins de cinq ans. Probablement moins de 1 % des cas sont traités à l'hôpital--'--'-(Ung et al., 2019).

Les flambées de diarrhée sanglante due à Sd1 sont très fréquentes dans les zones pauvres et surpeuplées, avec un assainissement insuffisant et de mauvaises conditions d'hygiène et d'approvisionnement en eau(World Health Organization, 2008). Les réfugiés et les populations déplacées sont particulièrement exposés au risque. Au cours des vingt dernières années, des flambées épidémiques de grande ampleur ont éclaté en Afrique, en Asie du Sud et en Amérique centrale(World Health Organization, 2008). Entre 1993 et 1995, des flambées ont été rapportées dans plusieurs pays d'Afrique centrale et australe(World Health Organization, 2008). En 1994, une flambée brutale parmi les réfugiés rwandais au Zaïre a provoqué environ 20 000 décès au cours du seul premier mois(World Health Organization, 2008). Entre 1999 et 2003, des flambées ont été rapportées en Sierra Leone, au Libéria, en Guinée, au Sénégal, en Angola, en République centrafricaine et en République démocratique du Congo(World Health Organization, 2008). En 2000, des flambées de diarrhée sanglante due à Sd1 résistant aux fluoroquinolones ont été observées en Inde et au Bangladesh. En Amérique centrale, la plus récente des épidémies de grande ampleur a duré de 1969 à 1973 et a provoqué plus de 500 000 cas et 20 000 décès(World Health Organization, 2008).

3.5Pouvoir Pathogène

C'est la forme la plus sévère des infections à Shigella(Charles & Jean-Louis, 2007). Elle est due à S. dysenteriae, sérotype 1. Après une brève incubation de 1 à 2 jours, elle se traduit pardes douleurs abdominales, de la fièvre et l'émission de selles afécales faites de glaires mucosanglantes(Charles & Jean-Louis, 2007). Des perforations coliques peuvent se produire. La maladie peut se propager sur le mode épidémique et entraîner une mortalité appréciable sur des terrains fragiles(Charles & Jean-Louis, 2007).

Les infections à Shigella se traduisent plus souvent par une diarrhée d'allure plus commune. Elles surviennent surtout chez l'enfant(Charles & Jean-Louis, 2007). La diarrhée peut être sanglante et suivie parfois d'un syndrome hémolytique et urémique. Les infections à Shigella sont très fréquentes dans les pays en voie de développement, mais s'observent aussi dans nos régions, avec une incidence beaucoup plus faible(Charles & Jean-Louis, 2007). Les shigelles sont responsables d'une partie des diarrhées des voyageurs(Charles & Jean-Louis, 2007).

Les shigelles envahissent le côlon (surtout dans sa partie distale) et provoquent une intense réaction inflammatoire au niveau de la muqueuse et de la lamina propria, ainsi que des ulcérations(Charles & Jean-Louis, 2007). Les bactéries n'ont pas tendance à se propager au-delà du côlon. Les shigelles ont la capacité d'envahir des cellules épithéliales grâce à un groupe de gènes plasmidiques (Ipa)(Charles & Jean-Louis, 2007). Elles provoquent au niveau de la cellule épithéliale des remaniements du cytosquelette qui permettent leur ingestion par un processus analogue à la phagocytose(Charles & Jean-Louis, 2007). Les shigelles lysent ensuite la vacuole de phagocytose et se multiplient activement dans le cytoplasme(Charles & Jean-Louis, 2007). Elles peuvent se déplacer dans la cellule et même d'une cellule à l'autre en provoquant une polymérisation de l'actine à un de leur pôle (grâce à un autre gène plasmidique). Lorsqu'elles sont phagocytées par des macrophages elles provoquent la mort cellulaire par apoptose et la libération de cytokines pro-inflammatoires, comme l'IL-1â. Les lésions semblent résulter à la fois de la prolifération bactérienne intracellulaire et de la réponse inflammatoire très intense(Charles & Jean-Louis, 2007).

S. dysenteriae produit une toxine de structure complexe, faite d'une chaîne polypeptidique A et de 5 chaînes B. Les chaînes B assurent la fixation de la toxine sur son récepteur cellulaire. La chaîne A pénètre dans la cellule et clive un résidu adénine au niveau d'un ARN ribosomal(Charles & Jean-Louis, 2007). Cette altération entraîne l'arrêt des synthèses protéiques et la mort cellulaire. La diffusion de la toxine de Shiga semble impliquée dans le syndrome hémolytique et urémique. Elle est très proche de la Shiga-like toxin des Escherichia coli entérohémorragiques. Deux entérotoxines (1 et 2) ont été décrites. Elles jouent un rôle dans la diarrhée(Charles & Jean-Louis, 2007). L'entérotoxine 1 est produite par S. flexneri, l'entérotoxine 2, codée par un gène plasmidique, peut être produite par différentes espèces de shigelles(Charles & Jean-Louis, 2007) .

La détection et la notification rapides des cas de diarrhée sanglante constituent la première étape, capitale, de la surveillance de la shigellose endémique et de la lutte contre la shigellose épidémique, et également des flambées de cas de dysenterie dus à E. coli entéro-hémorragique(World HealthOrganization, 2008). Le nombre de cas de diarrhée sanglante et de décès associés doit être déterminé et rapporté pour deux groupes d'âge, les enfants de moins de cinq ans et les patients de cinq ans et plus--'--'-(Ung et al., 2019). Tous les établissements de santé doivent désigner un responsable qui sera chargé de la notification exhaustive des cas de diarrhée sanglante et des décès associés(World Health Organization, 2008). Les rapports doivent être envoyés une fois par semaine au responsable sanitaire de district chargé de la surveillance de l'apparition des cas et de la détection des flambées épidémiques. Aux fins de surveillance, la définition standard des cas de diarrhée sanglante ou de dysenterie est « diarrhée avec présence de sang visible dans les selles »(World Health Organization, 2008).

Shigella est fortement associée à la dysenterie (McQuade et al., 2020).En conséquence, les lignes directrices de l'OMS recommandent le traitement de tous les cas pédiatriques de dysenterie avec de la ciprofloxacine ou de l'azithromycine pour une infection présumée à Shigella (Williams, 2018).

3.5.5 Bases du Traitement

En dehors du traitement symptomatique (réhydratation), il comprend l'administration d'un antibiotique. Les shigellose n'ont pas de résistance naturelle vis-à-vis des antibiotiques actifs sur les bactéries à Gram négatif, mais les résistances acquises ne sont pas rares, d'où la nécessité d'un antibiogramme. En première intention, le cotrimoxazole, une fluoroquinolone ou une pénicilline A peuvent être utilisés.

3.6Shigella Vaccin

La diminution de l'incidence de la shigellose avec l'âge suggère qu'une immunité naturelle se développe, ce qui implique que les vaccins suscitant cette réponse naturelle peuvent être efficaces(Dekker el al., 2015). Il n'existe actuellement aucun vaccin Shigella homologué, mais il existe de nombreux vaccins en phase préclinique ou d'essais cliniques, y compris des vaccins vivants atténués, des vaccins à cellules entières tuées, des vaccins conjugués et des vaccins sous-unitaires (Kim et al.,2013). Des vaccins ont été conçus contre les antigènes O, et des vaccins conjugués ont également été développés à l'aide de plusieurs molécules antigéniques conservées (Barry et al.,2013). Les données sont limitées en ce qui concerne le paramètre immunitaire qui est en corrélation avec l'immunité protectrice (Porter et al.,2013). D'autres études sont nécessaires avant de savoir si un vaccin Shigella s'avérera efficace(Dekker & Frank, 2015).

Chapitre.2 Antibiotiques

2.1. Définition

Un antibiotique, du grec « anti » et « bios » qui signifient respectivement « contre » « la vie », est une substance chimique produite par des moisissures ou certaines bactéries afin de tuer ou bloquer la croissance d'autres bactéries (Muylaert et Mainil, 2012). Il est dit bactéricide lorsque l'antibiotique élimine 99,99 % des bactéries cibles et bactériostatique quand l'antibiotique bloque la croissance bactérienne. Les antibiotiques peuvent être produits naturellement ou par synthèse chimique (on parle d'antibiotique de synthèse) (Walsh et Wright, 2005). Dans tous les cas, il est produit de façon sélective pour lutter contre certaines bactéries et n'a aucun effet sur les cellules humaines, les moisissures et les virus. Les antibiotiques agissent de diverses manières sur des cibles bien spécifiques. La résistance d'une bactérie à un antibiotique se définit par sa capacité à croitre en présence d'un antibiotique donné. Une bactérie est dite multi-résistante lorsqu'elle résiste à au moins trois (3) antibiotiques appartenant à trois (3) familles différentes (Dureja et al., 2014). Le manuel bien connu de Brock de la microbiologie définit un antibiotique comme un agent chimique produite par un organisme et qui est nuisible à d'autres organismes (Yao, 2019.).

2.2Resistance Bactérienne

De nos jours beaucoup d'antibiotiques sont connus, mais leur surconsommation entraîne des résistances de certaines bactéries à certains d'entre eux, et même des multi résistances, au point de rendre à nouveau incurables les premières maladies que nous avons traitées avec succès avec les premiers antibiotiques(Carrière, 2001 ;Andremont A, 2011 ; Gangoue, 2007)).

Le développement de la résistance aux antibiotiques constitue un problème de santé publique d'ampleur mondiale nécessitant une intervention urgente et concertée des citoyens, des gouvernements, des médecins et vétérinaires, des éleveurs, des industries pharmaceutiques ainsi que des ONG nationales et internationales de santé publique (Tigaud, 2015 ; Longenberger et al., 2014).

2.2.1. Définition

Une souche est dite résistante lorsque la concentration d'antibiotiques qu'elle est capable de supporter est notablement supérieure à la concentration que l'on peut réaliser au lieu où se trouve la bactérie, et où quand elle supporte une concentration d'antibiotiques très supérieure à celle qui inhibe le développement de la majorité des autres souches de la même espèce (CA-SFM, 2022). La résistance peut être naturelle ou acquise (Cambau, 1997 ; Duval, 1980). Il existe plusieurs types de résistance.

Il existe deux types de résistance aux antibiotiques à savoir la résistance naturelle ainsi que la résistance acquise des souches.

2.2.2 Résistance naturelle

La résistance naturelle ou résistance innée ou encore résistance intrinsèque est la capacité de toutes les espèces d'une bactérie donnée à se développer en présence d'un antibiotique donné. Cette résistance est surtout portée par les chromosomes et toutes les espèces présentent le même profil de résistance (Philippon et Arlet, 2012). Ce type de résistance est transmis aux générations issues de la même espèce de façon verticale mais pas de façon horizontale c'est-à-dire entre des espèces phylogénétiquement différentes. La résistance naturelle peut être due à la production d'une enzyme (pénicillinase, bêta-lactamase par exemple) agissant sur des antibiotiques donnés (Walsh et Wright, 2005) ou par l'imperméabilité d'un antibiotique au sein d'une bactérie (Mérens et al., 2011). Les études ont montré que les bactéries à Gram négatif (E. coli, Salmonella) présentent une résistance naturelle vis-à-vis des macrolides qui sont des grosses molécules. Au regard du mode d'action, on peut observer une résistance naturelle de certaines souches vis-à-vis de certains antibiotiques. Par exemple, les antibiotiques agissant sur la paroi bactérienne n'ont aucun effet sur les bactéries à Gram négatif presque dépourvu de ladite paroi.).

2.2.3 Résistance acquise

Outre la résistance naturelle, il existe la résistance acquise au fil du temps et au regard de certaines conditions (Ploy et Denis, 2000). Ce type de résistance n'est pas stable au sein d'une espèce bactérienne et s'acquière dans le temps sous certaines conditions. Elle n'affecte pas toutes les espèces d'une bactérie. Elle peut être porter par un chromosome, soit des transposons ou par des plasmides conférant la résistance à certains antibiotiques (Gassama et al., 2010; Mérens et al., 2011). Comparativement à la résistance naturelle, ce type de résistance peut être transféré de façon horizontale c'est-à-dire entre des espèces phylogénétiquement différentes par l'intermédiaire de la conjugaison bactérienne (Muylaert et Mainil, 2012). Elle constitue de nos jours un véritable problème de santé publique et touche la plupart des espèces bactériennes pathogènes et non pathogènes. La résistance acquise peut avoir plusieurs causes telles que la présence d'une forte quantité de résidus d'antibiotiques, l'automédication, ainsi que l'usage abusive des antibiotiques dans l'antibiothérapie. La résistance acquise se fait au moyen de plusieurs mécanismes, surtout moléculaires.

2.2.4 Causes des résistances acquises

La cause principale se trouve dans le mauvais usage des antibiotiques, souvent lorsqu'ils ne sont pas indiqués à des doses insuffisantes, quelque fois en croyant éliminer un germe alors que s'en est un autre qui est responsable de l'infection. Des considérations qui ne sont pas vraiment médicales conduisent trop souvent à employer le dernier antibiotique connu, favorisant ainsi l'émergence des germes qui lui seront rapidement résistant alors que d'autres plus anciens auraient largement suffit (Bimetetal., 2000 ; Dupeyron, 1997).

2.2.5 résistance croisée

La résistance croisée fait référence au spectre d'inactivation liée à un même mécanisme de résistance vis-à-vis de divers antibiotiques appartenants à la même famille ou sous-groupe. Cette notion et utilisée lors de lecture interprétative de l'antibiogramme. Parmi les nombreux cas de résistances croisées, des mutations dans les topoisomérases type II, gyrase ou topoisomérases IV induisent la résistance à l'ensemble des Fluoroquinolones. Un autre exemple de résistance croisée est celui de la résistance à la méticilline des staphylocoques par la production d'une nouvelle PLP2a qui procure également la résistance aux autres molécules de la famille des â- lactamines. La conséquence majeure de la résistance croisée est la sélection croisée. Quant à laco-résistance, plusieurs mécanismes de résistance peuvent être associés chez la même bactérie, parfois stabilisés par intégration dans le chromosome. Chacun des mécanismes confère par résistance croisée la résistance à un groupe d'antibiotique conférant à la bactérie un large spectre de résistance (Moubarecketal., 2007).

2.2.6 Mécanismes biochimiques de la résistance

Les mecanismesbiochimiques peuvent être regroupés en trois grands types de mécanismes Cf (Figure 4) :

Les résistances par l'inactivation enzymatique de l'antibiotique : les bêtalactamases (pénicillinases, céphalosporinases, imipénimases) sont les plus importantes. Ce sont des enzymes sécrétées notamment par certains Staphylocoques, Haemophilus, Neisseria et plusieurs entérobactéries, qui détruisent les antibiotiques à noyau Bêta-Lactam (Bêta-Lactamines). Signalons au passage que les pénicillines agissent en empêchant la synthèse du peptidoglycane, principale constituant de la paroi bactérienne. Il existe un antagoniste aux bêtalactamases ; l'acide clavulanique lui-même élaboré par un champignon, Streptomyces clavuligenus. Cette sécrétion est en générale naturelle à un taux suffisant pour être efficace. Mais dans certains cas, la bactérie est naturellement productrice de cette enzyme à un taux faible, peu efficace. Elle peut subir une augmentation temporaire de cette sécrétion par le contacte avec un antibiotique de la famille des bêta-lactamines. C'est le seul cas ou la résistance est induite par la présence du germe (Zebaetal., 2007 ; Cambau, 1997). Prenons l'exemple des ß-lactamines chez un bacille à Gram-négatif, qui pour agir, doivent traverser la membrane externe ou la paroi au niveau des porines (motif en bleu ; Figure 8), puis traverser l'espace cytoplasmique et enfin se fixer sur des cibles ou protéines liant la pénicilline (PLP en marron : Figure 8) qui sont situées principalement au niveau de la membrane cytoplasmique. Cette fixation amène à une inhibition de celles-ci (transpeptidase, transglycosylase....) entraînant des modifications morphologiques de type filaments (Figure 9) ou au contraire formes sphéroïdes. Le résultat final est une inhibition de la synthèse du peptidoglycane (couche interne de la paroi en rose : avec quelquefois, une lyse finale (Lozniewskia et Rabaud, 2010).

Figure 4 : modification morphologique d'une souche bactérienne lors d'un traitement par une pénicilline à large spectre (Philippon, 2004)

v Diminution de la perméabilité de la membrane à l'antibiotique

La diminution delaperméabilité(mutationaffectantlastructuredesporinesou diminuantlasynthèsedesporines parlesquellesl'antibiotiquepeutpénétrerdanslabactérie)eteffluxactif :l'effluxreposesurunepompeinsérée danslamembraneetcapabled'éjecterl'antibiotiquehorsdelabactériegrâceuncanal ;ceteffluxconduitàune diminution dela concentration intracellulaire de l'antibiotique (Bimetet al., 2000 ; Cambau, 1997 ; Carbonelletal., 1987 ; Yang etal., 2009).

v modification de cibles

La modification de la cibledes antibiotiques : modification desPLP, les PLP ou "protéines liant les pénicillines" sontdesenzymesquicatalysentl'étapefinaledelabiosynthèsedupeptidoglycane(paroibactérienne)etquisont lacibledesbêta-lactamines(ensefixantauxPLPlesbéta-lactamineslesempêchentdejouerleurrôle ;la synthèse dupeptidoglycane est donc entravée). Trois mécanismes peuvent intervenir (Figure 9) :

a)diminutiondel'affinitédesPLPpourlesbêta-lactamines(Streptococcuspneumoniae;lesbéta- lactamines ont du mal à se fixer aux PLP qui restent disponibles pour la synthèse du peptidoglycane) ;

b) augmentation dela synthèse desPLPexistantes avec hyper-expression de PLPpossédant naturellementunefaibleaffinitépourlesbêta-lactamines(Enterococcusspp ;casprécédentavecenplus uneaugmentationdunombredePLPdisponiblespourlasynthèsedupeptidoglycanecequiconduitàune impossibilité pour une même dose de béta-lactamines de toutes les bloquer)

c)synthèsed'uneoudeplusieursnouvellesPLPinsensiblesauxbêta-lactamines(Staphylococcus aureus: l'acquisition et l'intégration dans le chromosome d'ungène(mecA), d'originemal connue, induitla synthèsed'unenouvelle PLP,laPLP2aqui est capable d'assurerà elle seulel'assemblagedu peptidoglycaneet elle confère une résistanceà toutes lesbêta-lactamines (Lozniewskia et Rabaud, 2010, Hedi et al., 2007).

Figure 5: Schéma récapitulatif des quatre types de stratégie de résistance à un antibiotique (Aarab et al., 2011).

v Excrétion par des systèmes d'efflux

Enfin, l'excrétion de l'antibiotique hors de la cellule : mécanisme rare. Bien entré dans la cellule, il en est chassé avant d'avoir pu agir. Ces différents mécanismes peuvent s'associer (Bimetetal., 2000 ; Cambau, 1997 ; Cattoir, 2004) (Figure 5).

