Influence du sédiment sur les flux énergétiques et le métabolisme oxydatif chez l'huà®tre creuse Crassostrea Gigas

Mémoire de Master 2

Sciences Chimiques Marines - IUEM 2008/2009

Influence du sédiment sur les flux énergétiques et le métabolisme oxydatif chez l'huître creuse Crassostrea gigas

PERHIRIN Antoine

Maîtres de stage : Jeanne Moal et Catherine Séguineau

Ifremer, Centre de Brest

Laboratoire de Physiologie des Invertébrés

BP70

29280 Plouzané

Abréviations

ATP : Adénosine triphosphate

CAT : Catalase

CCO : Cytochrome C Oxydase

CS : Citrate Synthase

DPPH : diphenyl-1-picrylhydrazyl

ETS : Electron Transport System

FRD : Fumarate Réductase

GR : Glutathion Réductase

HAP : Hydrocarbure aromatique polycyclique

INSU : Institut national des sciences de l'Univers

NADH : Nicotinamide adénine dinucléotide

NTB : nitrothiobenzoate

PCB : Polychlorobiphényle

PEP : Phosphoénol Pyruvate

PEPCK : Phosphoénol Pyruvate Carboxykinase

PK : Pyruvate Kinase

ROS : Espèce Réactive de l'Oxygène

SOD : Superoxide Dismutase

Sommaire 

ABRÉVIATIONS 1

SOMMAIRE 2

INTRODUCTION 3

LES ENJEUX - MORTALITÉS ESTIVALES DES HUÎTRES : 3

PROGRAMME MOREST : 3

RISCOSOL : DANS LA CONTINUITÉ DE MOREST 5

OBJECTIFS DU STAGE : 6

MESURES BIOCHIMIQUES ET INTÉRÊTS : 6

MATÉRIEL ET MÉTHODES 9

1. MATÉRIEL BIOLOGIQUE 9

2. PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS POUR LES MESURES D'ACTIVITÉS ENZYMATIQUES 10

3. PRINCIPE DES DOSAGES 10

4. TRAITEMENT STATISTIQUE 13

RÉSULTATS 13

1. CROISSANCE - MORTALITÉS 13

2. MÉTABOLISME ÉNERGÉTIQUE 14

3. MÉTABOLISME OXYDATIF 16

4. CORRÉLATIONS D'ACTIVITÉS ENZYMATIQUES RISOCOSOL 18

DISCUSSION 18

CONCLUSION 23

BIBLIOGRAPHIE 24

ANNEXES 27

Introduction

Les enjeux - mortalités estivales des huîtres :

Après son introduction dans les années 70 sur le littoral français, l'huître creuse a toujours été touchée par une mortalité plus ou moins importante selon les années. Cependant, on assiste ces dernières années à une augmentation de l'intensité de ce phénomène avec par exemple une mortalité touchant les juvéniles pour l'année 2008 exceptionnellement élevée par rapport aux suivis des mortalités effectués depuis une vingtaine d'année. Entre 2000 et 2005, le défi Morest (Mortalité estivale des huîtres), un projet réunissant une quinzaine de laboratoires, a permis d'identifier le caractère multifactoriel des mortalités estivales avec d'une part des caractéristiques intrinsèques de l'animal (gamétogénèse, croissance, système antioxydant) mais aussi son interaction avec l'environnement (pluviométrie, température, nature du sédiment, pesticides) ainsi que des agents pathogènes (vibrio).

Programme Morest :

Le risque de mortalité lié à la proximité du sédiment a été identifié dans ce cadre: les huîtres cultivées à 15 cm du sol présentent des mortalités nettement plus élevées que celles cultivées à 70 cm du sol (Figure 1).

