II.13.2- Dosage
Préparer le milieu gélosé, dans un
bécher, en dissolvant 0,75 % (masse/volume) d'agar dans l'eau
distillée; chauffer en agitant sur une plaque chauffante. Laisser
refroidir jusqu'à environ 50C°, y transvaser 7,5 ml de
solution acétonique de f3-carotène (1 mg/ml) et
1,5 ml de solution éthanolique d'acide linoléique (5 ìl ml
d'éthanol); couler dans des boites pétri; laisser solidifier puis
creuser des puits et y verser 30 ìl de chaque extrait (1mg/ml).
Laisser incuber 3 à 4 h à 45C°. Dans des
boites témoins les extraits sont remplacés par la
quercétine et le BHT (témoins positifs), l'éthanol
(témoins négatifs).
Une zone de rétention de la couleur orange autour des
puits indique l'activité antioxydant des extraits (BELHATTAB, 2007).
29
Chapitre II- Méthode d'étude d'activité des
antioxydants des plantes médicinales
II.14- Pouvoir réducteur II.14.1-
Dosage
Les mélanges réactionnels ont été
préparés par addition de 2,5 ml du tampon phosphate (0,2 M, pH
6,6) à 2,5 ml de potassium Ferricyanide (1%) et les extraits de
concentration variable (40-200 mg). Ces mélanges sont incubés
dans un bain marie pendant 30 minutes à 50C°.
Après refroidissement à température ambiante
(28C°), 2,5 ml de TCA (acide trichloracétique) à
10% est ajouté à chaque mélange réactionnel, puis
centrifugé à 2000 rpm pendant 10 min. Le surnageant (2,5 ml) a
été déposé dans un tube à essai et
mélangé avec 2,5 ml d'eau distillée et 0,5 ml FeCl3 (0,1%)
et laissé réagir pendant 10 min à température
ambiante. L'absorbance a été mesurée à 700 nm.
L'acide ascorbique (ASA) a été utilisé comme standard
(PISE et al., 2010).
II.15- Test de blanchiment de
â-carotène couplé à
l'auto-oxydation de l'acide linoléique
II.15.1- Principe
Le test de blanchiment de f3-carotène couplé
à l'auto-oxydation de l'acide linoléique est une méthode
rapide basée principalement sur le principe que l'acide
linoléique, qui est un acide gras insaturé, s'oxyde par les
espèces réactives de l'oxygène (ROS) produits par l'eau
oxygénée. Le produit formé lancera l'oxydation du
f3-carotène, ce qui conduira à la décoloration. Les
antioxydants diminuent le degré de décoloration, qui est
mesurée à 434 nm (NUR ALAM et al., 2013).
II.15.2- Dosage
La méthode de KABOUCHE et al. (2007) consiste
à mélangé la f3-carotène (0,5 mg) dans 1 ml de
chloroforme avec 25 uL de l'acide linoléique et 200 mg de Tween-80. Le
chloroforme est évaporé à 40 C°. 100 ml
d'eau distillée saturée avec de l'oxygène est lentement
ajouté au résidu et la solution est agitée vigoureusement
pour former une émulsion stable. 4 ml de ce mélange est
ajouté dans les tubes à essai contenant 200 uL de
l'échantillon préparé dans le méthanol à des
concentrations finales (25, 50, 100, 200 et 400 ug / ml). Dès que la
solution émulsionnée est ajouté aux tubes, l'absorbance de
temps 0 est mesuré à 470 nm. Les tubes sont
30
Chapitre II- Méthode d'étude d'activité des
antioxydants des plantes médicinales
incubés pendant 2 heures à 50
C°. La vitamine C peut être utilisé comme standard
(NUR ALAM et al., 2013).
L'activité antioxydant est calculée en
pourcentage d'inhibition (I %) par rapport au témoin en utilisant
l'équation suivante:
I% = [1- (As-As120)/ (Ac-Ac120)]
As : Absorbance initiale de l'échantillon.
As120: Absorbance de l'échantillon à 120 min.
Ac : Absorbance initiale du témoin négatif.
Ac120: Absorbance du témoins négatif à 120
min (NUR ALAM et al., 2013).
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