Le système d'efflux actif est efficace grâce aux protéines transmembranaires ancrées dans la membrane plasmique mais également dans la membrane externe des bactéries Gram négatif). Ces protéines sont spécifiques d'une classe d'antibiotiques ou au contraire responsables de « multidrugresistance » (MDR). Pour fonctionner, les pompes à efflux utilisent l'énergie fournie par dissipation d'un gradient de protons (familles MFS, RND et SMR) ou d'ions sodium (famille MATE) ou encore par hydrolyse d'ATP (famille ABC) (Figure 5). En cas d'hyperexpression de ces systèmes, Chez les bactéries à Gram positif, les systèmes d'efflux ne sont constitués que d'une pompe transmembranaire. Chez les bactéries à Gram négatif, les systèmes d'efflux sont souvent des complexes protéiques ternaires avec une pompe transmembranaire, une protéine périplasmique de jonction et une porine de la membrane externe. Les pompes les plus fréquemment rencontrées sont de type RND comme AcrB chez Escherichia coliou MexB chez Pseudomonas aeruginosa(Cattoir, 2004). Lors d'une hyperexpression, ces systèmes d'efflux, comme celui correspondant aux gènes marRAB chez E. coli, entraîne une résistance généralement à bas niveau et croisée à différentes familles d'antibiotiques.

Figure 6 : Représentation schématique des cinq familles de pompes d'efflux d'après CATTOIR et al (2004)

MFS ou major facilitatorsuperfamily(ex. NorA chez Staphylococcus aureus) ; SMR ousmallmultidrugresistance(ex. EmrE chez Escherichia coli) ; MATE ou multidrug and toxic compound extrusion (ex. NorM chez Vibrio parahaemolyticus) ; RND ou resistance-nodulation cell division (ex. MexB chez Pseudomonas aeruginosa) avec MexA (membrane fusion protein) etOprM (outer membrane factor) ; ABC ou ATP-binding cassette (ex. LmrA chez Lactococcus lactis). ME, EP : membrane externe et espace périplasmique des bactéries à Gram négatif ; MC :membrane cytoplasmique ; ATB : antibiotique.

2.2.7Salmonella et résistance aux antimicrobiens

Salmonella est naturellement sensible à tous les antibiotiques habituellement efficaces sur les bactéries à Gram négatif. La résistance aux antibiotiques chez Salmonella est devenue, ces dernières décennies, matière à inquiétude pour la santé publique dans le monde (Weill et al., 2004c). C'est à partir de 1997, que l'OMS signalait l'augmentation alarmante de l'incidence de souches de Salmonella non typhiques résistantes aux antibiotiques (WHO, 1997).

En 2002, plusieurs études comparatives de la résistance aux antibiotiques chez Salmonella non typhiques d'origine humaine, animale ou environnementale réalisée dans l'UE et à travers d'autres continents a montré des niveaux de multi-résistances très inquiétants (Boerlin et Reid-Smith, 2008 ; Cobbold et al., 2006 ; Lauderdale et al., 2006). L'analyse de la sensibilité aux antimicrobiens des souches humaines du sérotype Typhimurium a montré des niveaux élevés et stables de multi-résistance depuis 1993. Il s'est avéré que cette multi-résistance est due à la présence d'un clone particulier, individualisé grâce à son lysotype DT104. Ce clone a intégré dans son chromosome, un îlot génomique de 43 kb, appelé Salmonella Genomic Island 1 (SGI1), dont une partie porte les différents gènes impliqués dans la résistance à l'ampicilline (A), blaPSE-1, à la streptomycine (S) et à la spectinomycine, aadA1, au chloramphénicole (C), floR, aux sulfamides (Su), sul1, et aux tétracyclines (T), tetG, d'où son nom de clone «penta-résistant» ou «ACSSuT» (Cloeckaert et al., 2007 ; Mulvey et al., 2006 ; Weill, 2009). Il a d'abord émergé au Royaume-Uni dès 1989 dans le bétail, puis chez les volailles, moutons, porcs et chevaux et enfin chez l'homme. Il a ensuite disséminé en Amérique du Nord et dans plusieurs pays européens (Aarestrup et al., 2007 ; Casin et al., 1999 ; Glynn et al., 1998 ; Threlfall et al., 2003). Salmonella Enteritidis, sérotype prédominant chez l'homme jusqu'en 2004 en France, est resté majoritairement multi-sensible aux antibiotiques sur la période 1993 à 2004, tandis que le sérotype Hadar, souvent retrouvé dans la filière avicole, présentait des niveaux élevés de multi-résistance aux antibiotiques (Weill, 2009). Ces dernières années, de plus en plus de sérotypes de Salmonella ont acquis des résistances diverses à plusieurs familles d'antibiotiques tels que les beta-lactamines (Weill et al., 2004), les aminosides, les quinolones (Cloeckaert et Chaslus-Dancla, 2001), les fluoroquinolones (Walker et al., 2000), les céphalosporines, etc., molécules de choix lorsqu'un traitement s'avère nécessaire lors des infections systémiques à Salmonella (Stevens et al., 2006 ; Threlfall, 2002 ; Weill, 2009). Depuis 2000, c'est le cas de Salmonella Kentucky résistante à haut niveau aux fluoroquinolones, qui a été identifiée chez l'homme en France, au Danemark, en GrandeBretagne et aux USA. Les patients étaient le plus souvent de retour d'un voyage au Maghreb. Cette souche appelée ST198 serait apparue dans les années 90 en Egypte, aurait ensuite acquis petit à petit tous ses déterminants de multi-résistance dont la résistance à la ciprofloxacine en 2000. Ensuite elle semble s'être disséminée rapidement à l'ensemble du continent africain à partir de 2005, puis au Moyen-Orient et maintenant en Asie (Le Hello et al., 2011, Guillon et al, 2013). Elle a également été détectée dans des élevages de volaille : des poulets en Ethiopie en 2007 (Le Hello et al., 2011), des poules pondeuses en Algérie en 2009 (Bouzidi et al., 2011), des dindes au Maroc dès 2006 (Bouchrif et al., 2008) et en Pologne en 2010 (Wasyl et al., 2012). Devant l'émergence mondiale de cette souche hautement résistante aux antibiotiques, plusieurs microbiologistes dont Le Hello et al. (2013).

L'antibiothérapie est une approche très précieuse, soumise à des règles strictes d'utilisations dont l'inobservation peut avoir des conséquences très regrettables :

- parcequ'elle est à l'origine de l'acquisition de la résistance des souches bactériennes.

La mise en oeuvre d'un traitement antibiothérapie, nécessite un certain nombre de règles à suivre :

- l'activité de l'antibiotique pendant une durée suffisante en tenant compte des particularités : âge, sexe, grossesse, et pathologies associées (Cambauetal., 1997 ; Duval, 1980)

Au Tchad, il a été constaté, selon les fiches d'enquêtes, que les antibiotiques des familles suivantes sont les plus utilisés : Bêta-lactamines (Pénicillines, Céphalosporines), Aminosides, Chloramphénicols, Tétracyclines, Macrolides, Sulfamides, Quinolones, Fluoroquinolones et divers''(Bessimbaye et al., 2021).

Analyse des modifications dans la structure de la protéine (substitution d'acides aminés), qui est elle-même le reflet de mutations d'ADN au niveau des gènes de structures de ces protéines par électrophorèses en gel d'amidon ou d'acrylamide-agarose, électrophorèse en gel de polyacrylamide en milieu dénaturant ou (SDS-PAGE) constitue une de ces techniques (Begum et al., 2008). Les études ont porté essentiellement sur les enzymes (iso-fonctionnels) ou (iso-enzymes) pour lesquels une mutation n'altère pas la fonction enzymatique mais provoque une variation de migration électrophorétique. On peut ainsi, pour une souche donnée, obtenir une combinaison de variants pour l'ensemble des enzymes étudiés, appelée «Type Électrophorétique». Particulièrement étudiées pour les Salmonelles permettant de définir différents zymotypes (Selander et al., 1986).

La détermination du nombre et de la taille des plasmides nécessite d'extraire l'ADN plasmidique, de les séparer par électrophorèse en agarose et de les révéler après coloration au bromure d'éthidium (BET), les profils plasmidiques ont été utilises dans plusieurs enquêtes afin d'aider à caractériser des souches de même sérotype et d'origines divers (Borrego et al.,1992 ; Martinetti , 1990), elle a permis de subdiviser des lysotypes chez Typhimurium et Enteritidis (Threlfall et al., 1989 ; Threlfall et al., 1990). D'autres types d'analyses plus précises peuvent être réalisées comme la détermination du profil de restriction ; les méthodes employées sont alors très fortement identiques à celles utilisées pour l'ADN chromosomique et permettent d'obtenir un profil de restriction plasmidique. Cette analyse peut être intéressante pour la mise en évidence de gènes portés sur un plasmide et elle accroit la discrimination entre les souches et permet de mesurer le degré de parenté entre de plasmides de taille similaire (Yves Millemaan, 1998). Toutefois la détermination de profil plasmidique n'apparait pas aussi intéressante que les autres méthodes de typage comme la lysotypie quand le nombre de plasmides est réduit (Poppe et al., 1993) et dans le cas ou les plasmides sont tellement fréquents dans une espèce qu'ils ne permettent plus de les subdiviser (Threlfall, 1994).

Les méthodes utilisent schématiquement deux types de technologie, l'amplification génique ou PCR (Polymérase Chain Réaction) et la restriction enzymatique, ces deux derniers pouvant parfois être combinés pour certaines caractérisations particulières.

Les techniques PCR ont l'avantage d'être simples à mette en oeuvre et de permettre d'obtenir un résultat très rapidement. Après la phase d'extraction de l'ADN, la PCR est réalisée, suivie de l'électrophorèse des produits amplifiés et de la révélation de ces produits par coloration au bromure d'éthidium (BET), permettent de réaliser une amplification génomique de certaines séquences d'ADN, c'est ainsi plusieurs techniques ont été proposés telle :

· La Technique RAPD « Random Amplification of Polymorphic DNA » C'est une méthode de typage très utilisée et nécessite une seule amorce choisie au hasard, formée d'environ une dizaine de nucléotides et s'hybridant à plusieurs endroits du génome. Les profils des produits amplifiés ainsi obtenus peuvent être caractéristiques de la souche et permettent une bonne discrimination au sein d'un sérotype donné (Hilton et al., 1996). Elle a été largement utilisée dans la caractérisation et le diagnostic de l'infection par Salmonella (Tikoo et al., 2001). RAPD a été décrite comme un procédé simple et rapide capable d'offrir des empreintes détaillées de la composition génomique de la bactérie (Welsch & McClelland, 1990), cette technique a prouvé son pouvoir discriminant puissant par rapport aux techniques phénotypiques pour la caractérisation de Salmonella Enteritidis de différentes origines (Betancor et al., 2004). Cependant la reproductibilité et la répétabilité de la méthode sont passables ce qui ne permet pas de l'utiliser pour un suivi de souches à long terme. En effet des profils RAPD différents peuvent résulter de faibles variations portant sur la concentration des amorces, le nombre et les conditions des cycles d'amplification, la qualité et la concentration de la Taq polymérase (Ellsworth et al., 1993 ; Meunie et al., 1993).

· La Technique MLST (MultilocusSequenceTyping) La technique MLST, développée en 1998 pour N. meningitidis (Maiden et al., 1998) du fait de la difficulté de comparer des résultats de MLEE (MultiLocus Enzyme Electrophoresis) (Caugant, 2002) est une méthode basée sur l'analyse de la séquence de 7 gènes dits « gènes de ménage » dont l'expression est indispensable et qui est responsable du métabolisme de la cellule. Les gènes séquencés ont la particularité d'être indépendants des gènes de virulence de l'agent pathogène et de sa résistance aux antibiotiques. Cette technique est utile pour des études épidémiologiques descriptives de biosurveillance, mais peut ne pas être assez discriminante pour des analyses en situation d'épidémie suite à l'évolution génétique lente de gènes de ménage (M'aide et a1., 1998). L'intérêt et l'avantage de cette méthode est qu'elle est parfaitement reproductible quelque soit le laboratoire et elle permet l'établissement d'importantes bases de données répertoriant chaque séquençage (Chan et al., 2001), et à laquelle des laboratoires du monde entier ont non seulement accès, mais peuvent également participer en partageant les séquences des souches qu'ils étudient. Pour salmonella, la base de données MLST (MLST Database at UoW, University of WARWICK) (mlst.warwick.ac.uk/mlst) est une des bases qui ont permis la standardisation de cette technique MLST pour cette bactérie avec sept gènes de ménages choisies (thrA, purE, sucA, hisDaroC, hemD et dnaN), amorces pour amplification et séquençage, d'un autre côté cette base de données offre les moyens de lecture d'interprétation des différentes séquences , détermination de profil allelique , sequencetype et ainsi le complexe clonal.

· La Technique MLVA (MultilocusVntrAnalysis) (Variable Numbers Of Tandem Repeats) Les répétitions en tandem sont constituées par la répétition et dans un même sens les uns derrière les autres, de motifs d'ADN répétés, par opposition aux répétitions « dispersées » dont les unités répétées sont dispersées dans le génome, elles sont initialement décrite chez les eucaryotes, les séquences répétées en tandem (TR) forment des familles de répétitions souvent distinguées en deux grandes classes : les microsatellites et les minisatellites (Jeffreys, 1985). Les séquences répétées, intra ou inter-géniques sont différenciées par leur taille, de 1 à 9pb pour les microsatellites formés par glissement lors de la Réplication et plus de 9pb pour les minisatellites formés lors de la réparation de cassures dans le double brin, d`origine réplicative (Vergnaud &Pourcel, 2009). Certaines séquences répétées en tandem présentent un polymorphisme de répétitions intra- espèce. Ces séquences polymorphes, qu'elles soient de type micro ou minisatellites, sont appelées VNTRs pour (Variable Number of Tandem Repeats). Selon les génomes bactériens elles peuvent représenter de 2 à 10% de l'ensemble des répétitions en tandem (Denoeud& Vergnaud, 2004). Les VNTRs sont des régions génomiques instables dont la mutation est médiée par plusieurs facteurs. La réponse à des stress environnementaux, est une des raisons de promouvoir cette forme de variabilité. Ces répétitions en tandem polymorphes sont nécessaires à l'adaptation des bactéries à leur environnement par action sur la fonction d'une protéine (variation antigénique, variation de phase, variation fonctionnelle, interaction avec d'autres bactéries, interaction avec la cellule cible, régulation de l'expression d'un gène) (Hood et al., 1996 ; Madoff et al., 1996). Les VNTRs en raison de leur polymorphisme de longueur résultant de la variation du nombre de motifs ont conduit au développement des empreintes génétiques permettant l'identification humaine dans un premier temps (Jeffreys, 1985), et des bactéries dans un deuxième temps, dont les premiers travaux ont été effectués sur Haemophilus influenzae en 1997 (Van Belkum, 1997) et Bacillus anthracis (Jackson, 1997). Depuis 2003, la méthode de génotypage par MLVA de S. enterica a été introduite (Lindstedt, 2003 ; Liu, 2003). Les avantages connus de cette technique sont les suivants : capacité de typage, reproductibilité, stabilité, concordance épidémiologique, ainsi que pouvoir de discrimination élevé en fonction des marqueurs et des sérotypes étudiés, (Vergnaud &Pourcel, 2009 ; Ramisse et al., 2004 ; Lindstedt et al., 2003), ce pouvoir discriminant a été prouvé et vérifié dans plusieurs études comparatives entre cette technique moléculaire (MLVA) et d'autres telles que l'électrophorèse en champ pulsé (PFGE) et la lysotypie (Boxrud et al., 2007 ; Ross &Heuzenroeder, 2009). La technique MLVA exploite comme source de polymorphisme la variation du nombre de motifs dans les répétitions en tandem. L'amplification par PCR d'une collection de loci répétés en tandem, et la mesure de la taille des fragments amplifiés, permettent d'assigner à une souche une série de nombres correspondant au nombre d'unités répétées dans chaque locus (Vergnaud &Pourcel, 2009). Des schémas MLVA pour certains sérotypes sont déjà établis pour d'autres ils sont en cours.

Ces méthodes consistent à couper l'ADN extrait et purifié, avec une enzyme de restriction, permettant ainsi de produire un certain nombre de fragments d'ADN qui seront ensuite séparés par électrophorèse en gel d'agarose et révélés par coloration au BET, deux plus importantes et les plus largement utilisées sont le ribotypage et l'électrophorèse en champ pulsé ou PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis).

· Ribotypage : IL s'est développé suite à la REA« Restriction Enzyme Analysis » qui donnait un nombre de fragments trop important pour que les profils soient facilement interprétables ; génère une empreinte hautement reproductible et précise qui peut être utilisée pour classer les bactéries du genre à travers et au-delà du niveau de l'espèce. Il consiste à transférer les fragments d'ADN ayant migré sur une membrane de nylon et à révéler seulement une partie de ces fragments à l'aide d'une sonde spécifique, une des sondes les plus couramment utilisées étant la sonde codant pour les ARN ribosomaux 16S et 23S de Escherichia coli ; elle permet donc de révéler les profils de restriction des gènes codant pour les ARN ribosomaux ou « ribotypes ». Le ribotypage a été appliqué à différents sérotypes de Salmonelles et son pouvoir discriminant est très variable d'un sérotype à un autre ; dans certains cas, il n'est pas possible de relier le ribotype obtenu à un sérotype donné (Selander et al., 1990).

· Électrophorèse en Champ Pulsé ou (PFGE) (Pulsed Field Gel Electrophoresis) Elle utilise une endonucléase de restriction à faible fréquence de coupure permettant ainsi de produire un nombre de fragments directement exploitable pour l'interprétation des profils. Ces fragments d'ADN doivent alors migrer dans un champ électrique particulier permettant la migration de fragments de grosse taille de 30 à 2000kb (Schwartz & Cantor, 1984) par la technique d'électrophorèse dite CHEF (ClampedHomogenous Electric Field). La révélation des fragments se fait de façon classique avec le BET. Les enzymes de macrorestriction utilisées pour le PFGE des Salmonella sont XbaI, BlnI ou SpeI (Murase et al., 1995). Cette technique a montré, de façon générale, un très bon pouvoir discriminant pour Salmonella, mais il existe des variations en fonction du sérotype étudié. C'est ainsi qu'il existe un bon polymorphisme par PFGE chez S. Typhimurium après digestion par XbaI alors que la même enzyme de restriction donne moins de diversité chez S. Enteritidis.

Utilise des techniques d'amplification géniques et de restriction enzymatique à la fois, dans le cas des Salmonelles, cette technique à été utilisée pour la caractérisation du gène de la flagelline, permettant ainsi une approche moléculaire d'identification des antigènes flagellaire (H) dans le but de se substituer à la sérotypie ou de révéler une phase flagellaire antigéniquement non décelable. Les gènes de flagelline de certains sérotypes ont été amplifiés puis clivés par des endonucléases HhaI ou HphI. Des profils de restriction de gène de flagelline ont été obtenus pour les deux phases flagellaires, mais la diversité rencontrée dans ces profils ne correspondait pas de façon précise aux résultats de l'agglutination flagellaire (Dauga et al., 1998).

Dans ce deuxième chapitre consacré aux matériel et méthodes utilisés pour traiter du sujet, ont été présentées successivement la zone d'étude, l'espèce à étudiér, les techniques d'échantillonnage, les traitements expérimentaux et les techniques d'analyse,.

