Expression d'une protéine non structurale du virus de l'hépatite

D- Expression de la protéine NS4B

a. Immunofluorescence des cellules BHK-21 transfectées

Vingt heures post transfection, les cellules BHK-21 ont été trypsinées, lavées au PBS, comptées et reprises dans du PBS contenant 10% de sérum de veau foetal, à raison de 2,5.10⁵ cellules/mL. Cent microlitres de cette suspension cellulaire ont été déposés dans une cupule et cytocentrifugés sur des lames (Cytospin 3, Shandon) pendant 5 minutes à 250 g. Après séchage et fixation, les lames ont été fixées dans un bain d'acétone à -20°C pendant 10 minutes, les cellules transfectées avec les constructions pSFV-NS4B, -NS4B/HA et SFV-âgal, ont été incubées en chambre humide pendant 30 min avec 40 j.iL d'un anticorps monoclonal de rat anti-HA (Sigma) dilué au 1/250e en PBS. Les cellules transfectées avec la construction pSFV-C191 ont été incubées avec un anticorps monoclonal murin anti-capside (C7-50, Abcam) dilué au 1/200^e en PBS. Après trois lavages de 10 min dans du PBS, les cellules ont été incubées comme précédemment avec 40 j.iL d'un anticorps secondaire de chèvre anti-rat ou chèvre anti-souris conjugué à l'Alexa Fluor 488 (molecular Probes^®) dilué au 1/1000^e. Après trois nouveaux lavages, les lames ont été montées en milieu PVA/DABCO (25 mM Tris/HCl 1.5M [pH 8.8],

glycérol 5%, DABCO 2,5%, alcool polyvinylique (PVA) 10%), puis observées au microscope confocal à balayage (Microscope Confocal à Balayage Laser, Olympus).

b. Western-blot des lysats des cellules BHK-21 transfectées

Après transfection, les cellules BHK-2 1 ont été trypsinées, lavées au PBS, et lysées avec 1 mL de tampon de lyse (Tris/HCl 10 mM, NaCl 140 mM, igépal 1%) supplémenté avec des inhibiteurs de protéases (phénylméthylsulfonyl fluoride (PMSF) 1mM, aprotinine et leupeptine 2 ìg/mL). Vingt microgrammes de protéines contenues dans les lysats cellulaires ont été précipitées et soumises à une électrophorèse en gel d'acrylamide 12% (Euromedex) pendant 1h30 à 20 mA (Mini Protean III, BioRad), suivies d'un transfert actif (Mini Trans-Blot Cell, BioRad) en tampon TG/éthanol(Tris 0.25M, Glycine 1 .92M, éthanol 20%) sur une membrane de nitrocellulose (Hybond-C Extra, Amersham Biosciences) durant 1h30 à 90V. Cette membrane a ensuite été saturée pendant 45 minutes en tampon TBS (Tris-HCl 50 mM [pH8] NaCl 150mM, igépal 0.1%) contenant 5% de lait en poudre. Ensuite, la membrane a été incubée en présence d'un anticorps monoclonal de rat anti-HA ou de souris anti-actine (AC-15, Sigma) dilués au 1/5000^e ou d'un anticorps monoclonal humain anti-capside (B12F8, fourni par le Dr Mondelli, Université de Rome, Italie) dilué au 1/2000^e, pendant un nuit à 4°C. Après 3 lavages de 10 minutes en tampon TBS, la membrane a été incubée durant une heure, à température ambiante et sous agitation douce, avec un anticorps secondaire couplé à la peroxydase (anti-rat, -souris et -humain, Biosource) dilués au 1/10 000^e en tampon de blocage. Enfin, après 2 lavages de 10 minutes et un lavage de 20 minutes en tampon TBS, la révélation a été réalisée avec un système de détection chimioluminescent ECL (Pierce) et le signal a été transféré sur un film d'autoradiographie (Pierce).

c. Microscopie électronique des cellules BHK-21 transfectées

Un tapis cellulaire d'une flasque T75 de cellules BHK-2 1 transfectées a été directement fixé dans la flasque par ajout de 5 ml d'un tampon tampon phosphate 0,1 M [pH 7.2] (Sigma) contenant 4% de paraformaldéhyde et 1% de glutaraldéhyde, et les cellules ont ainsi été incubées pendant 48 heures à 4°C. Après un rinçage en tampon phosphate 0,15 M, les cellules ont été post- fixées à l'aide de tétroxyde d'osmium 1% en tampon phosphate 0,3 M pendant 1 heure, avant d'être déshydratées par trempage dans des bains d'éthanol de titres croissants. Après un lavage dans l'oxyde de propylène, les cellules ont été incluses dans un mélange oxyde de propylènerésine/Epon, et incubées 24 heures à 60°C pour permettre la polymérisation de la résine. Les coupes ultra-fines de blocs ont été réalisées à l'aide d'un ultramicrotome (Reichert Scientific Instruments), et contrastées à l'acétate d'uranyl et au citrate de plomb, avant d'être observées en microscopie électronique à transmission (MET) (Jeol 1230, Jeol).

Marqueur de taille
(Pb)

10 000
8 000
6 000

5 000

4 000

Figure a. Migration électrophorétique sur gel d'agarose (1%BET)
des vecteurs d'expression linéarisés

Figure b : Migration électrophorétique sur gel d'agarose 1% (+BET) des vecteurs d'expression transcrits