DISCUSSION
L'absence de système de culture in vitro
efficace durant plus de 15 ans a nécessité le
développement d'outils mimant la structure du virions ou la
réplication virale pour étudier les différentes phases du
cycle infectieux du VHC. Différentes équipes se sont notamment
intéressées à développer un modèle de «
réplicon subgénomique » du VHC permettant une
réplication stable d'ARN subgénomique du VHC dans des cellules en
culture (Lohmann et al., 1999 [5]). Ce réplicon, unité minimale
de réplication, constitué par un génome viral où
les protéines structurales sont délétées et
remplacées par un gène de résistance à la
néomycine a été un formidable outil pour l'étude de
la réplication virale et l'évaluation d'inhibiteurs potentiels de
cette réplication (Bartenschlager, J Hepatol 2005 [6]). Cependant, ce
modèle de réplicon ne permet pas de former des particules virales
(puisque les protéines structurales ne sont pas exprimées) et ne
reflète que partiellement la réplication du vrai virus. Ainsi, le
développement du système JFH-1 permettant de
générer de réelles particules virales infectieuses et
réplicatives représente une avancée majeure pour
étudier les étapes clés du cycle infectieux du VHC en
culture cellulaire.
Grâce au modèle réplicon, quelques
études réalisées sur des coupes de cellules
analysées en MET ont suggéré que la réplication du
VHC pouvait induire des remaniements membranaires, qui ont été
appelés membranous web (Egger et al, 2002 [3] &
Gosert et al, 2003 [4]). A l'image de ce qui est connu pour d'autres
virus à ARN positifs (Uchil.P.D et al, 2003 [7]), il a
été suggéré que ces remaniements membranaires
pourraient héberger les complexes de réplication de l'ARN du VHC.
Ces membranous web ont essentiellement été
décrits avec les premiers modèles d'étude de la
réplication du VHC, basés sur des réplicons
subgénomiques d'un génotype particulier 1b. De plus, une
étude a suggéré que la protéine NS4B était
à l'origine de la formation des membranous web dans des
cellules hébergeant un réplicon de type 1b (Egger et al, 2002
[3]). Avec l'avènement du modèle du clone JFH-1 (Wakita et
al, 2005 [2]), il était donc pertinent de s'intéresser plus
particulièrement à l'expression de cette seule protéine
issue d'un génotype 2a. Nous avons réussi à obtenir des
cellules qui expriment la protéine NS4B seule ou avec une
étiquette HA. En absence d'anticorps anti-NS4B disponible, cette
étiquette HA nous a permis de visualiser par immunofluorescence le bon
niveau d'expression de cette protéine dans plus de 70% de cellules
transfectées. Par ailleurs, l'électrophorèse suivie d'une
immuno-empreinte des protéines contenues dans le lysat des cellules
transfectées a montré la présence de la protéine
NS4B grâce à l'étiquette HA à la masse
moléculaire attendue de NS4B. En effet, l'épitope HA
représente 9 acides aminés. Il est largement admis qu'un acide
aminé représente environ 110 kDa
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ainsi la masse moléculaire de l'épitope HA est
inférieure 1 kDa. Par ailleurs il serait intéressant de
déterminer si l'expression de la protéine NS4B, après
transfection, permet bien la formation de remaniements membranaires au niveau
des membranes du réticulum endoplasmique. En effet, la protéine
NS4B est totalement ancrée dans la membrane du RE, possédant au
moins quatre passages transmembranaires avec des extrémités N- et
C- terminales localisées dans le cytosol (Hugle et al, 2001
[8], Lundin et al, 2003 [9]). Cette topologie particulière peut
dans un contexte de surexpression de cette protéine induire des
structures renflées et vésiculeuses au niveau de la membrane du
RE comme l'a suggéré Egger et al. L'originalité
de ce travail repose sur l'utilisation du vecteur SFV extrêmement
puissant qui nous a déjà permis d'étudier la
morphogenèse de pseudo-virons du VHC (Blanchard et al., 2002 [10]). Les
analyses de microscopie électronique sont actuellement en cours et
devraient nous permettre de comprendre l'implication de cette protéine
sur l'ultrastructure des cellules.
Pour aller plus loin, l'équipe cherche également
à comprendre la morphogenèse du complexe de réplication en
se focalisant sur la purification et l'analyse structurale de ce complexe. Nous
pensons que l'ensemble de ces travaux vont permettre de mieux comprendre
l'interaction entre les différentes protéines non structurales
entre elles ou entre d'autres partenaires cellulaires dans la formation de ces
complexes de réplication. En effet, l'identification de co-facteurs
cellulaires indispensables pour la réplication du VHC pourrait
favoriser, à terme, la conception de nouvelles stratégies
antivirales contre le VHC ou d'autres virus à ARN+ induisant des
remaniements membranaires.
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