Le Centre Hospitalier Universitaire de la Mère et de l'Enfant où les analyses bactériologiques ont été réalisées a une superficie de 15000m², il est limité au Nord par la rue Charles De Gaulle au Sud par le Centre Hospitalier de Référence Nationale et le Centre National de Transfusion Sanguine, à l'Est par la Direction Générale de la Police Nationale et le Marché Central et à l'Ouest par la rue du Canal Saint Martin. C'est un etablissement à caractère administratif, doté de la personnalité morale et jouissant de l'autonomie financière et de gestion. Il est placé sous la tutelle du Ministère de la Santé Publique. Cet Hôpital a pour mission de réduire la mortalité maternelle, néonatale et infantile notamment par :

§ Les études et recherches relatives aux problèmes de santé de la Mère et de l'Enfant

Photo 7 : Centre Hospitalier Universitaire de la Mère et de l'Enfant

Les analyses moléculaires ont été réalisées au Laboratoire de Biochimie et Immunuologie Appliquer (LABIA) à l'Université Joseph Ki-Zerbo au Burkina Faso.

1.2. Typeet période d'étude

C'était une étude transversale descriptive qui a étéréalisée en deux phases de juin à Decembre2022( phase de collecte de données et d'analyse) et Janvier 2023 jusqu'à décembre 2023 (2^éméphase d'analyse des données et redaction). Cette étude a concerné quatre (4) Hôpitaux des Districts Sanitaires (DS) et le CHU de la Mère et de l'Enfant de N'Djamena.

ü Méthodes de réalisation d'antibiogramme (Kirby-Bauer , Préparation de la gélose Muller Hinton,

1.4 Échantillonnage

Un échantillonnage exhaustif et consécutif de tous les patients de tous âges confondus hospitalisés ou non hospitalisés souffrant de diarrhées ou suspectés d'infections diarrhéiques reçus en consultation dans lesdifferentes structures sanitaires de notre zone d'etute a été réaalisé.

Les selles de routine et le sang des patients ont constitué notre échantillonnage. Mille cinquante (1050)echantillons des sellesprovenant des patients ont été reçus et mises en culture au LaboREDES et 320 sangs des patients qui ont une fièvre avec une temperaturesupérieure à 38° degrés. Les selles de routine ont été prélevées dans les flacons stériles chez les malades souffrant de troubles digestifs comme la diarrhée reçus au laboratoire du CHU ME ou soit prélevées dans les mêmes conditions chez les personnes souffrantes touché de troubles digestifs dans les hôpitaux des districts sanitaire de N'djamena dans des tubes stériles contenant de la gélose Cary-Blair pour des analyses au laboratoire de Bactériologie du LaboREDES.

1.3 .1 Enquêtes

Un questionnaire a été élaboré et émis aux patients ou aux accompagnants (Annexe VII). Les principales informations collectées étaient : la provenance, le sexe, l'âge et l'origine possible de la contamination (la source d'eau de boisson, aliments et le mode de vie de chaque personne admise).

Chaque patient inclus dans l'étude a fait l'objet de prélèvement des selles dans un flacon stérile.

ü Eprouvette graduée : pour mesurer la quantité d'eau pour faire dissoudre le milieu ;

ü plaque chauffante : pour la préparation des milieux de cultures des bactéries ;

ü Autoclave : pour la stérilisation des milieux et les verreries à 121 degrés,

ü Hotte de biosécurité : appareil dans lequel les manipulations se font en toute sécurité ;

ü Bec benzène : il produit de la flamme et permet de rendre le milieu stérile ;

ü verreries : tubes, erlenmeyer, boites de Pétri, béchers, pipettes, lames et lamelles,

ü Lames et lamelles : permettent d'étaler l'échantillon pour observer au microscope ;

ü Etuve à 37°C ;
· Microscope optique : permet d'observer les microorganismes ;

Ø Lugol : colorant permettant de marquer les structures cellulaires au microscope ;

Ø RVS (Rappaport Vassilliadis Soja) : milieu sélectif permettant la croissance des Salmonelles

Ø HKT(Hecktoen) : milieu sélectif (gélose) pour l'isolement et la différenciation des bacilles gram(-), milieu permettant le développement des colonies des salmonella et shigella ;

Ø L'ADN bactérien : a été extrait de cultures pures de souches Salmonella et shigella

Ø La Rep-PCR : a été réalisée avec l'amorce universelle (GTG) (5'-GTGGTGGGTGTGTGTG 3')

Ø Elements de la PCR : tampon de réaction (Buffer) MgCl2 dNTP Taq polymérase L'appareil thermocycleur pour PCR H2O bi-distillée et stérile ;

Ø Électrophorèse des produits PCR : Un volume de dix microlitres de chaque produit PCR a été placé dans les puits du gel d'aga- rose ;

Ø L'affiliation phylogénétique : des souches a été réalisée grâce aux empreintes génétiques obtenues par rep-PCR.

Matériel biologique : échantillons des selles et sangs permettent d'identifier les microorganismes

1.3.2 Procédure de collecte des données

Les données cliniques ont été recueillies sur une fiche de collecte de données réalisée à cet effet à l'aide d'un questionnaire présenté en face à face de l'enquêteur. La première partie de la fiche a été remplie à partir des dossiers et/ou à partir de l'interrogatoire de l'accompagnant (parents), concerne les principales variables qui sont : sociodémographiques des participants, les antécédents médicaux, les caractéristiques cliniques des patients et l'appréciation de la température corporelle. La deuxième partie concerne le laboratoire, aspect macroscopie des selles, microscopie à l'état frais et après coloration au Gram, les caractéristiques de la culture et les résultats de l'antibiogramme.

De chaque patient participant à l'étude, était prélevé un échantillon des selles pour faire la coproculture et les patients qui ont été soumis au test au thermomètre et qui présentaient une fièvre supérieure ou égale à 38 ^?C, un prélèvement sanguin veineuse de 10 ml sera fait chez chaque patient consentant à l'étude, qui présentait une fièvre supérieure ou égale à 38 ^?C et mis directement sur le flacon de l'hémoculture. Quant aux patients qui ont de diarrhée aiguë et qui ne sont pas sur le site ou on devrait faire l'analyse biologique seront prélevés par un écouvillon contenant un milieu physiologique à une température de conservation située entre 5 et 25°C susceptible de maintenir en vie les bactéries recherchées grâce à l'appui des agents de santé.

Une fois les prélèvements effectués, les échantillons ont été acheminés vers le laboratoire en vue de leur analyse. Les analyses ont été effectuées dès la réception des dits échantillons.

1.3.3 Critère d'inclusion

Les selles ont été prélevées chez des patients tout venant et souffrant de troubles digestifs, reçus en consultation au CHU ME et dans les quatre hôpitaux des districts de N'Djamena Tchad. Chaque personne incluse dans l'étude a fait l'objet de prélèvement des selles dans un flacon stérile ou écouvillons et présentant une fièvre supérieure à 38 ^?C ayant été hospitalisés ou ayant été reçus en consultation externes, précédant leur consultation à l'une des quatre hôpitaux des districts et le CHU de la mère et de l'enfant de la ville de N'Djamena étaient éligibles pour participer à l'étude.

Les patients ont été exclus de notre étude : tous les selles provenant des personnes sans trouble digestifs, les patients ne présentant une fièvre supérieure à 38 ^?C lors de la consultation et les personnes ayant prélevées des selles dans de conditions non appropriées.

1.4 Analyses microbiologiques et moléculaires

L'écouvillon, le pot et le flacon de l'hémoculture étaient acheminés immédiatement au Laboratoire CHU de la mère et de l'enfant et au laboratoire de recherche diagnostic et expertise scientifiques (LABO-REDES) ont étéimmédiatement traités.

Deux méthodes ont été utilisées pour réaliser les analyses microbiologiques : les méthodes manuelles de coproculture avec la galerie API 20E et la méthode de l'hémoculture.

L'isolement, l'identification culturale, la caractérisation biochimique, les tests sérologiques et la conservation des souches ont été effectuées au Centre Hospitalier Universitaire Mère et enfant et le LaboREDES N'Djamena (Tchad). La caractérisation moléculaire des souches des Salmonella a été réalisée au Labia Burkina Faso.

1.4.1 Enregistrement des selles

Les selles ont été reçues des malades hospitalisés dans des services du CHU ME et de malades externes venant des différents quartiers de N'Djamena et les quatre hôpitaux des districts de Ndjamena pour des consultations médicales.. Chaque selle reçue a été étiquetée conformément au numéro d'ordre dans le registre de coproculture et ensuite codé. Les flacons stériles, hermétiques et parfois munis d'une cuillère ou d'une spatule ont été recommandés pour le prélèvement et l'ensemencement plus pratique. On prélève à partir des matières fécales émises dans un récipient propre, quelques grammes de selles. Un fragment muco-purulent ou sanguinolent est choisi lorsqu'il existe.

Les selles de routines ont été recueillies dans des flacons stériles chez les patients reçus au laboratoire du CHU ME.

L'écouvillonnage se fait à l'aide d'un dispositif formé d'un écouvillon stérile et d'un tube en plastique contenant de l'eau physiologique stérile à 0.9%.

1.4.2 Examen macroscopique

Chaque selle reçue a été soumise à un examen macroscopique pour la description de leurs aspects et consistance

1.4.3. Examen microscopique

L'état frais se fait également pour l'observationde la mobilité et de la morphologie des germes .

2.5 Analyses microbiologiques

Une méthode a été utilisée pour réaliser les analyses microbiologiques. La méthode manuelle avec la galerie API^® 20E, et les milieux d'isolement.

1.5.1 Méthodes Manuelles de Coproculture

La mise en culture des différents milieux, passe par l'ensemencement de ces milieux (enrichissement, isolement).

1.5.3. Préparation des échantillons des selles

La préparation des échantillons des selles a été spécifiques pour chaque type de selles (selles de routine). Les fractions des selles d'environ 1 à 1,5 g ont été prélevées avec de pipette pasteur (en verre) ou avec une anse de platine stériles et ensemencées directement sur les milieux ou pour préparer un inoculum. Une fois que l'inoculum est préparé, les différents milieux sont ensemencés puis incubés à 37 ° C à l'étuve pendant 24 heures. Après incubation, nous procédons à l'identification des caractères culturaux et morphologiques des colonies bactériennes dans ces milieux.

1.5.4. Enrichissement

Le bouillon rappaport (Müller-Kauffmann) a été utilisé comme milieu d'enrichissement pour l'isolement des Salmonelles et Shigelles dans les selles. Une fraction de selles a été prélevée à l'aide d'une anse à platine et ensemencée dans le tube contenant le bouillon. Le tube ensemencé a été incubé à 37 ° C à l'étuve pendant 4 heures au minimum et 24 heures au maximum. Le bouillon devient trouble lorsque les bactéries l'utilisent. Ensuite une anse à platine a été trempée dans le bouillon puis ensemencée dans le milieu Hektoen et incubé à 37 ° C pendant 24 heures pour la recherche de Salmonella et Shigella.

1.5. Isolement

Le milieu Hektoen a été utilisé comme milieu d'isolement. Les milieux ensemencés ont été incubés à 37 ° C à l'étuve pendant 24 heures. Ensuite, les colonies vertes ou bleuâtres avec ou sans centre noir ont été recherchées pour l'identification des Salmonella et Shigella (Figure 19, 20 ; Anexxe XIII).

3.4. Identification des agents bactériens

Pour l'identification biochimique des bactéries, les galeries API^® 20E a été utilisé et la réalisation des antibiogrammes.

ü Les Salmonella, la plupart de Salmonella isolées (Typhi, para Typhi A, B) ont pour caractères biochimiques communs : ONPG -, Urée -, TDA -, Citrate de Simmons -, Indole -. Nous avons remarqué que les Salmonella Typhi et Salmonella para Typhi B sont souvent H₂S + faible après 24 heures de culture et plus prononcé 48 heures à 72 heures. Par contre, les Salmonella para Typhi A isolés ont quelques fois H₂S - après 24 heures de culture, mais, le H₂S apparaît faiblement 72 heures voir une semaine après culture. Elles produisent des gaz en glucose sauf Salmonella Typhi (Figure 14).

Figure 14 : identification sur galerie API 20 E Salmonella typhi differenciation biochimique

ü Les Shigella, la majorité des Shigella isolés ont pour caractères biochimiques négatifs, mais ils sont tous glucose + (Figure 16), catalase + sauf Shigella dysenteriae 1est catalase -. L'absence de gaz en glucose est un indice de suspicion. Les Shigella sont tous immobiles à l'observation microscopique

Figure 15 : identification sur galerie API 20 E Shigella flexneri différenciation biochimique

Tableau VIII : caractères biochimiques différentiels des entérobactéries pathogènes

Caractères différentiels des entérobactéries

Glucose

Lactose

ONPG

Uréase

TDA

Mobilité

Mannitol

Indole

H₂S

Salmonella Typhi

Salmonella para Typhi A

Salmonella para Typhi B

Salmonella para Typhi C

Salmonella Typhimurium

Salmonella enteritidis

(+)

(-)

(+)

Shigella dysenteriae 1

Shigella flexneri

Shigella sonnei

Shigellaboydii

(+) lent

(+)

(-)

3.4.3. Préparation de la gélose Muller Hinton

La gélose MH a été préparé selon les recommandations du fabriquant et stérilisée à la plaque chauffante pendant 15mn. Après stérilisation, elle a été autoclavée dans un bain-marie à environ 45°C. L'épaisseur de la gélose était de 4mm, ce qui correspond à un volume de 22,5 ml pour une boite de pétri avec un diamètre de90mm. Les boites de pétri ont été ensuite déposées sur une table à niveau pour la solidificationpuis s'ensuit le séchage à l'étuve.

3.4.4 Préparation de l'inoculum

A partir d'une culture de 18 à 24 heures sur la gélose MH, des colonies pures de la souche à étudier ont été mises en suspension bactérienne directement en solution salée (5ml d'eau physiologique) puis homogénéisées à l'aide d'un vortex. La densité du mélange a été ajustée à l'aide d'un densitomètre de sorte à obtenir une turbidité équivalente de l'étalon 0,5 Mc-Farland, ce qui correspond à un inoculum d'environ

UFC/ml pour Escherichia coli. L'inoculum a été ajusté en ajoutant une colonie si la suspension bactérienne n'a pas atteint une turbidité de 0,5 MacFarland ou en ajoutant l'eau physiologique stérile si la suspension était plus dense.

3.4.5 Ensemencement de l'inoculum

Un écouvillon stérile a été trempé dans la suspension bactérienne, puis pressé contre la paroi interne du tube. L'étalement se fait en frottant l'écouvillon sur toute la surface de la gélose de haut en bas en stries serrées et répété2 fois en tournant la boite de pétri à un angle de 60° de chaque côté de la boite afin d'obtenir une distribution homogène de l'inoculum (CLSI, 2010). L'application de disque se fait 5 à 10 minutes à une température ambiante (25°C) après ensemencement. Les boites de pétri ont été séchées à l'étuve à 37°C pendant 24heures.

3.4.6 Choix des disques

Quatorze antibiotiques ont été testés. Ces antibiotiques sont généralement actifs sur les entérobactéries et sont utilisés couramment en antibiothérapie probabiliste des infections dues aux entérobactéries particulièrement les gastroentérites. Ces antibiotiques étaient les suivantes : Ampicilline (25ug ;Amikacine (25ug), Amoxicilline+acide clavulanique (20/10ug), Ceftriaxone (30ug), Triméthoprime Sulfamides (30ug), ,Céfamadole (30 ug), Imipénème (10ug), Aztreonam (10ug), Norfloxacine (10ug), Colistine (30ug), Acide Nalixidique (30ug), Ciprofloxacine (5ug), Ofloxacine (5ug) Chloramphénicol (25ug).

3.4.7 Application des disques imprégnés d'antibiotiques

Les antibiotiques utilisés pour l'antibiogramme provenaient des disques Bio Mérieux et Bio Rad. Ils ont été placés individuellement avec des pinces stériles. Le nombre des disques par boite de pétri devait être de telle sorte que les zones d'inhibitions ne se coupaient pas afin de permettre la lecture des diamètres dans plusieurs directions. Le nombre de disque choisi variait entre 6 à 7 par boite de 90 millimètres.

3.4.8. Lecture et interprétation

Après 24 heures d'incubation, les zones d'inhibition circulaires autour de chaque disque ont été mesurées à l'aide d'une règle graduée et comparées aux zones d'inhibition standard. Les diamètres critiques ont été proposés par le fabricant conformément au NCCLS. (Performances standards for Antimicrobiolsucceptibillitytesting).

1.5. Méthodes Manuelles par l'hémoculture

Le diagnostic des bactériémies repose sur une mise en culture des bactéries éventuellement présente dans le sang, appelée hémoculture (diagnostic au laboratoire des bacteriémie, 2023). En règle générale, une hémoculture correspond à une paire de flacon aérobie et un flacon anaérobie (diagnostic au laboratoire des bacteriémie, 2023).

· Présence des signes de sepsis (hyperthermie > 38.5°, hypothermie < 36.5°, · frissons...)

· Existence d'une fièvre inexpliquée chez une femme enceinte, un nouveau-né ou un patient immunodéprimé ;

Les hémocultures inoculées sont acheminées au laboratoire sans tarder.
Lorsque le laboratoire utilise un automate d'hémoculture, pour éviter que la croissance bactérienne débute avant le dépôt des flacons dans l'automate, il est recommandé de ne pas placer les flacons ensemencés à 37°C.

Pour faire l'incubation on doit homogénéiser le sang et le bouillon par retournement des flacons puis on va incliner 5 à10 minutes le flacon aérobie afin de recouvrir et ainsi ensemencer la partie et ainsi ensemencer la partie. L'incuber à 37°C en position verticale le flacon d'hémoculture.

Examen visuel des flacons 1 à 2 fois par jour pendant 10 jours. Chaque jour, on inspecte les flacons pour rechercher les signes témoignant d'une croissance visible. Sur la gélose présence des colonies et dans le bouillon apparition d'un trouble ou d'une hémolyse.

Un flacon négatif montrera un culot globulaire rouge vif et le bouillon reste limpide et un résultat positif s'observe lorsque le mélange sang bouillon dépasse le manchon de l'indicateur de croissance.

Dans le cadre de la démarche qualité, et pour une bonne traçabilité, les prélèvements reçus au laboratoire sont inscrits dans les registres de laboratoire et saisis sur support informatique. Volume sanguin : le nombre de bactéries par ml de sang étant en général faible, il importe de prélever une quantité suffisante de sang :

ü Pour l'adulte, 10 ml par ponction veineuse périphérique. La veine du pli du coude est la plus indiquée.

