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UNIVERSITE FRANCOIS RABELAIS
TOURS
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RAPPORT DE STAGE DE MASTER 1
INFECTIOLOGIE CELLULAIRE ET
MOLECULAIRE, VACCINOLOGIE
Mémoire présenté par AIDOUD Nacima
Expression d'une protéine non structurale du
virus de l'hépatite
C (la NS4B) en système
dérivé du virus de la Forêt de Semliki et
étude
de son implication dans la formation du membranous web
Travail réalisé au laboratoire de recherche sur
les virus et pseudovirus :
Morphogenèse et
Antigénicité
ERI 19 CHRU Bretonneau TOURS
Sous la direction de Dr BLANCHARD Emmanuelle Dr ROINGEARD
Philippe
Année Universitaire 2007-2008
_Remerciements
J'adresse tout d'abordma reconnaissance d _Philipe
_ROIW~_T~_RD et _Tmmanuelle 11W 9~_RD pour m'avoir accueillie dans le
laboratoire et m'avoir con#iée cepro%et:
Je remercie du fonddu coeur toute l'$quipe _T_RI ig, pour
leur soutien et leur disponibilité ainsi quepour leur
attentionparticulière portée d monpro%et:
Merci d'avoir cru en moi et de m'avoir_aitpartager cet
engouement acharnepour la recherche:
SOMMAIRE
INTRODUCTION
A. Virus de l'hépatite C p.1
a) Structure et organisation du génome viral
b) Les protéines virales
B. Objectif du travail de recherche p.3
MATERIEL ET METHODES p.4
A. Construction plasmidique en système pSFV p.4
a) Le système d'expression pSFV
b) Les constructions vectorielles
B. Amplification des vecteurs d'expression recombinants p.5
a) Transformation bactérienne
b) Maxipréparation classique et vérification des
clones recombinants
C. Transcription in vitro et transféction des
ARNs p.6
a) Linéarisation des vecteurs recombinants par
SpeI
b) Transcription in vitro des vecteurs
linéarisés
c) Culture cellulaire des BHK2 1
d) Transféction des BHK21 par électroporation
D. Expression de la protéine NS4B ...p.7
a) Immunofluorescence des BHK-21 transfectées
b) Western Blot sur les lysats BHK-2 1 transfectées
c)Microscopie Electronique des cellules BHK-2 1 transfectées
RESULTATS p.9
A. Linéarisation . p.9
B. Transcription in vitro p.9
C. Immunofluorescence . p.10
D. Western blotting p.11
E. Microscopie Electronique .. p.12
DISCUSSION p.12
BIBLIOGRAPHIE
INTRODUCTION
L'existence d'un nouveau virus responsable de 90% des
hépatites post-transfusionnelles dites « non-A, non-B » fut
soupçonnée dès les années 70. Grâce à
l'essor des technologies de biologie moléculaire, le virus de
l'hépatite C (VHC) a pu être caractérisé en 1989
suite au clonage et séquençage de l'intégralité de
son génome (Choo et al, 1989) [1]. L'infection par le VHC
représente un intérêt médical majeur puisque 170
millions de personnes à travers le monde et environ 600 000 en France,
sont des porteurs chroniques de ce virus. Dans la majorité des cas,
cette infection chronique conduit à des complications hépatiques
sévères, pouvant évoluer vers une cirrhose associée
au développement d'un hépatocarcinome. Les perspectives de vaccin
sont lointaines, les thérapies anti-virales utilisées
actuellement ont une efficacité limitée.
Bien que le VHC ait été identifié depuis
près de 20 ans et que son génome et ses protéines soient
désormais bien connus, le cycle infectieux de ce virus reste encore
énigmatique par bien des aspects. Ceci résulte principalement de
la difficulté, jusqu'à très récemment, de propager
le VHC sur des systèmes de culture cellulaire in vitro.
Finalement, l'année 2005 aura été un tournant dans la
recherche sur le VHC, avec la mise au point du modèle du virus JFH-1
permettant de reproduire, pour la première fois, un cycle infectieux
complet du VHC in vitro (Wakita et al., 2005) [2]. Ce clone JFH-1 a
été isolé chez un patient atteint d'une hépatite C
fulminante, de génotype 2a.
A- LE VIRUS DE L'HEPATITE C
a Structure et organisation du génome viral
Le VHC est un virus appartenant à la famille des
Flaviviridae et au genre hepacivirus dont il est le seul
membre. Si le génome et les protéines du VHC sont connus depuis
plusieurs années, la structure et la morphogenèse des particules
virales demeurent encore hypothétiques. Cet échec s'explique
d'abord par la difficulté à visualiser avec certitude les
particules virales dans le sérum ou dans des biopsies hépatiques
de patients infectés chroniquement par le VHC. Par analogie avec
d'autres virus de la même famille, le VHC est un petit virus
enveloppé de 50 à 60 nm de diamètre avec un génome
ARN de polarité positive d'environ 9500 nucléotides (nt) contenu
dans une capside protéique de symétrie icosaédrique
entourée d'une enveloppe lipidique empreintée à la cellule
hôte dans laquelle sont enchassées les glycoprotéines
d'enveloppe virale (Figure 1). Le génome est constitué par un
cadre unique de lecture ouvert encadré de deux régions non
codantes (NC) aux extrémités 5' et 3 'intervenant respectivement
dans la réplication et dans la stabilisation du génome viral lors
de sa réplication.
Glycoprotéines d'enveloppe E1/E2
hétérodimériques
Couche lipidique externe
Couche lipidique interne Enveloppe
Capside protéique icosaédrique
ARN génomique monocaténaire de polarité
positive (ARN+)
Figure 1 : Représentation
schématique de la structure du VHC
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