RESULTATS
L'objectif de ce travail était d'étudier le
rôle potentiel de la protéine NS4B de la souche JFH-1 dans la
formation des remaniements membranaires viro-induits. Cette protéine a
été sortie du contexte de la polyprotéine et a
été exprimée de façon isolée. Deux
constructions, l'une correspondante à la protéine NS4B seule et
l'autre correspondante à cette protéine accompagnée d'une
étiquette HA, ont été exprimées en système
SFV.
A- Linéarisation
La vérification sur gel d'agarose des constructions
après linéarisation par SpeI (Figure a.) mettent en
évidence une bande à 12 000 pb environ pour pSFV-NS4B et
pSFV-NS4B/HA (qui en théorie font respectivement 11 869 pb et 11 893
pb); pour pSFV-â-gal une bande à 13 000 pb (13 078 pb en
théorie) et 11 000 pb pour pSFV-C 191 (11 572 pb). La
linéarisation effectuée avec SpeI a été
optimale puisque non seulement les résultats obtenus sur gel d'agarose
corrèlent avec les résultats théoriques mais surtout parce
nous ne trouvons qu'une seule bande.
B- Transcription in vitro
La transcription a été réalisée
grâce à une polymérase SP6 permettant d'aboutir à la
synthèse d'ARN recombinant. Après transcription in
vitro, les ARN obtenus ont été vérifiés
qualitativement par migration sur gel d'agarose afin de s'affranchir d'une
éventuelle dégradation de ces ARN. Le profil de migration des ARN
a permis de confirmer l'intégrité de ces derniers (figure b).
C- Immunoflorescence
Afin de contrôler l'efficacité de transfection
des cellules BHK-21, l'expression des protéines d'intérêts
a été évaluée par immunocytochimie. Les cellules
exprimant les constructions pSFV-NS4B/HA, pSFV-NS4B et pSFV-âgal ont
été soumises à une réaction immunocytochimique
à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-HA. Les cellules exprimant la
construction, pSFV-C191 ont elles été testée à
l'aide d'un anticorps monoclonal anti-capside. La détection de la
protéine de capside du VHC dans les cellules transfectées avec la
construction contrôle pSFV-C 191 (figure c) montre que les transfections
ont été efficaces. La protéine de capside est
présente à un haut niveau dans plus de 70% des cellules. La
réaction d'immunofluorescence avec l'anti-HA a
révélé également un haut niveau d'expression de la
protéine NS4B/HA dans les cellules transfectées par la
construction pSFV-NS4B/HA, avec l'observation d'une fluorescence cytoplasmique
intense (figure c). Cette fluorescence était spécifique puisque
aucun marquage n'a été relevé dans les cellules exprimant
les constructions pSFV-NS4B et pSFV-âgal.
D-
Western Blotting
Après transfection, une partie des cellules BHK-2 1 a
été mise en présence d'un tampon de lyse auquel des
anti-protéases ont été ajoutées. Les lysats
cellulaires ont ensuite été analysés en western-blotting.
Chaque lysat a été soumis à une migration en SDS/PAGE et
transféré sur membrane de nitrocellulose. La présence des
protéines d'intérêts a été mise en
évidence par incubation d'anticorps monoclonal anti-HA, anti-capside ou
anti-actine, suivis d'anticorps secondaires adaptés marqués
à la péroxydase. Les résultats montrent une expression
similaire de l'actine dans toutes les pistes, permettant ainsi de valider
l'analyse (Figure c). En effet, l'actine est une protéine cellulaire
ubiquitaire, et sert de contrôle pour vérifier que tous les puits
ont été chargés en protéines de manière
équitable. La protéine NS4B-HA a été bien
détectée via l'étiquette HA avec une bande à une
taille attendue de 30 kDa, uniquement pour la construction pSFV-NS4B/HA. De
même, la protéine de capside a été
détectée avec une bande à une taille attendue de 21 kDa,
uniquement pour la construction pSFV-C191. Aucune bande n'a été
observée pour les constructions pSFV-âgal et pSFV-NS4B,
puisqu'elles n'expriment ni la protéine de capside ni une
protéine avec une étiquette HA (Figure d). Ceci confirme bien la
spécificité des anticorps utilisés pour ces
réactions.
Lysat cellulaire issu des BHK21 Transfectées
par les ARN
Anti-actine
anti-HA
Anti-C191
Anti-E 1
Anti-E2
40 KDa
30 KDa
21 KDa
Figure d : Western Blotting sur les lysats cellulaires
( 20 ng des protéines totales) issues des BHK21 transfectées par
les vecteurs d'expression.
E- Microscopie électronique
Après avoir vérifié l'expression des
protéines, le culot cellulaire de chaque construction pSFV-NS4B,
pSFV-NS4B/HA, PSFV-C191 et pSFV-âgal ont été inclus en
résine et des coupes ultra-fines de blocs ont été
réalisées à l'aide d'un ultramicrotome. Les observations
en microscopie électronique des différentes constructions sont
actuellement en cours d'analyse. En
effet, cette technique d'inclusion en résine et l'analyse
fine qui en découle nécessite environ trois semaines de
travail.
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