Chez l'enfant ou le nouveau-né, le volume de sang à prélever doit être déterminé par le médecin traitant. Pour le nouveau-né, il est souvent difficile d'obtenir plus d'1 à 2 ml de sang. Chez l'enfant 2 a 5 ml de sang peuvent suffire. Un volume de 5 ml de sang est prélevé sur le patient et injecte directement dans les flacons d'hémoculture et incubé à l'étuve pendant une semaine. Lorsqu'on constate après une semaine des turbidités dans le flacon d'hémoculture, on va faire le gram, si c'est les bactéries à Gram négatif qui sont observées, la référence est faite à l'organigramme ainsi qu'il suit si le micro- organisme pousse sur la gélose au sang, faire un test d'oxydase et inoculer une galerie API 20 E. Les Enterobacteriacea (tels que Salmonella, Shigella) sont oxydase- négatifs. Pour le test d'oxydase l'aide de pince une goutte de réactif d'oxydase a été déposée sur le papier buvard, placé sur une lame porte objet. Ensuite une colonie bien isolée et représentative a été prélevée à l'aide de l'anse, puis frottée doucement sur le papier buvard. Le test est positif lorsqu' une coloration violette apparait dans un délai de 30 secondes. En absence de coloration ou coloration au-delà de 30 secondes le test est négatif (Paul, 2004). Dans ce test les caractéristiques des Salmonella, Shigella ont : oxydase (-).

Si les micro-organismes isoles sont identifiés comme étant Salmonella, Shigella et confirmer par la galerie API 20E, À l'aide d'une pipette, ont été introduit la suspension bactérienne dans les microtubes de la galerie. L'incubation s'est faite à 37°C pendant 24 heures. La lecture de ces réactions se faits à l'aide du tableau de lectureet l'identification des souches est obtenue à l'aide du tableau d'identification du catalogue analytique et faire l'antibiogramme pour les sensibilités des germes.

1.6. Analyses sérologiques

Le test d'agglutination a été exécuté en suivant les instructions de Kaufmann et White à l'aide des antisérums :

Il a été utilisé les sérums d'agglutinations polyvalentes, A, B, C et D, pour la recherche de Salmonella Typhi, Salmonella para Typhi A, B, C et D et également les sérums d'agglutinations OMA (O mélangé), OMB, OMC, OMD pour la recherche de leur appartenance aux groupes A, B, C et D. Enfin l'antigène Vi (initial du mot allemand Viehl qui signifie « beaucoup », il masque l'agglutinabilité O, et qui se rencontre que chez Salmonella Typhi, Salmonella para Typhi C et exceptionnellement chez Salmonella Dublin. Dans la pratique, les Salmonella paraTyphi C n'ont pas été isolées, le test d'agglutination avec le sérum Vi a été effectué pour attester la présence de Salmonella Typhi. Les antisérums H ont été utilisés pour la mise en évidences des antigènes flagellaires.

Pour les Shigella, les sérums d'agglutinations (Anti boydii, Anti flexineri, Anti sonnei) pour la recherche de chaque espèce (Shigella boydii, Shigella flexneri, Shigella sonnei) et le sérum polyvalent A₁ pour la recherche de Shigella dysenteriae 1.

Chapitre 2. Profil de résistance aux antibiotiques des Salmonella et Shigella isolés

La méthode des disques ou technique de Kirby Bauer en milieu gélosé a été également utilisées pour la réalisation de l'antibiogramme.

2.1 Méthode de diffusion en milieu gélosé

La méthode de test de sensibilité utilisée est celle de la diffusion en gélose MH (méthode des disques ou technique de Kirby Bauer) selon la technique recommandée par le Comité d'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CASFM, 2022). L'épaisseur de la gélose était de 4 mm, ce qui correspond à un volume de 25 ml pour une boite de Pétri (Ø 90 mm). L'antibiogramme a été réalisé à partir d'une souche pure, isolée sur gélose MH ou en culture pure. Cette méthode est basée sur le fait, lorsqu'un antibiotique est déposé sur la surface d'un milieu gélosé en un point donné, il diffuse en établissant un gradient de concentration inversement proportionnelle au diamètre de l'antibiotique. L'inoculum a été suffisamment dilué et comparé avec le standard des turbidités Mc Farland 0,5, qui est la densité optimale de sorte qu'après culture sur milieu de Mueller-Hinton il ait la formation de colonies toutes isolées mais jointives.

Dans les 15 minutes suivantes l'ajustement de la turbidité de la suspension d'inoculum, il a été trempé un écouvillon de coton dans la suspension. L'écouvillon trempé a été pressé fermement en le tournant contre la paroi inférieure du tube juste au-dessus du niveau du liquide pour enlever l'inoculum excédentaire. Ensuite, il a été étalé à trois (3) reprises sur la surface entière de la gélose, en tournant la boite à environ 60 °, après chaque application, pour obtenir une distribution égale de l'inoculum. Enfin partout du bord de la surface de la gélose a été écouvillonné.

2.2 Les disques d'antibiotiques

Tous les disques utilisés ont été fourni par la maison bioMérieux (réf: 55561 ; lot : 102014010). Les antibiotiques utilisés pour l'antibiogrammes proviennent des disques Bio Mérieux, disques Pasteur, Rosco et Difco, Bio Rad et DebenDiangosticsLt. Les antibiotiques sont issus des familles suivantes : Béta-lactamines (Pénicillines et Céphalosporine), Phénicolés, Cyclines, Sulfamides, Polypeptides et Quinolones.

Des disques de papier buvard de 6,35 mm de diamètre imprégnés d'une charge déterminée en antibiotique ont été utilisés pour les tests d'antibiogramme. 5 à 10 min après l'inoculum, les disques d'antibiotiques ont été appliqués sur les boites de Pétri. Les disques ont été placés individuellement avec des pinces stériles ou à l'aide d'un distributeur contre la gélose. Le nombre des disques par boites de Pétri doit être tel que les zones d'inhibition ne se coupent pas afin de permettre la lecture des diamètres dans plusieurs directions. Le nombre des disques choisi varie entre 6 à 7 par boite de 90 millimetres. Une fois que les disques ont été placés sur la gélose, elles sont laissées à la température du laboratoire (25 ° C) pendant environ 30 minutes puis ils sont portés à l'incubation pendant 24 heures à 37 ° C. Après une nuit d'incubation. La mesure du diamètre de chaque zone d'inhibition (diamètre du disque compris) en mm a été faite à l'aide d'un instrument de mesure gradué appelé pied de coulisse ou d'une règle graduée. La technique de disposition de disques d'antibiotiques est représentée par le schéma suivant :

2.3 Conservation des souches isolées

Le milieu de conservation est un milieu pauvre qui maintient les bactéries dans un état de vie ralentie. Le BCC (Bouillon Coeur Cervelle) avec 15% de glycérol (glycérine) a été utilisé comme milieu de conservation. Le glycérol a été utilisé comme huile minérale pour prévenir la dessiccation de la gélose du bouillon. Les colonies ont été raclées à l'aide d'un écouvillon puis introduite dans les tubes contenant le BCC glycérol . La conservation se fait dans un congélateur à - 86 ° C à l'aide de cryo-tubes dans une cryo-boite.

2.4 Caractérisation moléculaire de Salmonella

La caractérisation moléculaire des souches de Salmonella isolées a été faite au laboratoire de biochimie et immunologie appliquée Ouagadougou Burkina Faso.

La PCR (Polymerase Chain Reaction ou réaction de polymérase en chaîne) est une technique d'amplification d'ADN in vitro qui permet d'obtenir un très grand nombre de copies d'une séquence d'ADN cible.

Chaque cycle de PCR est constitué de trois étapes : une dénaturation de l'ADN par chauffage pour séparer les deux brins qui le composent, une hybridation des amorces aux extrémités de la séquence recherchée, puis une élongation grâce à l'action d'une ADN polymérase.

2.4.1 Extraction de l'ADN bactérien

Repiquer sur la gélose Mueller Hinton, les souches confirmées de Salmonella incuber à 37 °C pendant 18 à 24 H.

Prélever environ quatre à cinq colonies bien isolées de la culture bactérienne et les remettre en suspension dans 5 ml de Bouillon Coeur Cervelle, pour une culture à 37 °C pendant 24H.

L'extraction de l'ADN bactérien a été réalisée par thermolyse (Moyoet al., 2007). A l'aide d'une pipette Pasteur stérile, quelques colonies (02 à 03) de 18 à 24 heures ont été prélevées et placées dans un tube Eppendorf contenant 300 ìL d'eau stérile pour PCR. L'ensemble a été homogénéisé soigneusement jusqu'à la dissolution complète. Tous les tubes contenant la suspension bactérienne ont été placés dans un bain marie bouillant à 100 °C pendant 10 minutes. Après ce temps, les tubes ont été placés dans un congélateur pendant 5 minutes pour faire éclater les cellules par choc thermique. Ensuite, ces tubes ont été centrifugés à 12000 trs/mn. Le surnageant a été utilisé pour la PCR.

2.4.2. Préparation du mélange réactionnel

La rep-PCR (repetitivesequencebasedpolymerasechainreaction) a été réalisé en utilisant l'amorce universel GTG5 (5'-GTGGTGGTGGTGGTG-3'). Le volume total de mélange réactionnel était de 25 microlitre composé de 4 micro litre de Master Mix (5 *FIREPol^rMaster Mix), 2 microlitres de l'amorce GTG5 de concentration 10 micro molaire par ml,2 micro litre de Mgcl2 (2,5 Mm), 2 microlitres d'ADN et 15 microlitres d'eau pure (Water free nuclease).

2.4.3. Amplification des extraits d'ADN

L'amplification a été réalisé en trois étapes en utilisant le thermocycleur de type Mastercycler nexus gradient (Eppendorf). Le programme PCR décris par Cissé et al 2019, et Kaboré et al (2021) a été utilisé. Il s'agit d'une première étape de dénaturation initial a 94° C durant 4 mn, suivi d'une deuxième étape de 30 cycle constituée chacun d'une dénaturation a 95° C c durant 30s, une hybridation à 45° C durant 60s, une élongation à 65° C durant 8mn et enfin une troisième étape d'élongation finale à 65° C durant 16 mn. Les produits PCR ont été conservé au frais au 4 °C.

2.4.4. Préparation du gel d'agarose

Le gel d'agarose a été préparé en dissolvant 1 g d'agarose dans 100ml du tampon Tris Acétate EDTA (TAE) a 0,5X au four microondes (SHARP R65G10) jusqu'à la dissolution complète de l'agarose. Après refroidissement de la solution d'agarose,10 micro litre de Bromure d'Etilium (BET) a 10 mg/ml ont été ajoutés. Le mélange obtenu a été coulé dans une cuve horizontal contenant un peigne. Après solidification le peigne a été retiré, et le gel a été émerger dans une cuve de migration (ENDURO GEL XL).

2.4.5. Electrophorèse de produit PCR

La migration des amplicons a été faite sous un champ électrique de 40 volts et 30 mA durant 2 heure. Pour se faire, 10 microlitres de chaque amplicon ont été introduit dans un puits sur la gélose. Un marqueur de 100 pb a été utilisé pour la comparaison de la taille de bande dans chaque profil de souche étudier. Après la migration, le gel a été visualisé et photographié par le système d'imagerie UVP PhotoDoc-It Imaging System.

2.4.6. Traitement du gel

Une observation visuelle a l'oeil nu de profil d'empreinte génétique obtenue par la rep-PCR a été faite pour le groupage de souches. Les souches présentant les mêmes profils d'empreinte génétique ont été affilié à un même groupe (Cissé et al 2019).

2.4.7. Construction de l'arbre phylogénétique

les données obtenues par les empreintes génétiques de chaque souche ont été utilisé. L'affiliation phylogénétique des souches a été réalisée grâce aux empreintes génétiques obtenues par rep-PCR . La construction de l'arbre phylogénétique a été effectuée en effectuant une analyse de classification hiérarchique par le programme DendroUPGMA en utilisant l'index de similarité de Jaccard (Jaccard index, Tanimoto) selon Kaboré et al. (2021). Les profils de bande pour chaque isolat ont été convertis en matrice binaire, indiquant la présence ou l'absence d'une bande caractéristique. L'algorithme UPGMA a été appliqué à la matrice de similitude avec une valeur supérieure au coefficient de Jaccard (écart-type) moyen de 88 %. La souche de SalmonellaenteritidisATCC 13076 a été utilisé comme souche de référence.

2.4.8 Contrôle des milieux

Un contrôle de qualité, de la stérilité et de l'efficacité de chaque milieu a été effectué. Pour ce faire, les milieux de culture une fois préparées ont été incubés à 37°C pendant 24h. Le milieu est considéré comme stérile s'il y a eu une absence de pousse. Quant à l'efficacité du milieu, la souche de référence ATCC 13076 a été ensemencée sur les milieux et la présence d'une pousse bactérienne sur chaque milieu témoignait de son efficacité

2.4.9 Traitement des données.

Les données recueillies ont été saisies à l'aide d'un tableur Excel et le logiciel SPSS nous a permis de faire l'analyse statistique,qui a utilisé le test de chi-carré (÷²) pour la comparaison des variables qualitatives. La valeur de p = 0,05 a été considérée comme significative.

1.4.10 Considération éthiqueet administratives

lesautorisations des recherches duMinistere de la Santé Publique,de l'Ecole Doctorale, de la Faculté de Médecine et du Centre Hospitalier Universitaire de la Mère et de l'Enfant, ont été obtenues pour nous faciliter l'acces dans les differents structures sanitaires. Les patients ont été informés des objectifs avant la collecte des données. La confidentialité a été respectée, les données collectées étaient restées anonymes et exploitées pour cette étude.

Pour rendre possible les collectes d'échantillons dans les différents hôpitaux concernés par notre étude, il nous a fallu obtenir des autorisations des recherches, auprès de la formation de l'Ecole Doctorale, de la Faculté de Médecine, du Centre Hospitalier Universitaire de la Mère et de l'Enfantet de la Diriction General du Ministere de la Sante Publique et de la Solidarité National qui coordonne tout le système de santé tchadien. Cette autorisation de recherche delivré par le Ministère de la Santé du Tchad était notre carte d'accès dans les dans les differentsHopitaux des districts sanitaires et au CHU mere et enfant de N'djamenaet nous permettait de recueillir directement auprès de laboratoires respectifs de ces hôpiatux, tous les échantillons des selles et sang disponibles chez les patients malades hospitalisés .Les parents des enfants ont été informés des objectifs avant la collecte des données.les données collectées étaient restées anonymes et exploitées pour cette étude et les données collectées étaient restées anonymes et exploitées pour cette étude.

Pour effectuer notreetudeune fiche d'information et un formulaire d'assentiment individuel standard écrits en français a été remis aux participants. Chaque parent a eu l'opportunité de poser des questions auxquelles des réponses appropriées ont été apportées. Une fiche d'information a été remise aux participants avec une copie conforme signée du formulaire d'assentiment.

Les données concernant les enfants et les patients adultes inclus sont confidentiels et ne sont communiquées à personne en dehors de l'équipe de l'étude, sauf si cela est jugé nécessaire pour protéger la santé d'un enfant.

La confidentialité est garantie par un système de codage adapté. Les données nominales ne sont pas diffusées hors du site d'étude. Les dossiers des patients et toute information personnelle concernant les sujets participant à l'étude seront strictement réservés au personnel soignant et aux investigateurs directement impliqués dans l'étude.

Tous les questionnaires, consentements signés et autres documents relatifs à l'étude sont archivés en sécurité dans un local spécifique à l'archivage des données, dont l'accès est limité.

3emePARTIE : RESULTATS

Chapitre .1 .Nombre et origine des échantillons biologiques collectés et analysés

Pour faciliter la collecte d'échantillons dans les divers hôpitaux de district et au Centre Hospitalier Mère et Enfant, concernés par notre étude, nous avons dû obtenir une autorisation d'accès de la Secrétariat Général du Ministère de la Santé Publique et de la Prévention. Cette autorisation était notre laissez-passer pour accéder aux différents hôpitaux de district et au CHU, nous permettant ainsi de collecter directement auprès des laboratoires et services respectifs de ces établissements tous les échantillons de selles et de sang disponibles des patients malades hospitalisés.

Entre janvier 2022 et juin 2023, un total de 1370 patients ont été enregistrés dans quatre hôpitaux de district ainsi qu'au Centre Hospitalier Universitaire Mère et Enfant pour des cas de gastro-entérites aiguës. Parmi ces patients, 320 (soit 23,35%) présentaient une fièvre supérieure à 38°C lors de la consultation, tandis que 1050 (soit 76,64%) ont fourni des échantillons de selles diarrhéiques, collectés au CHU ME et dans les quatre hôpitaux de district.

3.2Origine géographique des échantillons

L'étude a examiné des échantillons de selles et de sang prélevés dans les quatre hôpitaux de district de N'Djamena à savoir : Hopital de district Est, Hopital de district Nord, Hopital de district Centre ,Hopital de District Sud ainsi qu'au CHU ME. Au total, 1350 échantillons ont été collectés et soumis à analyse. Ces échantillons ont été traités en fonction de leur type et du site de prélèvement correspondant.

Les Salmonella, après 18 heures d'incubation dans le milieu Hektoen, donnent des colonies qui ont un diamètre de 1 à 3 mm à 37 ° C (Figure 13). On a observé également des colonies naines, des colonies régulières lactoses négatifs et colonies vertes translucides à centre noir, dans certains cas, le centre noir n'apparaît pas. L'observation microscopique à l'état frais présente des bacilles mobiles.

Les Shigella, après 24 heures à 37 ° C, on observe des colonies très petites 0,5 à 1 mm de diamètre, bleuté (Figure 14). L'observation microscopique à l'état frais présente des bacilles tous immobiles

3.2.2 Répartition des échantillons en fonction de la nature de produit pathologique et des sites

La répartition des échantillons en fonction de la nature n'est pas équitable, elle varie de prélèvement d'un hôpital de district à un autre et d'un site à un autre.

Les malades en provenance de ces différentes localités ont été référés pour cause de l'absence de laboratoires d'analyses biomédicales ou soit par manque d'une structure adéquate pour la réalisation de la coproculture et l'hémoculture.

Le tableau X présente une analyse de corrélation entre l'âge des patients et leurs lieux de provenance, en relation avec les cas de maladies diarrhéiques. Les résultats démontrent une forte dépendance des lieux de provenance vis-à-vis des tranches d'âge des patients, cette relation étant hautement significative avec un seuil de 5%. Il a été observé que les enfants âgés de 0 à 5 ans représentent la tranche d'âge la plus touchée par les maladies diarrhéiques, avec une proportion de 30,65% dans la population étudiée. Ensuite, les patients âgés de 21 ans et plus représentent 25,18% de cette population affectée.

Une analyse plus approfondie révèle une différence significative dans l'incidence des maladies diarrhéiques entre les enfants de 0 à 5 ans et les individus âgés de plus de 21 ans, par rapport aux autres groupes d'âge. Cela est confirmé par une statistique de test du chi carré (÷²) élevée, s'élevant à 16 658 avec un degré de liberté (ddl) de 1 et une valeur p de 0,001.

En somme, ces résultats mettent en lumière le fait que les infections diarrhéiques ne se limitent pas à des régions spécifiques, qu'elles soient rurales ou urbaines.

3.3Identification des sérotypes des agents bactériens isolés

3.3 .1 Caractéristiques sociodémographiques et cliniques des patients inclus

Les données présentées dans le tableau XI révèlent la distribution des selles en fonction de l'âge, des caractéristiques telles que l'aspect et la consistance, ainsi que la présence de fièvre égale ou supérieure à 38 degrés. D'après les informations contenues dans les fiches d'enquête en annexe, le nombre de selles émises par jour variait de 3 à 14, tandis que certains patients présentaient une fièvre égale ou supérieure à 38 degrés. Il est remarquable que la plupart des enfants concernés émettaient entre 3 et 7 selles par jour. Les enfants dont l'age varient entre 0 à 5 ans sont les plus exposés aux diarrhées avec un nombre de 339 cas des diarrhées ce qui representaient un pourcentage de 24,74%, l'age comprise entre 6 à 10 represent 15,83%,l'age comprise entre 11 à 15 represente 19,12%,l'age comprise entre 16 à 20 ans represente20,07% et l'age comprise entre 21 à plus represente 20,21%.

