à‰tude de la relation entre des bactéries legionella et des amibes isolées d'un écosystème aquatique à Marrakech.

I-7. Étude de l'état viable non cultivable de Legionella pneumophila

Pour comparer l'effet de la température sur la souche bactérienne de Legionella pneumophila sérogroupe1, nous avons appliqué des traitements de 1 heure et une gamme de températures correspondant à 50 ; 54 ; 58 et 62°C. Après le choc thermique les cellules ont été placées plusieurs jours à 25°C dans un milieu pauvre en nutriments constitué de BYE dilué au millième appelé milieu de repos. L'étude de la viabilité des échantillons traités et non traités, a été effectuée par test de cultivabilité sur milieu de culture solide.

I-7-1. Traitement thermique

Les bactéries en phase stationnaire (5 jours, bouillon BYE) ont été collectées par centrifugation, lavées deux fois avec de l'eau distillée stérile puis remis en suspension dans de l'eau distillée stérile de façon à obtenir une suspension ayant une _DO600nm de 1 correspond environ à une concentration de 10⁹ bactéries/ml. 40 ml de cette suspension sont ensuite incubées pendant 1 heure, sous agitation, dans des bains-marie à des températures comprises entre 50 et 62°C. Après traitement, les cellules sont récupérées par centrifugation (5 000 trm, 10 min, 4°C),

remises en suspension dans le milieu BYE dilué aux 1000^eme puis incubées à
25°C pendant plusieurs jours. L'impact du traitement thermique et la survie des légionelles sont estimés par observation de la cultivabilité sur milieu BCYE solide.

I-7-2. Étude de la viabilité des cellules

+ Dénombrement des bactéries non cultivables

100 ul de chaque suspension bactérienne traitée diluée ont été étalés sur la gélose BCYE en duplicata. La souche a été ensuite incubée à 37°C dans l'étuve et les colonies formées sont comptées après 4 à 10 jours.

Etude de la relation entre des bactéries Legionella et des amibes 13

Chapitre 2: Matériel et méthodes

+ Infection des souches amibiennes

Afin de déterminer si les bactéries viables non cultivables sont capables de retrouver leur cultivabilité, nous avons décidé d'infecter les amibes. Pour cela, 0,5 ml de suspension bactérienne de Legionella pneumophila à une concentration de l'ordre de 10⁸ bactéries /ml traitées par la chaleur et non cultivables, ont été mises en présence de 3 ml de suspension d'amibes (souche 2) à une concentration de 8.10⁴ amibes/ml dans des tubes de culture cellulaire. 0,4 ml de la suspension de Legionella pneumophila sont mis en présence de 3 ml de suspension d'amibes (souche 1) à 6.10⁴ amibes/ml. Ces concentrations ont été choisies de façon à avoir un MOI de 200. Les co-culture sont ensuite incubées à 37°C pendant 3 jours. Un contrôle positif a été réalisé en incubant 50 ul d'une suspension de légionelles viables et cultivables à

10⁸ UFC/ml avec 3 ml de suspension d'amibes à 6.10⁵ amibes/ml et/ou à
8.10⁵ amibes/ml selon les souches. Cette culture a été incubée de la même façon que les tests précédents. Après incubation, 500 ul des co-culture sont centrifugées pendant 5 min à 12000g puis vortex pendant 1 min pour favoriser la lyse des amibes. 100 ul de cette suspension est étalée sur milieu BCYE en duplicata, puis incubée à 37°C pendant 6 à 10 jours.