Figure 1 : Mortalités comparées entre les élevages à 0-15cm (plat) et 50-70cm du sol (table) sur le site atelier de Perquis dans le sud du bassin de Marennes Oléron. Huîtres 2 ans.[1, 2]

De plus, les huîtres transférées au cours du printemps à proximité du sédiment (0-15cm) montrent des mortalités corrélées au temps de résidence près du sédiment ce qui suggère l'existence d'un stress chronique lié au sédiment provoquant un affaiblissement progressif des individus. L'épisode de mortalité en juin est alors plus important pour les huîtres qui ont séjourné plus longtemps à proximité du sédiment que par des huîtres situées à 70 cm du sédiment (Figure 2).

Figure 2 : Mortalités corrélées à leur temps de séjour à proximité du sédiment, en pointillé : lot témoin situé à 70cm du sédiment sur table [3].

Pour expliquer cet effet sédiment, plusieurs hypothèses ont été avancées :

a) Les facteurs environnementaux liés au sédiment

La mesure du taux d'oxygène dans les sédiments montre une montée du niveau anoxique à la fin du printemps et en été. Cette évolution du taux d'oxygène dissout est expliquée par la sédimentation de matière organique provenant principalement de la production primaire et de l'activité nutritive des huîtres ainsi que des apports du continent. La chaîne microbienne présente à la surface et dans le sédiment recycle ce substrat en consommant de l'oxygène [4]. Lors d'un bloom printanier très productif, ce processus peut même provoquer l'anoxie totale au niveau du benthos [5].

De plus, ces baisses saisonnières du taux d'oxygène dans les sédiments correspondent avec l'apparition de composés réduits tel que l'ammoniac et les sulfures (Figure 3). Le caractère saisonnier de l'apparition de ces composés représenterait donc une source de stress potentiel dans les zones ostréicoles. Par exemple en France, les crises anoxiques survenant en été dans l'étang de Thau (Hérault) sont à l'origine de production de sulfures à des taux très élevés. Plusieurs travaux ont montré qu'un déficit en oxygène dissout chez Crassostrea gigas peut provoquer une dépression métabolique qui sensibiliserait les huîtres pendant l'épisode de mortalité estivale [6]. La réduction de l'activité de nutrition et de la respiration sont des réponses fréquemment observées à l'hypoxie et aux sulfures chez les invertébrés comme l'a montré Le Moullac et al. chez l'huître creuse [6]. De plus, les sulfures sont directement toxiques pour les organismes vivants car ils sont des inhibiteurs de la cytochrome c oxydase, l'enzyme terminale de la chaîne de transport d'électrons [6].

Figure 3: Variation de la teneur en ammonium et en sulfures dans les sédiments de PERQUIS pendant l'été 2006[3]

D'autres facteurs peuvent également expliquer cet effet sédiment sur les mortalités. Les apports terrigènes sont sources de pesticides, HAP, PCB, métaux lourds sous forme particulaire et d'autres polluants qui, par leur nature hydrophobe, se retrouvent piégés dans les sédiments.

L'augmentation des phénomènes de mortalités de ces dernières années pourrait aussi être corrélée à l'envasement progressif des sites de conchyliculture. Par exemple, dans le parc conchylicole de Grandcamp Maisy (baie des Veys - Normandie), le taux de pélite (vases fines) est de 8% maximum en 1992, 21% maximum en 1998 et de 64% maximum en 2003 [3].

b) Caractéristiques intrinsèques de l'huître

La création dans le projet Morest de deux souches d'huîtres « R » et « S », souches dites Résistantes ou Sensibles aux mortalités estivales a permis de décrire des différences au niveau du métabolisme et de l'expression des gènes dans ces deux souches '[7]. Parmi les gènes différentiellement exprimés, on retrouve la catalase et la superoxide dismutase, des enzymes du métabolisme oxydatif. L'hypoxie, les composés réduits, les métaux lourds ou les pesticides sont connus pour pouvoir créer un stress oxydant. On observe au niveau des cellules du système immunitaire de Crassostrea gigas que la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) est plus importante pour les huîtres de la souche « S » [8]. La régulation du stress oxydatif aurait potentiellement un rôle dans les mortalités estivales.