AGE (ANS)	ASPECTS ET CONSISTANCE DES SELLES
AGE (ANS)	Sang	Mucus	Liquide	Pâteuse	Molle	Moulée
0-5	10	16	105	71	35	2
6-10	53	28	44	52	25	15
11-15	44	19	62	80	35	22
16-20	70	12	53	73	41	26
21 ET +	43	31	100	42	44	17
TOTAL (%)	320(23,3)	106(7,73)	364(26,56)	318(23,2)	180(13,1)	82(6,00)

3.4.3 Répartition mensuelle des cas de diarrhées et agents bactériens

La figure 13 illustre les fréquences de réceptions de selles et les agents bactériens isolés durant la période d'étude. On observe que pendant les mois d'Août, Septembre, Octobre plus d'échantillons de selles provenant de personnes se plaignant de diarrhées ont été réceptionnées indiquant une forte prévalence de ces infections diarrhéiques

Figure 19 : Répartition mensuelle des cas de diarrhées et agents bactériens isolés

Cette prévalence élevée des cas de diarrhées pendant les mois d'Août, Septembre, Octobre peut s'expliquer par le fait qu'elle se situe à la saison pluvieuse qui est une période où on observe d'important drainage des immondices chargées de différents germes par les eaux de pluie. Aussi l'infiltration étant importante la montée de la nappe phréatique pendant la période de la saison des pluies pouvant provoqués des contaminations de certaines eaux souterraines de pompes et des puits de consommation courantes dans les périphéries de N'Djamena.

3.4.4 Types et nombre des sérotypes identifiés

L'ensemble des méthodes de diagnostics réalisés sur les 1370 échantillons de selles humaines et du sang nous a mis permis d'identifier 50 souches qui sont des salmonella et shigella pour troubles digestifs, on note une prévalence d'infection de 66,1% chez les femmes et de 53,2%. Chez les hommes.

Le tableau 6 nous présente la corrélation entre le sexe et le résultat Total. Il ressort de ce résultat qu'aucune différence significative entre le sexe et le résultat total avec la P-value de 0,122. Ce résultat montre tout de même que le sexe féminin était plus positif à la culture par rapport au sexe masculin avec respectivement un taux de 66,1% et 53,2%.

3.4.5 Facteurs de risque associés à l'infection par les sérotypes des agents bactériens isolés

Les méthodes de diagnostic bactériologique utilisées sur les échantillons de selles et de sang ont permis d'identifier 50 souches de Salmonella et Shigella d'origine humaine. Ces souches ont été isolées à partir de deux produits pathologiques courants, à savoir les cas de gastro-entérites, de diarrhées et de dysenteries. Au cours de cette étude, il a été constaté que 3,6% des 1370 échantillons de selles et de sang, collectés dans quatre hôpitaux de district de la capitale ainsi qu'au CHU ME, et examinés par les méthodes d'hémoculture et de coproculture, se sont révélés positifs pour les genres Salmonella et Shigella.

Figure 20 : Distribution des germes isolé dans les hôpitaux de districts et CHU ME

La figure 18 illustre la corrélation entre le lieu de résidence des personnes interrogées et les résultats des cultures correspondant aux souches de Salmonelles et de Shigellose. Cette analyse révèle que, dans la zone d'étude, l'hôpital de district Est a été le plus fortement affecté par la présence de ces germes, affichant un taux de positivité de 28,0%. Ensuite, le CHU ME ainsi que les hôpitaux de district Centre, Nord et Sud ont enregistré des taux respectifs de 22,0%, 20%, 16,0% et 14%.

Il est notable que la valeur de la P-value était supérieure à 5%, suggérant qu'il n'existe pas de différence significative entre ces différents hôpitaux de district et le CHU ME en ce qui concerne la présence des souches de Salmonelles et de Shigellose.

3.4.6 Différentes espèces de Salmonella et Shigellaet leurs facteurs de risques d'infection à Ndjamena

Entre juillet 2022 et décembre 2022, une enquête de notre étude a permis de réaliser 830 cultures de selles et de sang, incluant 203 échantillons de sang et 600 échantillons de selles de routine. Parmi les 803 échantillons biologiques analysés, 39 se sont révélés positifs aux Salmonella spp et Shigella spp, avec 15 cas de Salmonella et 24 cas de Shigella, ce qui représente une prévalence globale de 4,85%. Les facteurs de risque identifiés pour ces infections comprennent la consommation d'eau de forage, d'aliments non cuits et le manque d'accès à des installations sanitaires adéquates.

En outre, il a été démontré que la propreté des services et du matériel joue un rôle crucial dans la prévention efficace des infections à Salmonella et Shigella. En examinant les selles, des agents parasitaires et fongiques, y compris des levures, ont été détectés. Parmi ces agents, des co-infections bactéries/parasites ont été relevées. Ces résultats ont été publiés dans le Journal of Biosciences and Medicine en 2023, dans le volume 11, pages 1 à 12 Lien vers la publication.

La Fréquence des espèces de salmonella et de shigella selon la nature de matériel biologique (selles et sang) est représentée sur la figure ci-dessous :

Sur les 803 échantillons ont été analysés (tout matériel biologique confondu) dont 600 sont des échantillons des selles, la coproculture a été utilisée pour l'isolement des germes, on a eu à isoler 34germes dont 26Shigella spp et 8Salmonella spp cas soit une prévalence de 3,23 % (34/1050) et 300 sont des échantillons des sangs, on a pu à isoler au total 14 germes dont 12Salmonella spp et 4 cas de Shigella spp, soit une prévalence de 5,33% (16/300).

Figure 21 :Frequence des bacteries isolés en fonction de la nature de l'echantillon biologique

Chapitre 2.Profil de résistance aux antibiotiques des Salmonella et Shigella isolés

Au cours de notre période d'étude, nous avons observé une augmentation significative de la résistance bactérienne, attribuable à une utilisation inappropriée des antibiotiques. Parmi les 1370 échantillons de selles et de sang analysés, nous avons isolé 50 souches de bactéries, toutes appartenant à la famille des Entérobactéries, avec 30 souches de Shigella et 20 souches de Salmonella. Ces souches ont présenté une résistance élevée de l'ordre de 85% aux antibiotiques de la classe des Bêta-lactamines, notamment l'ampicilline et l'amoxicilline.

2.1 Analyse de l'efficacité des antibiotiques face aux agents bactériens isolés

Le tableau XIII a été utilisé pour évaluer l'efficacité des antibiotiques sur les 50 souches de Salmonella et Shigella isolées dans les quatre hôpitaux de district et au CHU ME. L'étude a porté sur le test de 20 antibiotiques provenant de six familles différentes sur les 50 agents bactériens isolés, comprenant S. Typhi (Salmonella Typhi, 10 cas), S. para Typhi A (Salmonella Para Typhi A, 5 cas), S. para Typhi B (Salmonella Para Typhi B, 5 cas), Shigella Spp(10 cas), Shigella flexneri (6 cas), et S. dysenteriae 1 (Shigella dysenteriae1, 8 cas), ainsi que Shigella sonnei (6 cas). Les proportions de résistance (R) et de sensibilité (S) obtenues sont consignées dans le tableau (Le tableau XIII).

Tableau XIII :Analyse de l'efficacité des antibiotiques face aux agents bactériens isolés

	Antibiotique utilisé par pourcentage (%)
		AMP	AMC	CTX	SXT	IMI	CHL	CIP	Am	NA	CI	ATM	OFX	NOR	MA
*Shigella Spp*	S	21,42	42,14	67,85	39,28	100%	34,14	75	42,85	89,28	21,42	100	100%	10,0	80%
	R	78,57	57,85	32,14	60,71	0%	67,85	25	57,14	10,71	78,57	0	0%	90,00	20%
*Shigella flexneri*	S	54,54	34,14	34,14	55,9	70,5	54,54	93,7	18,18	21,42	72,72	93,7	70,5	33,33	93,7%
	R	45,45	67,85	67,85	44,1	29,5	45,45	6,3	81,81	78,57	27,27	6,3	29,5	66 ,6	6,3%
*Shigella dysenteriae 1*	S	18,18	18,18	34,14	34,14	80,3	39,28	80,3	70,5	90,9	55,9	75	42,85	100%	90,3%
	R	81,81	81,81	67,85	67,85	19,7	60,71	19,7	29,5	9,09	44,1	25	57,14	0%	09,7%
*Shigella sonnei*	S	39,28	54,54	21,42	30	54,54	54,54	70	21,42	63,63	81,5	81,5	75,80	66 ,6	70%
	R	60,71	45,45	78,57	70	45,45	45,45	30	78,57	36,36	18,5	18,5	14,2	33,33	30%
*Salmonella Para Typhi B*	S	19,28	34,14	40	45	21,42	18,18	100%	10,18	81,5	55,25	81,5	55,9	60%	100%
	R	80,71	67,85	60	55	78,57	81,81	0%	89,81	18,5	44,75	18,5	44,1	40%	0%
*Salmonella Para TyphiA*	S	10,18	63,63	100%	54,54	29,7	18,18	90,9	72,72	100	42,85	75	100%	100%	93,9%
	R	89,81	36,36	0%	45,45	61,3	81,81	9,09	27,27	0	57,14	25	0%	0%	6,09%
*Salmonella Typhi (10)*	S	9,1	39,28	100%	55,9	70,5	10,7	93,7	40	94,54	18,18	70,5	55,9	60%	93,7%
	R	81,9	60,71	0%	44,1	29,5	89,3	6,3	60	05,45	81,81	29,5	44,1	40%	6,3%

Legende :R = Résistance, S = Sensible (NCCLS, 2022), vis-à-vis de chaque antibiotique on a une zone de résistance (R) sensible (S) suivant : Ampicilline (AM):

R<11, S= 17 ; Amoxicilline + acide Clavulanique (AMC) : R< 14, S= 21 ; Oflaxine (OFX) : R< 15, S= 22 ; Ceftriaxone (CTX) : R< 15, S= 21 ; Chloramphénicol (C): R< 19, S= 23 ; Amikacine (Am) : R< 17, S= 19 ; Colistine (Cl) : R< 8, 8 = I= 11, S= 12 ; Triméthoprime Sulfamides (SXT) : R < 10, S = 19 ;Aztreonam (ATM) : R< 15, S= 22 , Acide Nalidixique (NA) : R< 15, S = 20,Imipenem (IMI) R<11, S= , Céfamadole (MA) : R< 15, 15 = I= 21, S= 22 ; 17,Norfloxacine (NOR) : R< 22, 22 = I= 25, S= 25 et Ciprofloxacine (Cip) : R< 15 ( CASFM,2022).

Le tableau XIII indique l'évaluation de l'efficacité des antibiotiques sur les agents bactériens isolés dans notre lieu d'etude. L'étude a concerné le test avec 14 antibiotiques issus de six familles différentes sur 50 agents bactériens isolés Salmonella Typhi (10), Salmonella Para Typhi A (5), Salmonella Para Typhi B (5), Shigella Spp (10), Shigella flexneri (6),Shigelladysenteriae (8), Shigella sonnei (6).

Le profil antimicrobien des espèces isolées de Salmonella et Shigella (N=50) a été évalué pour 14 antibiotiques à l'aide de la méthode de diffusion sur disque, conformément aux recommandations de l'antibiogramme. Les isolats de Salmonella et Shigella ont présenté des niveaux variables de résistance vis-à-vis des antimicrobiens testés.

Environ 37 % des isolats ont montré une sensibilité inférieure aux seuils de résistance standards pour l'ampicilline. La résistance la plus élevée a été observée contre l'ampicilline, avec 87 % des isolats résistants, suivie de la résistance à la Amikacine. En revanche, tous les isolats étaient sensibles à la ciprofloxacine et imipenem.

La résistance globale aux 14 antimicrobiens testés était plus élevée chez les isolats de Salmonella (33 %) par rapport à ceux de Shigella (30 %). L'ampicilline a enregistré le taux de résistance le plus élevé, atteignant 89 % pour les isolats de Salmonella et 80 % pour ceux de Shigella.

À l'opposé, la ciprofloxacine et Aztreonam ont montré la résistance la plus faible, tous les isolats étant sensibles à cet antibiotique. Les isolats de Shigella ont montré un faible taux de résistance à la Céfamadole etAztreonam (20%), tandis que les isolats de Salmonella n'ont présenté aucune résistance à l'acide nalidixique.

Enfin, en ce qui concerne les antibiotiques fréquemment prescrits, tels que le chloramphincole, et Amoxicilline + acide Clavulanique, la résistance était de 67 % pour les isolats de Shigella et de 60 % pour ceux de Salmonella.

D'une manière générale, les souches étudiées présentaient une bonne sensibilité aux Quinolones (Acide nalidixique) et Fluoroquinolones (Ciprofloxacine et Norfloxacine). Par contre 70, 9% des isolats étaient résistants à l'ampicilline et au Chloramphénicol,, 25,3% Aztreonam , 25,8% à laCéfamadole et Amikacine 25,4% . Les salmonella Para Typhi manifesté une grande résistance de l'ordre moyenne de 70% auxBêta-lactamines et aux autres classes des antibiotiques testés excepté le Céfamadole

Chapitre 3.Caractérisation moléculaire des agents bactériens identifiés

3.1 Caractérisation moléculaire des souches de salmonella isoléespar la Technique (GTG) -PCR

Toutes les PCR ont été répétées au moins deux fois afin de nous assurer de la fiabilité et de la reproductibilité de nos résultats.

La figure 21 : (A et B) nous montre les différents profils d'empreinte des souches de salmonellapar la Rep-PCR. Toutes les souches de salmonellaprésentaient un profil (GTG) 5-PCR. Les chiffres 1 à 20 montrent les empreintes génétiques des souches étudiées. La caractérisation moléculaire a confirmé que sur les 20 souches identifiées, 16 étaient positives à l'amorce universel GTG5 (5'-GTGGTGGTGGTGGTG-3') utilisée pour la détection de salmonella.

Légende : PB= paire de base, M= masse moléculaire, TN= témoin négatif, TP= témoin positif, 1 à 20 souches de salmonella analysées.

Chaque groupe des salmonella ont été réalisées comme marqueurs génétiques, dans le but de comparer les profils phylogénétiques et les liens de clonalité de nos souches entre elles.

Dans le génome bactérien, certaines séquences génétiques sont répétées à plusieurs endroits. Les amorces rep-PCR sont conçues pour amplifier les séquences autour des éléments répétitifs. Les mutations peuvent modifier la séquence du génome et la rep-PCR peut être utilisée comme outil de diagnostic.

En effet, alors que les modèles d'empreinte d'ADN rep-PCR sont considérés comme stables sur de nombreuses générations de microbes croissance Kang et al,2003. L'impression par PCR peut être utilisée pour étudier l'évolution du génome microbien Ishii et al,2009. La rep-PCR a permis d'étudier vingt souches de salmonella. L'électrophorèse des produits PCR nous a permis d'obtenir des informations sur les empreintes génétiques de chaque souche. Les profils révèlent des bandes caractéristiques des souches de référence utilisées dans cette étude SalmonellaATCC 13076 (quatre bandes caractéristiques à 200 pb, 300 pb, 500 pb et 1000 paire de base. Les différentes photos montrant les profils moléculaires représentatifs des différents sérotypes de Salmonella étudiés.

3.1 Comparaison des profils de l'arbre phylogénétique

L'arbre phylogénétique obtenu présente la relation entre les différentes souches étudiées grâce à leur profil génétique en comparaison avec la souche de référence SalmonellaATCC 13076.

La relation familiale des souches a étédéterminée par la ligne droite verticale à 96 % sur le dendrogramme. À travers le dendrogramme, on peut voir que la souche de référence SalmonellaATCC 13076est positionnée au même endroit que la souche S11. L'analyse de l'arbre phylogénétique montre qu'il existe une diversité entre les souches étudiées. Vingt souches ont ainsi été obtenus.

Figure 22: Dendrogramme basé sur des empreintes de (GTG)5-PCR sur les souches cliniques de Salmonella selon l'algorithme de l'UPGMA

4eme Partie : DISCUSSION

4 . DISCUSSION GENERALE

4.1 Nombre et origine des échantillons biologiques collectés et analysés

Caractéristiquesociodémographique

L'étude a été menée pour actualiser la connaissance sur l'épidemiologie et la caracterisationmoleculaire sur les souches de Salmonella et Shigellaresponsable des gastroenterites aigues chez les patients souffrants des diarrhées aigues dans les quatre hopitaux des districts dans la ville de N'Djamena au Tchad. Nous avons pu isoler cinquante (50) souches des enteropathogene : Salmonella et shigella à l'issue de cette étude, soit une prévalence de 3,64% (50/1370). Tous les enteropathogenes isolés telsquesSalmonella et shiegella peuvent, provoquer des maladies systémiques chez l'homme ayant un statut immunitaire faible, ce taux de prévalence observé dans cette étude met en exergue un problème de santé publique alarmant.Des resultats presque similaires ont été observés par Abba (2023) au Tchad, par Sylla (2020) au Mali et par Bessimbaye (2013) au tchadrespectivement 2%,1,8 et 2,90%.

Par ailleurs une légère différence entre nos résultats et celui de Tabo et al. (2015) (9,3%) a été observé. Cela pourrait s'expliquer par le fait que Tabo et al. (2015) avaient travaillé dans cinq (5) hôpitaux de la ville de N'Djamena au Tchad et notre étude a concerné que quatre hopitaux des districts et le Centre Hospitalier Universitaire de la Mere et de l'Enfant de N'Djamena.

Cependant, nos résultats sont inférieurs à ceux observés au Nigeria (53,33%) par Emmanuel et al. (2018), au Burkina (39%) Somda et al. (2017) et au Congo (20,3%) par Lunguya et al. (2012). Ces résultats pourraient s'expliquer par l'utilisation des eaux souterraines (Forage) par la population de N'Djamena (Tchad) et des eaux des barrages remplies des microorganismes à Ouagadougou (Burkina Faso).

Les échantillons de selles et du sang collectés dans les quatre hopitaux des districts et le CHU ME présentaient des aspects des sang (23, 35%) cas. La consistance des selles était liquide dans cas (26,56%), pâteuse (23,21%), molle cas (23,13%) et Moulée da (6,36%).Cela pourrait s'expliquer par le fait que la consistance des selles (liquide) attestent d'une hémolyse et d'une perte d'eau susceptible d'exposer les malades à l'anémie sevère, à la perte des electrolytes et à la déshydratation pouvant les conduire à la mort. Aussi les aspects sanguinolents des selles seraientt les indicateurs des infections dues à la shigelose à Shigella dysenteriae1.

