II-2-2-3- Diagnostic mycologique
II-2-2-3-1- Prélèvement
C'est une étape essentielle qui conditionne par sa
qualité la valeur des résultats. Il faut toujours avoir à
l'esprit que les espèces du genre Candida sont très
sensibles à la dessiccation.
Le prélèvement se fait toujours avec un
matériel stérile.
II-2-2-3-2- Examen direct
Il doit être réalisé immédiatement
après le prélèvement. Il permet d'affirmer
précocement le caractère pathogène de la levure
observée.
Il peut se faire sur des prélèvements solides ou
des frottis colorés.
Les levures sont GRAM+. La coloration de May-Grunwald Giemsa
(M.G.G.) permettant d'étudier la cytologie associée au
champignon, aide au diagnostic. En effet, la présence de nombreux
polynucléaires dans un liquide biologique à côté de
levures et de filaments est un bon argument en faveur de
pathogénicité.
II-2-2-3-3- La culture
L'Ensemencement est réalisé sur deux tubes
(qu'il ne faut pas boucher à fond)
- Un milieu de SABOURAUD additionné d'un antibiotique
bactérien (chloramphénicol ou gentamycine).
- Un milieu de SABOURAUD additionné d'un antibiotique
bactérien et de cycloheximide qui inhibe les moisissures.
Les prélèvements d'origine superficielle sont
placés à l'étuve à 26° C et ceux des muqueuses
ou des organes profonds à 37° C.
Après 24 à 48 heures, on observe des colonies
levuriformes; c'est-à dire crèmeuses, blanchâtres,
luisantes, sauf pour Candida krusei dont les colonies sont mates.
* Identification de Candida albicans: le test
de BLASTESE (test de TASCHDJIAN ou test de filamentation).
Microscopiquement il est impossible d'identifier les levures
en bourgeonnement. Pour l'identification de Candida albicans on
procède de la manière suivante:
Une suspension homogène d'une colonie de levures
obtenues sur milieu de SABOURAUD est réalisée dans 0,5 ml de
sérum humain ou animal. Après 3 heures d'incubation à
37° C, une goutte de cette suspension est examinée au microscope.
Le test est positif si environ 50% des levures présentent un "tube de
germination" (et non un bourgeonnement) flexueux dont la longueur atteint au
moins trois fois celle du diamètre de la levure.
- On peut aussi rechercher des chlamydospores sur milieu
pauvre RAT (riz, agar, Tween) ou milieu PCB (pomme de terre, carotte, bile) en
24 à 48 heures.
Levures
Candida Candida
albicans
filamentant sur RAT ou PCB
sur RAT ou PCB
Figure 2: Morphologie
des levures du genre Candida
* Identification des autres espèces de
Candida
Dans ce cas on utilise des critères nutritionnels et
biochimiques, en particulier l'assimilation des sucres (auxanogramme) et leur
fermentation (zymogramme).
On utilise également la sensibilité de la souche
à l'actidione et la réduction des sels de tétrazolium.
* Antifongigramme
Ce test consiste à déposer à la surface
de la gélose d'une boîte de pétri des disques de papier
buvard imprégnés des différents antifongiques à
évaluer. Chacun diffuse au sein de la gélose à partir du
disque et y détermine des concentrations inversement proportionnelles
à la distance du disque.
Pour chaque antifongique on mesure le diamètre de la
zone d'inhibition avec un pied à coulisse, une règle
graduée ou un compas.
Notion de concentration minimale inhibitrice
(CMI)
La CMI permet de définir la sensibilité ou la
résistance des souches de champignons vis à vis des
différents antifongiques. C'est la plus faible concentration
d'antifongique capable d'inhiber dans un milieu toute culture de la souche
étudiée.
En fonction de la valeur brute de la CMI, ou de la valeur du
diamètre de la zone d'inhibition, les souches peuvent être
classées en:
- sensibles,
- résistantes
- ou intermédiaires.
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Tableau 1: Interprétation des
mesures
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Antifongiques
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Diamètre de la zone d'inhibition en
mm
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CMI
en ug/ml
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Interprétation (a,b) pour les
levures
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5-Fluorocytosine *
(1ug)
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20
20- 10
10
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1,56
1, 56- 25
25
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Sensible
Intermédiaire
Résistant
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Amphotéricine B
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10
10
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1
1
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Sensible
Intermédiaire ou
résistant
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Nystatine
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10
10
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Sensible
Résistant
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Imidazoles**
(Econazole, Clotrimazole, Miconazole, Kétoconazole)
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20
20-10
10
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1,56
1,56- 6,4
6,4
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Sensible
Intermédiaire
Résistant
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5-Fluorocytosine
1ug
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10
10
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Pour A. fumigatus
Sensible
Intermédiaire ou résistant
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5-fluorocytosine
10ug
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10
10
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Sensible ou intermédiaire
Résistant
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Légende:
*: les colonies retrouvées dans la zone d'inhibition
de la 5-Fluorocytosine appartiennent à des souches
résistantes.
**: pour les dérivés d'imidazole,
l'évaluation est parfois difficile. Certaines souches présentent
deux zones d'inhibition:
- une grande zone,
- une zone plus réduite avec de petites colonies
qui n'apparaissent pas résistantes lorsqu'on évalue à
nouveau leur sensibilité; la croissance de ces petites colonies est
observée également lors de la détermination des CMI.
a) Résultats obtenus avec Candida albicans et
autres champignons levuriformes.
b) Souches sensibles, intermédiaires ou
résistantes par rapport aux taux sériques obtenus avec les
posologies usuelles par voie orale ou intraveineuse.
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