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Expression d'une protéine non structurale du virus de l'hépatite


par Nacima AIDOUD
UFR Sciences et techniques Tours - Master 1 ICMV 2008
  

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UNIVERSITE FRANCOIS RABELAIS

TOURS

 

RAPPORT DE STAGE DE MASTER 1
INFECTIOLOGIE CELLULAIRE ET MOLECULAIRE, VACCINOLOGIE

Mémoire présenté par AIDOUD Nacima

Expression d'une protéine non structurale du virus de l'hépatite
C (la NS4B) en système dérivé du virus de la Forêt de Semliki et
étude de son implication dans la formation du membranous web

Travail réalisé au laboratoire de recherche sur les virus et pseudovirus :
Morphogenèse et Antigénicité
ERI 19 CHRU Bretonneau TOURS

Sous la direction de Dr BLANCHARD Emmanuelle Dr ROINGEARD Philippe

Année Universitaire 2007-2008

_Remerciements

J'adresse tout d'abordma reconnaissance d _Philipe _ROIW~_T~_RD et _Tmmanuelle 11W 9~_RD pour m'avoir accueillie dans le laboratoire et m'avoir con#iée cepro%et:

Je remercie du fonddu coeur toute l'$quipe _T_RI ig, pour leur soutien et leur disponibilité ainsi quepour leur attentionparticulière portée d monpro%et:

Merci d'avoir cru en moi et de m'avoir_aitpartager cet engouement acharnepour la recherche:

SOMMAIRE

INTRODUCTION

A. Virus de l'hépatite C p.1

a) Structure et organisation du génome viral

b) Les protéines virales

B. Objectif du travail de recherche p.3

MATERIEL ET METHODES p.4

A. Construction plasmidique en système pSFV p.4

a) Le système d'expression pSFV

b) Les constructions vectorielles

B. Amplification des vecteurs d'expression recombinants p.5

a) Transformation bactérienne

b) Maxipréparation classique et vérification des clones recombinants

C. Transcription in vitro et transféction des ARNs p.6

a) Linéarisation des vecteurs recombinants par SpeI

b) Transcription in vitro des vecteurs linéarisés

c) Culture cellulaire des BHK2 1

d) Transféction des BHK21 par électroporation

D. Expression de la protéine NS4B ...p.7

a) Immunofluorescence des BHK-21 transfectées

b) Western Blot sur les lysats BHK-2 1 transfectées c)Microscopie Electronique des cellules BHK-2 1 transfectées

RESULTATS p.9

A. Linéarisation . p.9

B. Transcription in vitro p.9

C. Immunofluorescence . p.10

D. Western blotting p.11

E. Microscopie Electronique .. p.12

DISCUSSION p.12

BIBLIOGRAPHIE

INTRODUCTION

L'existence d'un nouveau virus responsable de 90% des hépatites post-transfusionnelles dites « non-A, non-B » fut soupçonnée dès les années 70. Grâce à l'essor des technologies de biologie moléculaire, le virus de l'hépatite C (VHC) a pu être caractérisé en 1989 suite au clonage et séquençage de l'intégralité de son génome (Choo et al, 1989) [1]. L'infection par le VHC représente un intérêt médical majeur puisque 170 millions de personnes à travers le monde et environ 600 000 en France, sont des porteurs chroniques de ce virus. Dans la majorité des cas, cette infection chronique conduit à des complications hépatiques sévères, pouvant évoluer vers une cirrhose associée au développement d'un hépatocarcinome. Les perspectives de vaccin sont lointaines, les thérapies anti-virales utilisées actuellement ont une efficacité limitée.

Bien que le VHC ait été identifié depuis près de 20 ans et que son génome et ses protéines soient désormais bien connus, le cycle infectieux de ce virus reste encore énigmatique par bien des aspects. Ceci résulte principalement de la difficulté, jusqu'à très récemment, de propager le VHC sur des systèmes de culture cellulaire in vitro. Finalement, l'année 2005 aura été un tournant dans la recherche sur le VHC, avec la mise au point du modèle du virus JFH-1 permettant de reproduire, pour la première fois, un cycle infectieux complet du VHC in vitro (Wakita et al., 2005) [2]. Ce clone JFH-1 a été isolé chez un patient atteint d'une hépatite C fulminante, de génotype 2a.

A- LE VIRUS DE L'HEPATITE C

a Structure et organisation du génome viral

Le VHC est un virus appartenant à la famille des Flaviviridae et au genre hepacivirus dont il est le seul membre. Si le génome et les protéines du VHC sont connus depuis plusieurs années, la structure et la morphogenèse des particules virales demeurent encore hypothétiques. Cet échec s'explique d'abord par la difficulté à visualiser avec certitude les particules virales dans le sérum ou dans des biopsies hépatiques de patients infectés chroniquement par le VHC. Par analogie avec d'autres virus de la même famille, le VHC est un petit virus enveloppé de 50 à 60 nm de diamètre avec un génome ARN de polarité positive d'environ 9500 nucléotides (nt) contenu dans une capside protéique de symétrie icosaédrique entourée d'une enveloppe lipidique empreintée à la cellule hôte dans laquelle sont enchassées les glycoprotéines d'enveloppe virale (Figure 1). Le génome est constitué par un cadre unique de lecture ouvert encadré de deux régions non codantes (NC) aux extrémités 5' et 3 'intervenant respectivement dans la réplication et dans la stabilisation du génome viral lors de sa réplication.

Glycoprotéines d'enveloppe E1/E2 hétérodimériques

Couche lipidique externe

Couche lipidique interne Enveloppe

Capside protéique icosaédrique

ARN génomique monocaténaire de polarité positive (ARN+)

Figure 1 : Représentation schématique de la structure du VHC

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