Riscosol : dans la continuité de Morest

La méthode d'élevage en baie de Quiberon est traditionnellement l'élevage des huîtres « à plat », c'est-à-dire directement sur le sédiment et en eau profonde où les huîtres ne découvrent jamais. La baie de Quiberon est le premier site de conchyliculture de Bretagne avec 60% du potentiel de production breton. Depuis 2003, on assiste à des mortalités passant de l'ordre de 35-40% à près de 75% (Enquête SRC Bretagne Sud). Des essais de cultures sur table en eau profonde pour l'année 2007 ont aussi clairement montré l'impact de la proximité du sédiment dans ce cas (Figure 4). La mortalité est plus importante pour les huîtres élevées au sol que les huîtres surélevées sur tables. La question de la qualité du sédiment est donc particulièrement importante et le projet Riscosol a été créé pour répondre à cette problématique.

Figure 4 : en pointillé - huître élevées au sol, traits continus - huîtres élevées sur table (bleu clair - station QB02, bleu foncé - station QB03, rouge - station QB04, orange - station QB 05, vert - station QB06) Rapport interne Ifremer Fleury et al. - 2008

Financée pour la période 2008-2010, cette étude a pour objectif de mieux cerner l'effet du sédiment sur les mortalités des huîtres à travers une étude équivalente à celle développée dans MOREST (Ecophysiologie et physiologie, Analyse physicochimique et microbiologique, écologie).

L'objectif majeur du projet est donc de caractériser le sédiment, d'étudier les échanges et flux de matière organique avec le sédiment, leur intégration par la flore microbienne et d'étudier comment cela peut influencer la physiologie de l'huître.

Objectifs du stage :

L'objectif de cette étude est de documenter la partie physiologie pour le projet Riscosol. Comment la physiologie des huîtres est-elle affectée par ces variations de qualité du sédiment ? Peut-on identifier des stress chroniques et aigus ?

Pour répondre à ces questions, un certain nombre de paramètres caractéristiques du métabolisme énergétique et oxydatif de l'huître creuse ont été étudiés.

Le matériel biologique utilisé proviendra d'une part d'une comparaison d'huîtres élevées sur différents types de sédiment dans la baie de Quiberon en eau profonde (projet Riscosol) et d'une expérimentation en milieu contrôlé au cours de laquelle des huîtres ont été soumises à un milieu hypoxique [6] et pour lesquelles des mesures écophysiologiques et biochimiques sont déjà disponibles. La plupart des méthodes font appel à des cinétiques enzymatiques et à des dosages colorimétriques qui sont réalisés en microplaque sur un lecteur Biotek. Ces techniques seront validées chez l'huître par la recherche des conditions optimales d'extraction et de dosage.

Mesures biochimiques et intérêts :

Les analyses biochimiques ont pour but d'évaluer l'état de santé général de l'huître en appréciant la gestion de l'énergie et la régulation du métabolisme oxydatif des animaux :

a) Métabolisme énergétique :

L'état des réserves énergétiques est évalué par la mesure des glucides totaux (glycogène principalement) ainsi que les lipides totaux. L'utilisation de cette énergie sera appréciée par des mesures d'activités enzymatiques au carrefour Phosphoénolpyruvate (PEP). A partir du PEP, la voie de la PEPCK permet la synthèse de précurseurs du métabolisme anaérobie tandis que la voie de la Pyruvate Kinase est considérée comme la voie donnant les précurseurs du métabolisme aérobie (Figure 5).

Figure 5 : Exemple de métabolisme général aérobie et anaérobie (chez la douve du foie), en flèche rouge : métabolisme aérobie, en flèche bleue : métabolisme anaérobie, pointillées : transport d'électrons, en encadrés : produits finaux, en vert : enzymes dosés dans le cadre du stage. Abréviations : AcCoA, acetyl-CoA; ASCT, acetate:succinate CoA-transferase; C, cytochrome c, C I, complex I; C III, complex III; CIV, complex IV; CITR, citrate; FRD, fumarate reductase; FUM, fumarate; MAL, malate; ME, malic enzyme; OXAC, oxaloacetate; PDH, pyruvate dehydrogenase; PEP, phosphoenolpyruvate; PYR, pyruvate; RQ, rhodoquinone; SDH, succinate dehydrogenase; SUCC, succinate; Succ-CoA, succinyl-CoA; UQ, ubiquinone. Modifié d'après Tielens [9]

