C- Transcription in vitro et transfection des ARNs
a. Linéarisation des vecteurs
Dix microgrammes de plasmide pSFV recombinant ont
été linéarisés avec 50 unités d'enzymes
SpeI pendant 90 minutes à 37°C sous un volume
réactionnel de 100 j.iL. L'ADN linéaire a été
purifié par extraction au phénol-chloroforme, suivi d'une
précipitation à l'éthanol et après séchage
le culot d'ADN a été solubilisé dans 40 j.iL d'eau
stérile. La linéarisation a été
vérifiée grâce à migration
électrophorétique en gel d'agarose 1% en tampon Tris
Acétate/ EDTA (Tris/acétate 40 mM, EDTA 1mM) contenant 0,5 j.ig
de bromure d'éthidium (BET). L'utilisation de SpeI s'explique
par le fait qu'elle possède un site de restriction unique dans le pSFV
en aval du site multiple de clonage.
b. Transcription in vitro des vecteurs d'expression
linéarisés par SpeI
Un microgramme d'ADN linéaire a été
transcrit in vitro lors d'une incubation pendant 90 minutes à
40°C, dans un milieu réactionnel de 60 j.iL contenant 1 mM d'un
mélange de rNTP (Biolabs), 1 mM d'analogue de coiffe m7G(5)ppp(5')G
(Biolabs), 90 unités d'inhibiteur de
ribonucléase (Rnasin, Biolabs) et 72 unités de
SP6 RNA polymérase (Biolabs). Après transcription, la
qualité de l'ARN a été vérifiée sur gel
d'agarose. L'ARN a été aliquoté sous 27 j.iL et
conservé à -80°C jusqu'à son utilisation.
c. Culture Cellulaire des BHK21
Les cellules BHK-21 (Baby Hamster Kidney) ont
été utilisées en raison de l'efficacité de
transfection par électroporation obtenue avec ces cellules qui sont
habituellement utilisées avec le système d'expression SFV. Elles
ont été cultivées à 37°C sous 5% de CO2 en
milieu GMEM (Invitrogen) supplémenté avec 5% de sérum de
veau foetal décomplémenté (ATGC), 12% de tryptose
phosphate (Sigma) et 1% de pénicilline/streptomycine (Invitrogen).
d. Transfection des cellules BHK-21 par
électroporation,
A confluence du tapis cellulaire, les cellules BHK-2 1 ont
été trypsinées, lavées au PBS et
centrifugées 10 minutes à 200 g puis resuspendues dans du tampon
PBS à la concentration de 12. 106 cellules/mL. La
transfection a été effectuée en transférant 1 mL de
la suspension cellulaire en présence de 27 j.iL d'ARN SFV dans une
cuvette d'électroporation. L'électroporation a été
réalisée par impulsion électrique de 3 50V, 750 j.iF. Les
cellules ainsi transfectées ont été rapidement mises en
culture pendant 16h à 37°C sous 5% de CO2 dans une flasque T75
(Falcon) et 15 mL de milieu GMEM complet.
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