Memoire Online - Expression d'une protéine non structurale du virus de l'hépatite

La traduction de l'ARN génomique via le cadre unique de lecture aboutit à la synthèse d'une polyprotéine précurseur clivée en protéines structurales et non structurales par les protéases cellulaires et virales, respectivement (cf Figure 2). Les protéines structurales situées dans le premier tiers N-terminal de la polyprotéine précurseur comprennent la capside qui s'autoassemble pour former la nucléocapside et les glycoprotéines d'enveloppe E1 et E2, impliquées dans la reconnaissance cellule-virus. Les protéines structurales et non structurales sont séparées par une petite protéine p7 encore mal connue, soupçonnée jouer le rôle de canal calcique. A l'extrémité C-terminale, se trouvent les protéines non structurales (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A et NS5B) qui interviennent dans la réplication du virus. La protéine NS2 (associée à la protéine NS3 a une fonction d'autoprotéase, responsable de la coupure NS2/NS3. La protéine NS3 possède deux fonctions : (i) une activité protéase à sérine qui associée au co-facteur NS4A (dont le rôle va être de stabiliser cette enzyme) est impliquée dans le clivage NS3/NS4A et NS4B/NS5A et (ii) une activité hélicase/NTPase permettant à l'ARN viral d'adopter une conformation stable pour sa réplication. NS4B reste une protéine encore mal caractérisée. La région NS5 code deux protéines : NS5A qui est une phosphoprotéine et NS5B qui est responsable de la réplication de l'ARN viral avec une activité ARN polymérase ARN dépendante.

capside recrutement de l 'ARN	protéines d'enveloppe	?	protéase à ser NTPase hélicase	Formation du membranous web ?	ARN polymérase ARN-dépendante

B- OBJECTIF DU TRAVAIL DE RECHERCHE

L'étude du cycle infectieux du VHC a longtemps été considérablement limitée par l'absence de système de culture de ce virus in vitro. Toutefois, il est généralement admis que dans les cellules répliquant le VHC, une partie de ces protéines non structurales s'organisent entre elles pour constituer un complexe multiprotéique appelé complexe de réplication. De plus, une des principales caractéristiques des virus à ARN positif, en plus de contenir un ARN messager simple brin dans leur particule virale, est l'association de ce complexe de réplication avec des cytomembranes cellulaires qui se réarrangent au cours de l'infection, en structure vésiculaire. De telles membranes, hébergeant vraisemblablement le complexe de réplication du génome viral, ont été mises en évidence dans des coupes de cellules (Egger et al, 2002 [3] ; Gosert et al, 2003 [4]), mais ces structures définies sous le terme de membranous web sont encore mal caractérisées. Des études préalables dans un contexte autre que le JFH1 ont proposé que la protéine NS4B, une protéine exclusivement membranaire, pourrait jouer un rôle majeur dans la formation de ce membranous web (Egger et al., 2002 [3]).

Dans ce contexte, l'équipe ERI 19 avait choisi de cloner et exprimer la protéine NS4B seule, issue du clone JFH-1, à l'aide d'un vecteur d'expression original et puissant, dérivé des propriétés de réplication du virus de la forêt de Semliki (SFV).

Ainsi l'objectif de mon travail consistait à essayer d'exprimer la protéine NS4B issue du clone JFH-1, munie d'une étiquette hémagglutinine (HA) en système SFV. En effet, il n'existe pas d'anticorps disponible dirigé contre la protéine NS4B de la souche JFH-1. L'expression des cellules transfectées avec les ARN recombinants codant la protéine NS4B a été analysée par western blotting et immunofluorescence à l'aide d'un anticorps anti-HA. Des coupes de cellules transfectées ont également été réalisées et observées en ME, dans le but de mieux comprendre le

rôle putatif de la protéine NS4B dans le mécanisme de remaniement membranaire observé lors de la morphogenèse du complexe de réplication.

Expression d'une protéine non structurale du virus de l'hépatite

b. Les protéines virales

B- OBJECTIF DU TRAVAIL DE RECHERCHE