Les différents aspects et consistance des selles ont été respectivement rapportés par Dao etal. (2007) à Bamako (Mali) : les aspects glaireux dans 14 cas (18,4 %), la consistance des selles liquides dans 40 cas (52,6 %), et la consistance polymorphe dans8 cas (10,5 %).

Le taux des selles liquides a été rapporté en hausse par Reitheret al. (2007) dans 75,3 % au Ghana. La cause de ces diarrhées liquides sont nombreuses : inflammation de l'intestin grêle, du colon, par les bactéries, les parasites, les virus, l'usage chronique de l'alcool pourrait endommager la muqueuse intestinale exposant la personne aux maladies diarrhéiques, l'utilisation abusive des antibiotiques qui détruirait la flore normale de l'intestin et enfin l'ingestion des aliments mal cuits ou souillés par les microorganismes pathogènes.

La forte prévalence de ces infections diarrhéiques serait liée aux conditions de vie précaires des populations dans les pays en développement. Le Fonds des Nations Unies pour l'enfance (UNICEF) en 2007 à aussi rapporté qu'environ 5000 enfants meurent chaque jour des diverses maladies et 1,5 millions mourraient des maladies associées aux mauvaises conditions de vie et manque d'hygiène sanitaire chaque année. Cela pourrait s'expliquer par la vulnérabilité due à la faiblesse de l'immunité de ce groupe vis-à-vis des maladies diarrhéiques.

Sur les 50 agents bactériens isolés, (28,32%) provenaient des selles d'enfants de 0 à 5 ans. De tel taux a été également rapporté par Sanouet al. (1999) au Burkina Faso. Plusieurs auteurs ont expliqué ce taux de prévalence de diarrhées des enfants de 0 à 5 ans par une instauration progressive de l'immunité chez les enfants de 0 à 1 an, la malnutrition ou la contamination au niveau de leur alimentation dans le ménage et le comportement hygiénique des parents. La persistance de ces maladies diarrhéiques à entéropathogènes et le manquement aux règles d'hygiène à tous les niveaux de la vie des populations et spécialement à la mauvaise alimentation sur le plan qualité a été rapportée par Barro etal. (2005) au Burkina Faso. En effet plusieurs études réalisées sur les aliments de rue très consommées ont révélé que ceux-ci sont souvent contaminés par des entéropathogènes (Barro et al., 2002 ; Barro et Traore 2008). L'environnement dans lequel la vie quotidienne se mène se trouve être le grand réservoir de pathogènes en cohabitation.

La fréquence de 24% des agents bactériens obtenus à N'Djamena montre que ceux-ci peuvent être considérés comme un problème de santé publique pour la population Tchadienne. Cela montrerait que les agents bactériens demeurent la principale cause de diarrhées mortelles dans les pays en développement. On a estimé que la diarrhée a tué 2,2 millions de personnes en 1998, dont la plupart était âgée de moins de 5 ans (OMS, 2000).

Facteurs de risque associés à l'infection par les sérotypes des agents bactériens isolés

D'une manière générale les espèces du genre Salmonella et Les Shigella ont été les plus retrouvées dans notre étude. Cela pourrait s'expliquer par l'utilisation des eaux non potables. La fréquence relativement élevée des Salmonella a été également rapporté par Cardinale etal. (2005) dans 43% des cas. Cette fréquence montre que les diarrhées à Salmonella sont très fréquentes dans les pays en développement et seraient liées à la promiscuité avec certains animaux dans des mauvaises conditions d'hygiène individuelles collectives et alimentaires (Barro etal, 2002 ; Dupeyron, 1997). Les Shigella ont été isolés à un taux de 60 % des cas dans notre étude à Ouagadougou mais Sanouetal, 1999 ont rapporté un taux élevé de 42 % au Burkina Faso.

La répartition des agents bactériens dans notre etude selon le sexe observé, Il ressort de ce résultat qu'aucune différence significative entre le sexe et le résultat total avec la P-value de 0,122. Ce résultat montre tout de même que le sexe féminin était plus positif à la culture par rapport au sexe masculin avec respectivement un taux de 66,1% et 53,2%. On note cependant une légère augmentation du taux d'infection chez les femmes par rapport aux hommes. La prévalence relativement élevée chez les femmes pourrait s'expliquer par l'inobservation des règles élémentaires d'hygiène liées à leur taux de non scolarisation élevé (89 %) selon Podaetal (2003) à Ouagadougou.

Pendant notre etude,nous avons observé une prévalence élevée des cas de diarrhées et agents bactériens des mois d'Août, Septembre et Octobre lors de l'enquête sur les maladies diarrhéiques. Cela pourrait s'expliquer par le faite que les déchéts déversés par ces fleuves sont les sources bien connues des maladies diarrhéiques et d'autres complications sanitaires de la population riveraine et voire générale du Tchad. L'infiltration étant importante et la montée de la nappe phréatique pendant la période de la saison des pluies pouvant provoquées des contaminations de certaines eaux souterraines de pompes et des puits de consommation courantes dans les périphéries de N'Djamena et des villages seraient également la cause principale des maladies diarrhéiques au Tchad et même partout en Afrique.

. Les caractéristiques individuelles des ménages, le niveau de scolarisation de la mère, la nature de sites urbains et la source d'approvisionnement en eau ont été également indexés comme facteurs des risques des maladies diarrhéiques à Yaoundé au Cameroun par Yongsiet al (2008).

La distribution des souches de Salmonella et Shigelladans cette étude comprenait S. typhi, s.par typhi A et B, de meme que shigella dysenteria, shigella flexina. La forte prévalence de ces microorganismes parmi les isolats révèle que ces agents pathogènes constituent toujours la cause principale des gastro-entérites dans le pays. Alioet al. (2017) au Mali ont montré qu'en Afrique les sérotypes majeurs de Salmonella retrouvés chez l'homme sont S. typhimurium suivi de S. enteritidis et S. typhi. Quant à Vandenberg et al. (2010) (22%) ont montré qu'au Congo sur les Salmonella non typhoïdiques isolées à partir d'hémocultures d'enfants dans un hôpital de district rural.

Par ailleurs, depuis 2004, le sérotype S. Enteritidis a repris la 1^ère place des sérotypes responsables des salmonelloses humaines en France (Weill et al., 2016 ; Weill et al., 2020). Ce changement de situation pourraitêtre expliqué par le niveau d'hygiène acceptable des pays développés comme la France.

Cette faible prévalence pourrait aussi s'expliquer du fait que dans certains pays en développement, les campagnes de sensibilisation sur les règles de bonne pratique d'hygiène au cours des dernières années se sont considérablement améliorées. Ces améliorations ont par conséquent réduit le taux de décès global dû aux maladies diarrhéiques bactériennes (Sarantuya et al., 2004). Il serait important de continuer d'observer les mesures barrières et d'hygiènes des mains et environnementales.

Il est donc important et urgent de mener des études sur la qualité de l'eau de boisson et mener des compagnes de sensibilisation sur la technique de forage et leur traitement afin d'éviter la prolifération des souches pathogènes dans les eaux de boisson qui seraient un problème de santé publique. Pour mieux comprendre les mécanismes pathogéniques des souches deSalmonella et Shigella responsables de gastroentérites, en plus des facteurs de virulence, l'étude de la sensibilité aux antibiotiques a été également réalisée à travers les méthodes phénotypiques.

4.2 Profil de résistance aux antibiotiques des Salmonella et Shigella isolés

La résistance des bactéries, particulièrement les entérobactéries aux antibiotiques constitue un véritable problème de santé publique. Cette résistance affecte aussi bien les pays développés que les pays en développement où cohabitent l'automédication et la vente anarchique des médicaments en dehors des structures légales (Aminov, 2010). Dans les pays en voie de développement, les gastro-entérites sont endémiques et constituent un problème majeur de santé publique, particulièrement chez les enfants de 0 à 5 ans (Dembélé et al., 2016). Les antibiotiques de première intention pour leur traitement sont les phénicolés (chloramphénicol), les â-lactamines (amoxicillines, ceftriaxones) et les sulfamides (sulfamétaxazole-triméthoprime) (Aubry et Güzère, 2015). Ces dernières années, en particulier dans les zones tropicales l'incidence desalmonella et shigella multi-résistantes aux antibiotiques a vite augmenté. Les â-lactamines (les aminopénicillines, les céphalosporines, les monobactam et les carbapénèmes) constituent la famille des antibiotiques les plus utilisées (Ouédraogo et al., 2017). La mauvaise utilisation de ces antibiotiques a rapidement conduit à la croissance de la résistance accrue de ces antibiotiques.

L'étude de la sensibilité des agents bactériens aux antibiotiques a impliqué l'évaluation de l'efficacité de différentes familles d'antibiotiques, notamment les bêta-lactamines (comme l'ampicilline et la ceftriaxone), le chloramphénicol, les cyclines (tels que la doxycycline), les sulfamides (comme le cotrimoxazole) et les fluoroquinolones (telles que la ciprofloxacine). Cette évaluation a été menée de manière rigoureuse, conformément aux protocoles établis par Quilici et ses collaborateurs en 2010 ainsi que par le Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie en 2022.

Cette étude a contribué en fournissant des données sur l'antibiorésistance des isolats de Salmonella et Shigella provenant des quatre hôpitaux de district de N'Djamena. La proportion de souches de Salmonella résistantes s'élevait à 66,66%. Ces résultats sont en accord avec ceux de l'étude menée par Dembélé et ses collègues en 2020 au Burkina Faso, qui ont également constaté un taux de résistance dépassant 50%.

La majorité des souches isolées dans notre étude ont démontré une résistance aux bêta-lactamines (ampicilline, amoxicilline) à un taux d'environ 75%.

Ces résistances pourraient apparaitre naturellement dans le temps, généralement à la suite de modifications génétiques. Toutefois la prescription ou l'usage démesuré de ces antibiotiques ainsi que le non-respect des délais de traitement pourraient être la cause de l'accélération de ce processus de résistance. Ces résistances pourraient également être justifiées par le phénomène de l'automédication.

Mais une tres bonne sensibilité a été observé chez le famille de quinolone élevée à (82%) pour le ciprofloxacine et (80%) pour acide nalidixique. Ces résultats montrent que les quinolones restent toujours de très bonne alternative pour le traitement des maladies diarrhéiques dues aux salmonella et shigella. Selon les directives de l'Organisation Mondiale de la Santé, la ciprofloxacine est un antibiotique de choix pour tous les patients présentant une diarrhée aigue (Yang et al., 2013).

Des travaux anterieur au Burkina Faso ont été faite par Ouedrago et al en 2021ont trouvé les isolats de Salmonella spp. ont montré des taux de résistance allant de 00 % (à l'imipénème et à l'acide nalidixique) à 100 % (à l'amoxicilline + acide clavulanique et à la colistine) pour les isolats cliniques et de 00 % (à l'imipénème) à 100 % (ciprofloxacine amoxique) pour les isolats environnementaux.

De telles résistances observées seraient dues à la production d'une pénicillinase associée à une céphalosnase ou une â-lactamases à spectre élargi capable de résister à tous les antibiotiques de la famille de â-lactamine à l'exception de l'imipénème (Zeba et al., 2007, Duval, 1999, Haukkak, 2007, Carvallo, 2004).

En effet, les salmonella et shiegella sont sensibles à l'Imipénème, ce qui justifie sa place en premier choix dans le traitement des infections sévères à bactéries multirésistantes.

Cette hausse de la résistance aux antibiotiques pourrait être attribuée à divers facteurs tels que l'automédication, l'utilisation d'antibiotiques en agriculture et en élevage, ainsi que des pratiques de prescription inadéquates et la circulation des medicaments de mauvaise qualités.

La résistance croisée a également été observée dans cette classe d'antibiotiques, touchant des souches des genres Shigella, Salmonellaet Escherichia, qui sont naturellement peu sensibles. Cette résistance, lorsqu'elle se manifeste, est généralement associée à la production de bêta-lactamases telles que les pénicillinases, les céphalosporinases et les carbapénémases par les souches concernées, comme indiqué dans plusieurs études (Zeba et al., 2007 ; Duval, 1999 ; Haukka et Siitonen, 2007 ; Cavallo, 2004). De plus, en France, Courvalin et Philippon (1989) ont démontré que le transfert des plasmides contenant ces déterminants est un mécanisme clé dans la propagation de la résistance aux antibiotiques.

Ces travaux antérieurs apportent un soutien supplémentaire à notre étude, en particulier en ce qui concerne les tests de sensibilité aux antibiotiques. Cela renforce la fiabilité et la pertinence de nos résultats dans le contexte plus large de la recherche sur la sensibilité des agents bactériens aux médicaments antimicrobiens.

En effet au Tchad, deux raisons peuvent expliquer le taux de résistance de E. coli à la ciprofloxacine : la première raison est que la prescription de l'antibiotique par le clinicien se fait avant toute analyse au laboratoire. Les antibiotiques sont prescrits de façon empirique. La seconde raison est la large utilisation des antibiotiques de la rue due à la pauvreté et à l'ignorance. La plupart des médicaments sont vendus par des personnes non qualifiées.

Donc une nouvelle attitude thérapeutique devra être adoptée dans les années à venir pour réduire l'inefficacité de cet antibiotique.

4.3 Caractérisation moléculaire des agents bactériens identifiés

Les profils génotypiques générés par les différentes méthodes de typage moléculaire des souches bactériennes constituent un outil épidémiologique important pour la détermination de potentielles sources d'infections. De plus, la distribution des souches typiques de Salmonella circulant parmi les différentes espèces offre une information précieuse pour la compréhension épidémiologique de la dissémination des génotypes particuliers (tabo et al.,2013).

Sur les vingt souches de Salmonella que nous avons identifiées, seules seize se sont avérées positives à la PCR.Dans l'ensemble, les empreintes génétiques des souches examinées différaient de celles décrites par Khare et al. pour les souches de salmonella, qui présentaient un nombre de bandes variant de 15 à 24Khare et al.,2020. Cette disparité peut être attribuée à des variations dans les conditions environnementales ainsi qu'à l'évolution génétique des souches Shauf et al .,2017 , Labrador et al.,2020.

Toutes les souches de salmonella présentaient un profil (GTG) 5-PCR. Les chiffres 1 à 24 montrent les empreintes génétiques des souches étudiées.Une minorité de souches présente deux bandes caractéristiques, représentant 3,77 % de l'échantillon.

L'arbre phylogénétique obtenu présente le lien de parenté entre les différentes souches étudiées grâce à leur profil d'empreinte génétique en comparaison avec la souche de référence ATCC 13076. La relation familiale des souches est déterminée par la ligne droite verticale à 96% sur le dendrogramme. A travers le dendrogramme, on observe que la souche de référence Salmonella ATCC13076 est située au même endroit que la souche salmonella S11. L'analyse de l'arbre phylogénétique montre qu'il y a diversité entre les souches étudiées. Ainsi quinze (15) groupesontétéobtenus.G1 (S2), G2 (S1,S5), G3 (S4,S3), G4 (S8), G5 (S10), G6 (S7, S9), G7 ( S21,ATCC 13076), G8 (S11), G9 (S6), G10 (S13, S12), G11 (S14,S15) G12 (S18) G13 (S20,S17), G14 (S19) G15 (S24,S22,S26,S25,S23).

Cela montre une faible relation phylogénétique entre les souches étudiées (taux de similitude inférieur à 96% figure 18)Khare et al.,(2020) et Mohapatra et al., (2008) avaient utilisé la même méthode pour regrouper les souches de Salmonella. Selon l'analyse moléculaire basé sur l'arbre phylogénique de l'empreinte digitale des souches, nous observons que les souches de groupe G15 (S24, S22,S26, S25, S23) isolées des sangs des patients pourraient être également la cause des infections à Salmonella en raison de leur affiliation à des souches responsables de patholagies entérites (figure : 22).

Cependant, les souches appartenant au groupe G15 (S22, S26)isolées du sangsont uniques par rapport aux autres elles pourraient également être à l'origine d'infections gastroenterite en raison de leur affiliation à des souches responsables de pathologies gastroentérite. Les souches de certains groupes ne sont que des entéropathogènes selon leur affiliation (figure 22). En effet certains auteurs avaient utilisé la méthode GTG5 pour séparer les Salmonella responsables de pathologies humaines et animales (Khare et al., 2020 ; Dombek et al., 2000 ;Farmer,etal., 2016). D'ou, les souches de certains groupes G1, G2, G3, G4,G5, G6, G7, G8, G9, G11, G12, G14, et G10 ne sont des gastroenteropathogènes que selon leur affiliation .

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

. Les risques sanitaires auxquels sont exposées les populations sont divers et nombreux, résultant principalement de facteurs sociaux et environnementaux. L'incidence des maladies diarrhéiques est étroitement liée aux comportements individuels, tels que la gestion des déchets domestiques et l'hygiène des matières fécales, ainsi qu'aux pratiques collectives, telles que l'élimination des déchets solides et liquides au niveau communautaireCannaux des eaux, il y a des menages qui conduisent les fècès dans les conduits

Une des principales sources de contamination identifiées est l'approvisionnement en eau, notamment à travers les points d'eau traditionnels tels que les puits et les forages. L'étude a révélé une prévalence de Salmonella et Shigella de 3,64%. De plus, elle a permis d'évaluer la sensibilité aux antibiotiques et d'identifier les souches isolées à partir d'échantillons pathologiques.

Certaines souches ont montré une résistance significative aux antibiotiques de la famille des bêta-lactamines, représentant environ 75% des cas au Tchad. En revanche, une sensibilité élevée aux antibiotiques de la famille des quinolones, tels que la ciprofloxacine, la norfloxacine et l'acide nalidixique, a été observée chez 80% des souches.

Il est clair que l'utilisation anarchique d'antibiotiques à large spectre, tant dans le domaine de la médecine humaine que dans celui de l'élevage, est la principale cause de ces résistances. La technique moléculaire a permis une identification précise des souches étudiées et leur regroupement en sous-groupes présentant des caractéristiques communes.

PERSPECTIVES

ü Etendre la recherche des souches de Salmonella et Shigelladans les autres provinces du Tchad afin de comparer les taux d'infestations.

ü Rechercher à l'aide de la biologie moléculaire les supports génétiques codant les gènes de résistances aux â-lactamines, aux aminosides, fluoroquinolones, quinolones, sulfamides.

ü Effectuer le séquençage des souches qui hébergent les supports génétiques de résistance afin de mieux expliquer les mécanismes génétiques de résistance aux antibiotiques chez les Salmonella et Shigella.

A. Andino, & I. Hanning. (2015). Salmonella enterica?: Survival, Colonization, and Virulence Differences among Serovars. https://doi.org/10.1155/2015/520179

Aninov RI. (2010). brief of the antibiotic era: lessons learned and chllenges for the future. Frontiers in Microbiology1: 134p.

Akpakpo, B., Souley, H., Ouattara, A., Bonou-Zin, F., Bouzoua, N. D., Ali, A. O., Shepherd,S., & Tidjani, P. A. (s. d.). Le Diagnostic par Biologie Moléculaire Qualitative peut améliorer la Prise en Charge des Enfants Malnutris Aigus Sévères souffrant de Diarrhées?: Cas de L'UNT de Hôpital de l'Amitié Tchad-Chine, N'djaména, Tchad.