Le niveau de l'activité métabolique, que l'on peut associer aux besoins en ATP de la cellule, sera apprécié par les mesures d'activité enzymatique du cycle de Krebs (CS : Citrate Synthase) et de la phosphorylation oxydative (CCO : Cytochrome C Oxydase). Le couple PK/PEPCK permettra éventuellement d'observer un glissement vers un métabolisme anaérobie.

b) Métabolisme oxydatif :

Le métabolisme cellulaire est obligatoirement associé à la production de ROS, des composés radicalaires ou non issus de l'oxygène et fortement réactifs vis-à-vis des macromolécules de la cellule. On considère que cette production de ROS provient à 80% de la chaîne respiratoire dans la mitochondrie, le reste étant principalement dû au fonctionnement d'une enzyme transmembranaire, la NADPH oxydase.

Le long de la chaine respiratoire, une proportion significative de l'oxygène (2 % à 6 %) échappe à la réduction complète en H₂O et subit une réduction mono-électronique au niveau des complexes I et III (cf CI et CIII Figure 5), pour donner naissance à l'ion superoxyde (O^-.₂) : cette production est absolument indissociable du processus respiratoire [10].

Figure 6 : Schéma des réponses antioxydantes de la cellule face aux ROS : GRd - Glutation Réductase, GPx - Glutathion Peroxydase, CAT - Catalase, SOD - Superoxide Dismutase, en vert - Réaction de Fenton, GSSG - Glutathion oxydé, GSH - Glutathion réduit

L'anion superoxide initial est pris en charge par une cascade de réactions d'oxydoréductions ou enzymatiques pour donner des dérivés oxygénés activés ou inertes. La Superoxide Dismutase (SOD) est dosée dans le cadre de ce stage. C'est la première étape de ce système antioxydant. Les activités Catalase et Glutathion Peroxydase (GPx) permettent l'élimination de l'eau oxygénée. Cette étape doit être la plus efficace possible car H₂O₂ produit, par la réaction de Fenton, le radical hydroxyle (OHÿ) qui est, de tous les ROS, l'espèce la plus réactive et la plus dommageable pour la cellule.

De plus, les défenses antioxydantes sont liés par le système des glutathions à la phase II de détoxication de molécules exogènes comme les hydrocarbures type HAP ou encore les herbicides par exemple. Le glutathion réduit (GSH), en plus de sa capacité antioxydante, est une molécule-clé dans la signalisation et l'élimination de composés biotransformés. Le glutathion réduit est également connu pour ses capacités de chélation et d'élimination des métaux lourds. La mesure de l'activité GR (glutathion réductase) permettra d'évaluer les besoins de la cellule en glutathion réduit.

Le stress oxydant résulte d'un excès de la production de ROS par les systèmes pro-oxydant par rapport à la prise en charge de ces ROS par les systèmes antioxydants. Les conséquences de ce stress oxydant sont des dommages non spécifiques et irréversibles de molécules comme l'ADN, les lipides ou des protéines. Si des macromolécules endommagées par les ROS sont activées en radicaux libres, des réactions en chaîne peuvent apparaitre. La cellule a mis en place des défenses antiradicalaires, principalement des vitamines, pour se protéger de ce type de réaction. La mesure de l'activité antiradicalaire est réalisée avec le dosage DPPH.

La deuxième source de ROS dans la cellule est issue du fonctionnement de la NADPH oxydase dans des cellules spécialisées de l'immunité. En cas d'attaques de pathogènes, ces cellules produisent massivement des anions superoxydes dans les phagosomes avec la NADPH oxydase afin de lyser les agents infectieux. Cette activité ne sera pas étudiée dans le cadre de ce stage.