Ali, H. M., Hien, Y. E., Zongo, C., Erbi, D., Hissein, A. H., Tapsoba, F., Tahir, A. M., Ahamt, B. A., Traore, Y., & Savadogo, A. (2021). Surgical Site Infection (SSI) in the National Referral General Hospital of Ndjamena (Chad)?: Survey about Risk Factors. Journal of Biosciences and Medicines, 9(5), Article 5. https://doi.org/10.4236/jbm.2021.95001

Alio SA, Samna SO, Maârouhi IM, Diallo BA, Bakasso Y. 2017. Prévalence et Diversité de Salmonella En Afrique : Analyse Qualitative et Quantitative. European Scientific Journal, ESJ., 13(30): 1857-7881. DOI: https://doi.org/10.19044/esj.2017.v13n30 p250

Ateudjieu, J., Bita'a, L. B., Guenou, E., Chebe, A. N., Chukuwchindun, B. A., Goura, A. P.& Bisseck, A.-C. Z.-K. (2018). Profil et antibiosensibilité des bactéries pathogènes associées aux diarrhées chez les patients consultant à l'Hôpital Régional Annexe de Kousseri, Extrême-Nord Cameroun. The Pan African Medical Journal, 29, 170. https://doi.org/10.11604/pamj.2018.29.170.14296

Avril L., Dabernat H., Denis F., Monteil H., 1988. Bactériologie clinique, 1ére édition Paris. P 126-128.

BESSIMBAYE, N., Adelsalam, T., Khadidjia, G., Brahim, B. O., Guelmbaye, N., Lassana, S., Nicolas, B., & Alfred, A. T. (2013). Gastro-entérites en milieux des réfugiés au Tchad. April 2013, Int. J. Biol. Chem. Sci. 7(2): 468-478, April 2013(Int. J. Biol. Chem. Sci. 7(2): 468-478, April 2013), 468?478. https://doi.org/DOI : http://dx.doi.org/10.4314/ijbcs.v7i2.5

Bessimbaye Nadlaou, Djimadoum Mbanga, Issakou Bakarnga-Via, Claude Oualé, Nicolas Barro, Abdelsalam Tidjani, & Choua Ouchemi. (2021). Biochemical profile and resistance phenotype of bacteria isolated from the operating site departments of the National Reference University Hospital of N'Djamena. World Journal of Advanced Research and Reviews, 10(1), 381?396. https://doi.org/10.30574/wjarr.2021.10.1.0189

Begum F, Adachi Y & Khan MSR (2008). Characterization of Salmonella serovars in comparison with some Enterobacteria by sds-page analysis., Bangl. J. Vet. Med. 6 (2) : 169-174.

Betancor L, Schelotto F, Martinez A, Pereira M, Algorta G, Rodriguez MA, Vignoli F & ChabalgoityA (2004). Random Amplified polymorphic DNA and phenotyping analysis of Salmonella e n t e r i c a serovar Enteritidis isolates collected f r o m humans and poultry in uruguay from 1995-2002. J. Clin. Microbiol., 42: 1155-1162.

Borrego JJ, Castro D, Jimencz-Notario M, Luque A, Martinez-Manzanares E, Rodriguez- Avial C, Picazo (1992). Comparison of epidemiological markers of Salmonella strains isolated from different sources in Spain, J.Clin. Microbiol. 30, 3058-3064.

Bimet F, Coutelet O.; Dalou L, Hauwaert Th, Marchel N, Yanard Me J, Podesta Jm, Milovanovic A, Stenger Ch, Maget M.2000. Le Biotechnologiste International. ASSITEB. 25: 10-16.

Bonnet, Emmanuelle., Fillol, A., Nikiema, A., Lechat, L., Tall, M., Da, S. C., & Ridde, V. (2018). Evaluation of social inequalites in health of road accident victims in Ouagadougou, Burkina Faso. Sante Publique, HS, 131-137.

Brisabois A., Lafarge V., Brouillaud A., M.-L. de Buyser, Collette C, Garin-Bastuji B. &Thorel M.-F., 2016. Les germes pathogènes dans le lait et les produits laitiers : situation en France et en Europe. Rev.sci.tech.Off. int. Epiz., 16 (1) ,452-471

Bruyère F, Cariou G, Boiteux JP, Hoznek A, Mignard JP, Bernard L, Sotto A, et al. (2008). Progrès en Urologie. Elsevier Masson.18 (1) : 5-6.

Canada, A. mondiales. (2017, février 21). La diarrhée dans les pays en développement. AMC. https://www.international.gc.ca/world-monde/issues_development-enjeux_developpement/global_health-sante_mondiale/diarrhea-diarrhee.aspx?lang=fra

Cazanave--2017--Gestion de la pénurie de pénicilline retard inject.pdf. (s. d.). Consulté 22 mars 2024, à l'adresse https://www.infectiologie.com/UserFiles/File/reunion/2018-prep-ist/2018-prep-ist-cazanave.pdf

Cattoir V. 2004. Pompes d'efflux et résistance aux antibiotiques chez les bactéries. Pathol. Biol. 52: 607-616.

Charles, N., & Jean-Louis, V. (2007). Bactériologie médicale. In Bactériologie médicale (2eme Edition, p. 272).

Chiu CH, Su LH, Chu C, Chia JH, Wu TL, Lin TY, Lee YS & Ou JT (2004). Isolation of Salmonella enterica serotype Choleraesuis resistant to ceftriaxone and ciprofloxacin. Lancet 363: 1285-1286.

Courvalin P.2007. La Résistance des Bactéries aux antibiotiques : Combinaisons de mécanismes Biochimiques et Génétiques. Bull. Acad. Vét. 161: 12 p.

Crump J.A., Luby S.P. and Mintz,2004. The global burden of typhoid fever. Bull Engl J Med 347: 555-560.

Dauga C, Zabrovskaia A & Grimont PAD (1998). Restriction fragment length polymorphism analysis of some flagellin genes of Salmonella enterica. J. Clin. Microbiol., 36 : 2835-2843

Dao, S., Oumar, A. A., Dembele, J. P., Noutache, J. L., Fongoro, S., Maiga, I., & Bougoudogo, F. (2007). [Clinical and bacteriological profiles of the urinary infections associated the VIH/AIDS in hospital area of Bamako, Mali]. Le Mali medical, 22(1), 10-13.

Deguenon, D., , Victorien, D., Evelyne, L., Nana, N. M., Jerrold, A., Roula, M. A., Lamine, B., & Jacques, D. (2019, juin 7). Déterminants de la résistance et de la virulence des espèces fécales de Salmonella spp. Isolées d'animaux de boucherie au Bénin | Notes de recherche BMC. https://link.springer.com/article/10.1186/s13104-019-4341-x

Dekker, J., & Frank, K. (2015). Salmonella, Shigella, and Yersinia. Clinics in laboratorymedicine, 35(2), 225?246. https://doi.org/10.1016/j.cll.2015.02.002

Delarras, C. (2014). Pratique en microbiologie de laboratoire?: Recherche de bactéries et de levures-moisissures. Lavoisier-Tec & Doc.

Delmas, M.-C., & Fuhrman, C. (2010). Asthma in France?: A review of descriptive epidemiological data. Revue des maladies respiratoires, 27, 151?159. https://doi.org/10.1016/j.rmr.2009.09.001

Dembélé, R., Konaté, A., Traoré, O., Kaboré, W. A. D., Soulama, I., Kagambèga, A., Traoré, A. S., Guessennd, N. K., Aidara-Kane, A., Gassama-Sow, A., & Barro, N. (2020). Extended spectrum beta-lactamase and fluoroquinolone resistance genes among Escherichia coli and Salmonella isolates from children with diarrhea, Burkina Faso. BMC Pediatrics, 20(1), 459. https://doi.org/10.1186/s12887-020-02342-z

Dembélé R, Bonkougou IJO, Konaté A, Bsadjo Tchamba G, Ibrahim Bawa H, Bako E et al. (2015). Serotyping and antibiotic resistance of enteropathogenic Escherichia coli and E. coli 0157 isoled from diarrheae children in rural aera of Burkina Faso. Afr J Microbiol Res.9 :1053-1059.

Diagnostic au laboratoire des bacteriémie, hemoculture. (2023). Diagnostic au laboratoire des bactériémies?: L'hémoculture. https://microbiologiemedicale.fr/diagnostic-laboratoire-bacteriemies-hemoculture/

Djim-adjim TABO., Colette D., Sophie A. G., Frédérique M., Anne B., Rachid E., Yves M., 2013.Prevalence and antimicrobial resistance of non-typhoidal Salmonella serotypes isolated from laying hens and broiler chicken farms in N'Djamena, Chad. Veterinary Microbiology, 166: 293-298.

Dumas J., 1958. Tribut des Salmonella, Bactériologie Médicale. Flammarion 8. 399-433. FAO, 2007. Les bonnes pratiques d'hygiène dans la préparation et la vente des aliments de rue en Afrique. Outils pour la formation, ISBN 92-5-205583-5, 188P.

Dupeyron C.1997. Les diarrhées aiguës bactériennes : causes et mécanismes. Dévelop. Santé.128 : 1-9.

El_Hassan_K_2011_Quality_of_College_Life_QCL_Validation_of_a_measure_of_student_wellbeing_in_the_Middle_East_International_Journal_of_Educational_and_Psychological_Measurement_81_12-22 Consulté 22 mars 2024, à l'adresse https://www.researchgate.net/publication/262932109

Dureja C, Mahajan S, Raychaudhuri S, 2014. Phylogenetic distribution and prevalence of genes encoding class I integrons and CTX-M-15 extended-spectrum b-lactamases in Escherichia coli isolates from healthy humans in Chandigarh, India. PloS ONE 9:1-6

EFSA Journal, 2011. EU summary report on trends and sources of zoonoses and zoonotic agents and food-borne outbreaks, 2009. 9(3): 2090p.

Fall-Niang NK, Sire JM, Tall A, Samb B, Breurec S, Ndour MM, Faye N, Garin B, GassamaSow A, 2013. Etiologie des diarrhées aigües infantiles et antibiorésistance des bactéries entéropathogènes à Dakar. Dakar Med. 58:1-10.

Fresney, C. D. (2007). [When research becomes the axis of a care project in anestablishment]. Soins; la revue de reference infirmiere, 718, 35?37.

Gassama-Sow A, Aïdara-Kane A, Barraud O, Gatet M, Denis F, Ploy MC, 2010. High prevalence of trimethoprim-resistance cassettes in class 1 and 2 integrons in Senegalese Shigella spp. isolates. J. Infect. Dev. Ctries. 4:207-212.

Gledel J., Corbion B., 1991. Le genre Salmonella dans le contrôle Microbiologique, 2ème édition Paris. 480 p

Grimont P., Bouvet M., 2000.Salmonella, Précis de Bactériologie clinique. Paris : Editions ESKA. P.l 137-1156.

Guide pratique des bactéries pathogènes--Edition 2017--SOMIPEV. (s. d.). Consulté 22 mars 2024, à l'adresse https://somipev.ma/fr/guidelines/guide-pratique-des-bact%C3%A9ries-pathog%C3%A8nes-edition-2017.html

Hamadou, A., Ban-bo Bebanto, A., Edith, M. N., Jean, B. O., Kadidja, G., Abdoulaye, K. T., NADLOU, B. N., Abdelsalam, A. D., & Nicolas, B. (2023). Prévalence et caractérisation des sérotypes de Salmonella isolées au CHU la Référence Nationale de N'Djaména au Tchad. Published: 31-10-2023, Vol. 17 No. 7 (2023)(9134-IJBCS), : 2215-2224. https://doi.org/DOI: https://dx.doi.org/10.4314/ijbcs.v17i6.7

Hart T, Shears P. Atlas de Poche de Microbiologie, Flammarion Medecine-Sciences, 1997: Atlas de Poche de Microbiologie: Bukupedia; 1997.

Humbert F., Sautra L., Federighi M., Jouve J., 1998. Les Salmonelles, Am. J. Vet. Res. 38, 2019-2022

INSEED, 2014. Deuxième Recensement Général de la Population et de l'Habitat 2009. Analyse thématique des résultats définitifs. Projections démographiques régionales 2009- 2050, tome 2 : Niveau régional, 90p.

Ishii S, Sadowsky MJ. Applications of the rep-PCR DNA fngerprinting technique to studymicrobial diversity, ecology and evolution: minireview. Environ Microbiol. 2009;11(4):733-40. https://doi.org/10.1111/j. 1462-2920.2008.01856.

Jabrane, B., & Abdelkhalek, C. (2014, octobre). Comparative Numerical Simulation of Natural Convection in a Porous Horizontal Cylindrical Annulus | Scientific.Net. https://doi.org/10.4028/www.scientific.net/AMM.670-671.613

Jajere, S. M. (2019). A review of Salmonella enterica with particular focus on the pathogenicity and virulence factors, host specificity and antimicrobial resistance including multidrug resistance. Veterinary World, 12(4), 504?521. https://doi.org/10.14202/vetworld.2019.504-521

Kaboré, B., Ganamé, A. O., Hama, C., Henri, S. O., Emmanuel, S., Koudbi, J. Z., Boukaré, Z., Yves, T., Olivier, G., Idrissa, S., & Aly, S. (2022). (GTG)5-PCR fngerprinting of multi-drug resistant Escherichia coli bacteria isolates from hospital in Ouagadougou, Burkina Faso. BMC Microbiology, (2022) 22:118, (2022) 22:118. https://doi.org/at https://doi. org/10.1186/s12866-022-02537-7

Kang HP, Dunne WM. Stability of repetitive-sequence PCR patterns with respect to culture age and subculture frequency. J Clin Microbiol. 2003;41(6):2694-6. https://doi.org/10.1128/JCM.41.6.2694-2696.2003 .

Khare N, Kaushik M, Martin JP, Mohanty A and Gulati P. Genotypic diversity in multi-drug-resistant Escherichia coli isolated from animal feces and Yamuna River water, India, using rep-PCR fngerprinting. Environ Monit Assess. 2020;192(11). https://doi.org/10.1007/s10661-020-08635-

Labrador KL, Nacario MAG, Malajacan GT, Abello JJM, Galarion LH, Rens - ing C, Rivera WL. Selecting rep-PCR markers to source track fecal contami - nation in Laguna Lake, Philippines. J Water Health. 2020:19-29. https:// doi.org/10.2166/wh.2019.042 .

Laine F. 2020. Salmonelles et toxi-infections alimentaires : épidémiologie et prévention, Thèse, UGA UFRP - Université Grenoble Alpes - UFR Pharmacie, 93.dumas-03028429, HAL Id: dumas-03028429.

Laurent, G., & Moez, S. (2023). Un guide pour la caractérisation des risques microbiologiques | Request PDF. In In book?: Évaluation des risques microbiologiques (pp.185-210 (p. (pages?: 185-210)). Domaine de l'Encyclopédie SCIENCES?: Agronomie et science des aliments. https://www.researchgate.net/publication/370013979_Un_guide_pour_la_caracterisation_des_risques_microbiologiques

Le Hello, S., Hendriksen, R. S., Doublet, B., Fisher, I., Nielsen, E. M., Whichard, J. M., Bouchrif, B., Fashae, K., Granier, S. A., Jourdan-Da Silva, N., Cloeckaert, A., Threlfall, E. J., Angulo, F. J., Aarestrup, F. M., Wain, J., & Weill, F.-X. (2011). International Spread of an Epidemic Population of Salmonella enterica Serotype Kentucky ST198 Resistant to Ciprofloxacin. The Journal of Infectious Diseases, 204(5), 675?684. https://doi.org/10.1093/infdis/jir409

Lindstedt BA, Heir H, Gjernes E (2003). DNA fingerprinting of Salmonella enterica subsp enterica serovar Typhimurium with emphasis on phage type DT104 based on variable number of tandem loci. J Clin Microbiol. 4, 1469-1479.

Li, L., Rathnayake, K., Walter, S., Fullick, M., Shetty, A., Hudson, P., Lander, H., &Westbrook, J. I. (2024). Blood Culture Ordering After Sepsis Alerts and Subsequent Patient Outcomes?: An Electronic Health Record-Based Study. Studies in Health Technology and Informatics, 310, 314?318. https://doi.org/10.3233/SHTI230978

Lozniewskia A, Rabaud. 2010. Résistance bactérienne aux atibiotiques, Nancy, 4p.

Lunguya O, Lejon V, Phoba MF, Bertrand S, Vanhoof R, Verhaegen J, Smith AM, Keddy KH, Muyembe-Tamfum J, Jacobs J. 2012. Salmonella typhi in the Democratic Republic of the Congo: Fluoroquinolone Decreased Susceptibility on the Rise. PLoSNegl Trop Dis., 6(11): e1921. DOI: 10.1371/journal.pntd.0001921

Madden J M, Mc Cardell B A. 1989. Vibrio cholerae. EditeurIn: Doyle, M.P. Foodborne Food Bacterial Pathogens, New York: Marcel Dekker, p 525-542.

Mahmoudi, S., Pourakbari, B., Moradzadeh, M., Eshaghi, H., Ramezani, A., Haghi Ashtiani, M. T., Keshavarz Valian, S., & Mamishi, S. (2017). Prevalence and antimicrobial susceptibility of Salmonella and Shigella spp. Among children with gastroenteritis in an Iranian referral hospital. Microbial Pathogenesis, 109, 45?48. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2017.05.023

Mares, M. (2017). Current Topics in Salmonella and Salmonellosis. BoD - Books on Demand.

Mariani-Kurkdjian, P., Bonacorsi, S., & Bingen, E. (2016). Diagnostic bactériologique des infections gastro-intestinales. Bactériologie Médicale, 149?161. https://doi.org/10.1016/B978-2-294-74616-1.00015-7

MartínezJL,BaqueroF,AnderssonDI. 2007.Predictingantibioticresistance. Nat.Rev.Microbiol.12 :958-65.

Martinetti G, & Altwcgg M (1990). rRNA gène restriction patterns and plasmid analysis as tool for typing Salmonella Enteritidis, Res. Microbiol, 141, 1151-1162.

Mermin J, Villar R, Carpenter J, Roberts L,Samaridden A, Gasanova L, Lomakina S, Bopp C, Hutwagner L, Mead P, Ross B, Mintz E (1999). A massive epidemic of multidrugresistant typhoid fever in Tajikistan associated with consumption of municipal water. J. Infect. Dis., 179, 1416-1422.

Maiden MC, Bygraves JA, Feil E, Morelli G, Russell JE, Urwin R, Zhang Q, Zhou J, Zurth K, Caugant DA, Feavers IM, Achtman M, & Spratt BG (1998). Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 3140-3145.

Madoff LC, Michel JL, Gong EW, Kling DE & Kasper DL (1996). Group B streptococci escape host immunity by deletion of tandem repeat elements of the alpha C protein. Proc Natl Acad Sci USA 93: 4131-6.

McQuade, E. T. R., Shaheen, F., Kabir, F., Rizvi, A., Platts-Mills, J. A., Aziz, F., Kalam, A., Qureshi, S., Elwood, S., Liu, J., Lima, A. A. M., Kang, G., Bessong, P., Samie, A., Haque, R., Mduma, E. R., Kosek, M. N., Shrestha, S., Leite, J. P., ... Iqbal, N. T. (2020). Epidemiology of Shigella infections and diarrhea in the first two years of life using culture-independent diagnostics in 8 low-resource settings. PLOS Neglected Tropical Diseases, 14(8), e0008536. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0008536

Mérens A, Servonnet A, 2010. Mecanismes et epidemiologie de la resistance aux fluoroquinolones en 2010. Revue francophone des laboratoires 422:33-41

Mérens A, Delacour H, Plésiat P, Cavallo JD, Jeannot K, 2011. Pseudomonas aeruginosa et résistance aux antibiotiques. Revue francophone des laboratoires 435:49-62.

Michel, R., Sicard, S., Coton, T., Watier-Grillot, S., Buzens, A., Marimoutou, C., Mayet, A., & Pommier de Santi, V. (2018). Actualités sur les diarrhées aiguës liées aux déploiements hors métropole. Medécine et armées, 46.

Moubareck, C., M. Lecso, E. Pinloche, M. J. Butel, and F. Doucet-Populaire.2007. Inhibitory impact of bifidobacteria on the transfer of B-lactam resistance among Enterobacteriaceaein the gnotobiotic mouse digestive tract. Appl.Environ. Microbiol. 73:855-60.

MSPP. (2022). PLAN NATIONALDE DEVELOPPEMENT SANITAIRE (PNDS 4) 2022--2030 (Vol. 235).

Muylaert A, Mainil JG, 2012. Bacterial antimicrobial resistances: the mechanisms and their contagiousness. Ann. Méd. Vét. 156:109-123

Nau, R., Sörgel, F., & Eiffert, H. (2010). Penetration of Drugs through the Blood-Cerebrospinal Fluid/Blood-Brain Barrier for Treatment of Central Nervous System Infections. Clinical Microbiology Reviews, 23(4), 858?883. https://doi.org/10.1128/cmr.00007-10

Nicole L., B., , Melinda, A. Z., Dorian, Q. F., & Michael, D. P. (2016, juin 6). Ecological consequences of human niche construction?: Examining long-term anthropogenic shaping of global species distributions | PNAS. Ecological consequences of human niche construction: Examining long-term anthropogenic shaping of global species distributions | PNAS. https://www.pnas.org/doi/abs/10.1073/pnas.1525200113

Olsen, J.E., 2005. Studies of zoonotic Salmonella: Taxonomy, detection, typing, and pathogenesis, Ed: Samfundsgrafik, Denmark, 146 p.

Ouchar Mahamat, O., Lounnas, M., Hide, M., Dumont, Y., Tidjani, A., Kamougam, K., Abderrahmane, M., Benavides, J., Solassol, J., Bañuls, A.-L., jean-Pierre, H., Carrière, C., & Godreuil, S. (2019). High prevalence and characterization of extended-spectrum ß-lactamase producing Enterobacteriaceae in Chadian hospitals. BMC Infectious Diseases, 19(1), 205. https://doi.org/10.1186/s12879-019-3838-1

Ouédraogo, G. A., , Hama, C., Kaboré, B., Emmanuel, S., Rober, B., Kpoda, D. S., Bassolé, I. H. N., & Aly, S. (2022). Spread and antibiotic resistance profile of pathogens isolated from human and hospital wastewater in Ouagadougou. Microbes and Infectious Diseases 2022, 318-331, 3(2): 318-331. https://doi.org/DOI: 10.21608/MID.2021.72261.1143

Ouédraogo N, Tomba Ngangas SM, Bonkoungou IJO, Tiendrebeogo AB, Traore KA, Sanou I, et al.(2017). Temporal distribution of gastroenteritis viruses in Ouagadougou, Burkina Faso : seasonality of rotavirus. BMC Public Health. 17 : 274

Philippon A, Arlet G, 2012. Entérobactéries et bêta-lactamines : phénotypes de résistance naturelle. Pathologie Biologie 60:112-126.

Ploy MC, Denis F, Courvalin P, Lambert T, 2000. Molecular characterization of integrons in Acinetobacter baumanii: Description of an hybrid class 2 integron. Antimicrob. Agents Chemother. 44:2684-2688.

Poppe C. McFadde KA, Brouwer AM, & Demczuk W (1993). Characterization of Samlonella Enteritidis strains, Can. J. Yet. Res. 57, 176-184

Quilici ML, Massenet D, Gake B, Olson DM. 2010. Vibrio cholerae O: 1 variant with reduced susceptibility to Ciprofloxacin, Western Africa. Emerg. Infect. Dis.85: 293-308

Rahman, Md. T. (2015). Salmonellosis?: A major foodborne disease of Global significance. Beverage and Food World.

Ramisse V, Houssou P, Hernadez E (2004). Variable number of tandem repeats in Salmonella enterica subsp enterica for typing purpose. J Clin Microbiol 42, 5722-5730. Ramisse V, Houssou P, Hernadez E (2004). Variable number of tandem repeats in Salmonella enterica subsp enterica for typing purpose. J Clin Microbiol 42, 5722-5730.

Ross IL, Heuzenroeder M. (2009). A comparison of two PCR-based typing methods with pulsed-field gel electrophoresis in Salmonella enterica serovar Enteritidis. Int J Med Microbiol; 299, 410- 20.

Rud D, Pederson-Gulrud K, Wotton J, Medus C, Lyszkowicz E, Besser J (2007). Comparison of multiple-locus variable-number tandem repeat analysis, pulsedfield gel electrophoresis, and phage typing for subtype analysis of Salmonella enterica serotype Enteritidis. J Clin Microbiol 45, 536-43..

René, S. H., Antonio, R. V., Susanne, K., Danilo, M. A. L. F. W., Henrik, C. W., & Frank, M. A. (2011, juillet 18). Surveillance mondiale de la distribution des sérovars à Salmonella de la Banque de données par pays du Réseau mondial des infections d'origine alimentaire de l'Organisation mondiale de la Santé?: Résultats des laboratoires de qualité assurée de 2001 à 2007 | Agents pathogènes et maladies d'origine alimentaire. https://doi.org/10.1089/fpd.2010.0787

Rogawski McQuade, E. T., Shaheen, F., Kabir, F., Rizvi, A., Platts-Mills, J. A., Aziz, F., Kalam, A., Qureshi, S., Elwood, S., Liu, J., Lima, A. A. M., Kang, G., Bessong, P., Samie, A., Haque, R., Mduma, E. R., Kosek, M. N., Shrestha, S., Leite, J. P., ... Iqbal, N. T. (2020). Epidemiology of Shigella infections and diarrhea in the first two years of life using culture-independent diagnostics in 8 low-resource settings. PLOS Neglected Tropical Diseases, 14(8), e0008536. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0008536

Sanranturya J, Nishi J, Wakimoto N, Erdene S, Nataro JP, Sheikeh J et al. (2004). Tipical enteroaggregative Escherichia coli in the most prevalent pathotype among Escherichia coli strains causing diarrhea in Mongolian children. J clin Microbiol.42 : 133-139.

Sawadogo, W., Bliefernicht, J., Fersch, B., Salack, S., Guug, S., Diallo, B., Ogunjobi, Kehinde. O., Nakoulma, G., Tanu, M., Meilinger, S., & Kunstmann, H. (2023). Hourly global horizontal irradiance over West Africa?: A case study of one-year satellite- and reanalysis-derived estimates vs. in situ measurements. Renewable Energy, 216, 119066. https://doi.org/10.1016/j.renene.2023.119066

Schwartz S, Cloeckaert A & Roberts MC (2006). Mechanisms and spread of bacterial resistance to antimicrobial agents. InF. M. A are strup (ed.), Antimicrobial resistance in bacteria of animal origin. ASM Press, Washington, D. C. 73-98 p

Selander RK, Beltran P, Smith NH, Backer RM, Crichton PB, Old D, Musser JM & Whittam TS (1990). Genetic population structure, clonal phylogeny, and pathogenicity of Salmonella paratyphi B. Infect. Immun 58, 1891-1901.

Shauf MAM, Sieo CC, Kqueen CY, Chong CW, Omar AR, Ho YW, Hun TG. Discrimination of Escherichia coli isolates recovered from mucosal contents of chicken intestines and diferent age by repetitive elements sequence-based PCR. J of Bioch Microbiol Biotechnol. 2017;5(1):7-12. https://doi.org/10.54987/jobimb.v5i1.333 .

Somda NS, Bonkoungou OJI, Traoré O, Bassolé IHN, Traoré Y, Barro N, Savadogo A. 2017. Serotyping and antimicrobial drug resistance of Salmonella isolated from lettuce and human diarrhea samples in Burkina Faso. A. J. Infect. Dis., 11(2): 24-30. DOI: 10.21010/ajid.v11i2.4.

Soraci AL, Perez DS, Tapia MO, Martínez v, Dieguez S, Buronfosse-Roque F, Harkes R, Colusi A, Romano O, 2011. Pharmacocinétique et biodisponibilité de fosfomycine chez le poulet de chair. Revue Méd. Vét. 162:358-363.

Sougakoff W, Trystram D. Résistances aux â-lactamines. Service de BacteriologieHygiène du CHU Pitié-Salpêtrière. 2003:9-12.

Tigabu E, Asrat D, Kassa T, Sinmegn T, Molla B, Gebreyes W, 2015. Assessment of risk factors in milk contamination with Staphylococcus aureus in urban and peri-urban small-holder dairy farming in central Ethiopia. Zoonoses Public Health doi: 10.1111/zph.12199.

Threlfall EJ & Frost JA (1990). The identification typing and fingerprinting of Salmonella: laboratory aspects and epidemiological applications. J Appl Bacteriol 68: 5-16.

Threlfall EJ, Rowe B & Ward LR (1989). Subdivision of Salmonella Enteritidis phage types by plasmid profile typing. Epidemiol. Infect 102, 459-465.

Threlfall E (2000). Epidemic Salmonella Typhimurium DT 104-a truly international multiresistant clone. J. Antimicrob. Chemother 46, 7-10.

Tindall BJ, Grimont PA, Garrity GM, & Euzeby JP (2005). Nomenclature and taxonomy of the genus Salmonella. Int J Syst Evol Microbiol 55, 521-524.

Ung, A., Baidjoe, A. Y., Van Cauteren, D., Fawal, N., Fabre, L., Guerrisi, C., Danis, K., Morand, A., Donguy, M.-P., Lucas, E., Rossignol, L., Lefèvre, S., Vignaud, M.-L., Cadel-Six, S., Lailler, R., Jourdan-Da Silva, N., & Le Hello, S. (2019). Disentangling a complex nationwide Salmonella Dublin outbreak associated with raw-milk cheese consumption, France, 2015 to 2016. Eurosurveillance, 24(3), 1700703. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2019.24.3.1700703

Vaillant, M., Miller, M. I., Younes, L., & Trouvé, A. (2004). Statistics on diffeomorphisms via tangent space representations. NeuroImage, 23, S161?S169. https://doi.org/10.1016/j.neuroimage.2004.07.023

Vergnaud G & Pourcel C (2009). Multiple locus variable number of tandem repeats analysis. Methods Mol Biol. 551, 141 158.

Vu, D.-L. (2020). Gastroentérites aiguës?: Démarche diagnostique, qui et quand traiter?? Revue Médicale Suisse, 16(679), 186?188. https://doi.org/10.53738/REVMED.2020.16.679.0186

Waslh CT, Wright G, 2005. Introduction: Antibiotic Resistance. Chemical Reviews 105:392-393.

Weill F.X, Le hello S, Lefevre S, Renaudat C. 2016. Rapport d'activités du Centre National de Référence des Escherichia coli, Shigella et Salmonella Unité de Recherche et d'Expertise des Bactéries Pathogènes Entériques et Laboratoire associé Service de Microbiologie, Institut Pasteur de Paris.

Weill FX, Lefèvre S, Pardos de la Gándara M. 2020. Rapport d'activités du Centre National de Référence des Escherichia coli, Shigella et Salmonella Unité de Recherche et d'Expertise des Bactéries Pathogènes Entériques et Laboratoire associé Service de Microbiologie, Institut Pasteur de Paris

World Health Organization. (2008). Directives pour la lutte contre la shigellose, y compris lors d'épidémies dues à Shigella dysenteriae type 1. Guidelines for the control of shigellosis, including epidemics due to Shigella dysenteriae type 1, 68.

World Health Organization. (2018). World health statistics 2018?: Monitoring health for the SDGs, sustainable development goals. World Health Organization. https://iris.who.int/handle/10665/272596

Yang D, Guo Y, Zhang Z.2009. Combined Porin Loss andExtended SpectrumLactamase Production is Associated with an Increasing ImipenemMinimal Inhibitory Concentration in Clinical Klebsiella pneumoniae Strains. Curr. Microbiol. 58:366-70.

Yao, Kouamé Réné . (2019). Thèse Phd CARACTERISATION PHENOTYPIQUE ETMOLECULAIRE DE SALMONELLA SP ET ESCHERICHIA COLI ISOLEES CHEZ LES BOVINS DANS LE DISTRICT D'ABIDJAN (CÔTE D'IVOIRE)?: IMPACT BIOLOGIQUE DE L'UTILISATION DES ANTIBIOTIQUES.

Yao JDC, Moellering RCJR, 2007. Antibacterial agents. In Man. Clin. Microbiol. Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA, 9th Ed: 1:1077-1113

Yves Millemann (1998). Les marqueurs épidémiologiques des salmonelles. Elsevier Inra, Vet Res 29, 3-19.

Zeba B, Kiendrebeogo M, Lamien A, Docquier J D, Simporé J, Nacoulma G O. 2007. Major enzymatic Factors involved in Bacterial Penicillin Resistance in Burkina Faso. J. Biol. Sci. 10: 506-510.

ANNEXE

Liste des articles et communication

1. Mahamat Tahir N'garé Hassan, Ahmat Idriss Ahmat1, Yacoub Mahamat Allamine1, AbakarLawane Idriss, Allagueryane Djimadinan1, AbderrazzackAdoum Foudda3, Ali Mahamat Moussa⁴. 2023. Different Species of Salmonella spp and Shigella spp and Their Risk of Infection in N'Djamena Chad. Journal of Biosciences and Medicines, 11, 1-12. https://doi.org/10.4236/jbm.2023.1111001;

1 Mahamat Tahir N'garé Hassan 1*, Ahmat Idriss Ahmat 1 ,Yacoub Mahamat Allamine 3 ,MbaigolmenBeral Valery, 1 ,Mahamat Nour AbakarDjibrine 4 et Ali Mahamat Moussa 1. 2023. STUDY OF SALMONELLA ISOLATES' RESISTANCE AMONG CHILDREN AGED 0 TO 5 YEARS AT THE UNIVERSITY HOSPITAL CENTER FOR MATERNAL AND CHILD HEALTH. Am. J. innov. res. appl. sci. 2023; 17(3): 193-199.

1 Communication orle et Poster. Profil de sensibilité des souches de Salmonella spp et Shigella spp associés aux diarrhées vis-à-vis des antibiotiques dans la ville de Ndjamena Tchad. 2023. Mahamat Tahir N'garé Hassan, Ahmat Idriss Ahmat,AbderrazzackAdoumFouda,Yacoub Mahamat Allamine , Mahamat Nour AbakarDjibrine et Ali Mahamat Moussa. 2023. Journées Scientifiques 1^ère édition de l'ACT.

2 Profil de résistance des souches de Salmonella spp et Shigella spp associés aux diarrhées vis-à-vis des antibiotiques dans la ville de Ndjamena Tchad.Colloque nationale du 13 au 15 Janvier 2022, Deuxième Journées Scientifiques et Partenariales des Écoles Doctorales de l'Université de N'Djamena sur le thème : « Contribution des études doctorales du développement socio-économique du Tchad

Hôpital notifiant : ______________________________ No patient ___________________.

Hospitalisé /____/ Externe /____/ Date d'hospitalisation : ____/____/____ (jour/mois/année)

Nom de famille : ________________________________ Prénom : ____________________

Adresse/Tel : _________________________ quartier : _______________________________ secteur_________________________________________________________________

Age (mois) : __________ Date de naissance : ____/____/____ (jour/mois/année) Sexe : M F (encercler)

I. Quelles sont vos sources d'approvisionnement en eau. Cochez la bonne réponse

2. Constatez-vous des symptômes de gastro-entérite, (maux de ventre, vomissements, diarrhées, fièvre à partir de quel mois ?

3. Y a-t-il un lien avec la consommation du réseau d'eau utilisé ? OUI ? NON ?

III-1 Qui s'occupe de l'enfant pendant votre absence : coche la bonne réponse :

· Comment gérez- vous vos déchets ménagers : brève explication -------------

· Comment évacuez vos fosses latrines quand elles sont pleines : brève explication : ----

Vomissement : ________ (Oui/Non) Nombre d'épisodes/24 h : __________ Durée (jours) : _

Diarrhée : ___________ (Oui/Non) Nombre d'épisodes/24 h : __________ Durée (jours) : __

Déshydraté : __________ (Oui/Non) Autres symptômes : _____________________________

Paient sous antibiothérapie :_____(Oui/Non) si oui, quel(s) antibiotique(s) ?______________

Date de prélèvement des selles : ____/____/____ (jour/mois/année) Aspect______________________

Germe (s) isolé (s): Shigella , SalmonellaAutres préciser______________________

Date de prélèvement des sangs : ____/____/____ (jour/mois/année) Aspect_____________________________________________________________________

Hémoculture :______________________________________________________________

Germe (s) isolé (s) : Shigella , Salmonella, Autres préciser______________________

Epidemiologie et caracterisation moleculaire des Souches Salmonella et Shigella, impliqués dans les gastroenterites aigue chez les patients souffrants des diarrhée dans la Ville de N'Djamena.

1-BUT DE L'ETUDE : cette étude a pour but de protéger les personnes sur les infections des gastroentérites aigues du aux Salmonella et Shigella.

2-PROCEDURE : Une fiche de renseignement était établie. On remettra les potssterile pour le prélèvement des selles aux parents en vue de réaliser l'analyse,le bouillons de l'hemoculturesera utilisé pour les patients hospitalisés ou non hospitalisé mais qui presentait une fiévresuperieur à 38 degré et le résultat des examens seront remis au médecin.

3-PARTICIPATION : La participation est volontaire et les patients sont libres d'accepter ou de refuser.

4-BENEFICICE EVENTUEL : Le bénéfice de l'etudeest la connaissance des souches de Salmonella et Shigella. entéropathogène et aussi l'ampleur des risques .Cela devra permettre aux cliniciens à une meilleures prise en charge thérapeutique.

5-CONFIDENTIALITE : Les informations seront remises au médecin consultant confidentiellement et ne seront divulguées à qui que ce soit.

7-DEPENSES : La participation de l'étude est libre et non payante. Les résultats d'analyses seront remis au médecin

Le parent-----------------------------------------------a été informé de la nature de l'étude et de procédure devant être utilisées pour sa réalisation. Il lui a été demandé de poser les questions sur le différent aspect de l'étude. Les réponses seront claires, précises et sans ambiguïté.

Je soussignée---------------------------------------------déclare avoir bien été informé de la nature, procédures, bénéfices et risques éventuel de l'étude « Epidemiologie et caracterisation moleculaire des Souches Salmonella et Shigella, impliqués dans les gastroenterites aigue chez les patients souffrants des diarrhée dans la Ville de N'Djamena.Accepté de participer.