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La nécropole mérovingienne "la chapelle" de Jau-Dignac et Loirac (Garonne): Détermination de liens de parenté par approche paléogénétique


par Diane Thibon
Université de Bordeaux 1 - Master 2 2009
  

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VI Conclusion et perspectives

L'analyse génétique préliminaire de neuf individus issus de trois sarcophages du site de Jau-Dignac et Loirac a permis de mener à bien les objectifs principaux de cette étude qui était de tester la conservation de l'ADN et les contaminations.

Nous avons ainsi mis en évidence une bonne conservation générale de l'ADN chez ces individus. Dans l'ensemble, peu de contaminations ont été observées et les rares retrouvées ne semblent pas provenir des fouilleurs et manipulateurs du laboratoire. Nous pouvons donc affirmer que l'absence de port de gant lors de certains prélèvements n'a pas été reconnue comme geste contaminant dans le cadre de cette étude.

Concernant les résultats obtenus, nous avons trouvé de façon fiable la présence d'ADN authentique mais fragmentaire chez au moins cinq de ces individus (tabl. 9).

La bonne qualité des résultats nous laisse donc envisager la possibilité de poursuivre cette étude de lien de parenté par des analyses complémentaires. Dans cette éventualité, des répétitions (multiples extractions et amplifications) devront être tout d'abord réalisées sur le génome mitochondrial afin d'authentifier les résultats de la présente étude. Par la suite, des analyses portant sur l'ADN nucléaire (STR) pourront être considérés afin de pouvoir repérer d'éventuels liens de parenté paternels et de type parents-enfants.

Toutefois, il convient de signaler que l'analyse des relations de parenté entre vestiges humains anciens reste l'application de la paléogénétique la plus complexe et la plus problématique. En effet, l'obtention de marqueurs hautement informatifs pour les relations familiales (les STR autosomaux) ne reste qu'exceptionnelle sur des restes humains (Gill et al. 1994 ; Keyser-Tracqui et al. 2003 ; Deguilloux et al. 2009). Ceci est lié à une mauvaise conservation du génome nucléaire dans les vestiges anciens, ainsi qu'à la difficulté de leur analyse du fait de la dégradation de l'ADN (problème de « slippage » ou dérapage durant l'amplification de ces séquences répétées). En conséquence, les analyses paléogénétiques ne s'arrêtent souvent qu'à l'information partielle fournie par le génome mitochondrial (Capellini et al. 2004 ; Mooder et al. 2005 ; Rudbeck et al. 2005 ; Deguilloux et al. 2009).

A ce stade des analyses, nous pouvons toutefois apporter quelques informations en termes de relations de parenté maternelles. Les résultats obtenus montrent de façon fiable le partage d'une lignée maternelle par deux individus issus d'un même sarcophage. L'haplogroupe de ces individus (deux femmes) ne peut cependant pas être précisé car, compte tenu des données

dont nous disposons, il pourrait tout aussi bien s'agir de l'haplogroupe K que de l'haplogroupe H, tous deux présents en Europe du Nord et de l'Ouest. Le type de relation précis unissant ces deux femmes est une information inaccessible à ce stade de l'étude mais celle-ci pourrait peut-être être apportée par les STR, si la conservation de l'ADN s'y prête.

Compte tenu du caractère fragmentaire des résultats, certains liens de parenté maternels entre individus ne peuvent pas être exclus mais nous pouvons d'ores et déjà affirmer, qu'au sein de deux sarcophages sur trois, deux individus sur trois présentent des lignées maternelles différentes.

Pour terminer, il convient de souligner la difficulté de ce type d'étude de liens de parenté où se pose le problème non négligeable de la généralisation des résultats partiels. En effet, ce type d'étude se base souvent sur un nombre relativement restreint d'individus et il apparaît très imprudent de vouloir généraliser ces résultats à l'ensemble d'une nécropole, d'une période, d'une culture.

Annexe A : protocoles d'analyses d'ADN ancien

1- PREPARATION DES ECHANTILLONS

Ensacher dans un double sachet stérile les fragments d'échantillons ou échantillons. Bien laver la hotte à la javel entre chaque échantillon.

Mettre 15min les UV avant chaque manip/chaque échantillon

Manipuler avec gants, masque et blouse.

Emmener les sachets dans la salle ADNa, les nettoyer avec un papier imbibé de javel dans le sas et une nouvelle fois dans la salle extraction.

2- EXTRACTION PHENOL-CHLOROFORME

LA VEILLE

1- préparation de la salle = lavage paillasse à la javel, préparation des papiers alu + scalpels + spatules, exposition des échantillons aux UV et laisser la nuit au UV

2- préparation du tampon de base (volume final 50mL) :

9,3g EDTA O,5M (EDTA = chelateur d'ions, les cations libérés par le broyage vont se fixer sur l'edta et pas sur l'adn). de plus, L'EDTA en chelatant les ions Ca2+ va favoriser la disparition des complexes proteiques impliques dans les contacts cellule-cellule tels que jonctions serres et autres desmosomes. Les protéines impliques dans ces complexes sont dépendantes du Ca2+.

1,6g NaOH (pH=8), lyse les cellules par un détergent en milieu alcalin (SDSNaOH) afin de libérer l'ADN génomique et plasmidique. L'ADN génomique et les protéines sont précipitées par de l'acétate de sodium

qsp eau ultra-pure

3- préparation de la solution stock protéi nase K : 1mL dans 25mg de poudre.

Elle hydrolyse les protéines de toutes origines en quelques heures avec une préférence pour les liaisons peptidiques situées après les acides aminés hydrophobes (leucine, par exemple)

LE JOUR-J

1- allumer le four hybridation (55°C)

2- Préparer le tampon de lyse (10mL/échantillon) dans un tube Falcon 15mL

Tampon de base 1 0mL

N-Lauryl Sarcosyl 10% 500uL inactive les activités enzymatiques

Protéinase K (solution stock) 100uL

3- (laver et) broyer l'échantillon (papier alu + papier + papier alu dans sachet)

4- récupérer 0,5-1g de poudre dans un tube Falcon 15mL

5- fermer les tubes avec plusieurs épaisseurs de parafilm

6- incuber toute la nuit à 55°C, sous agitation (à l'abri des UV)

LE JOUR-J+1

Allumer la hotte chimique !!

1- centrifuger les tubes 10min à 800rpm

2- préparer xX3 tubes Falcon 50mL contenant 10mL de Phénol -Chlo-IAA chacun

3- transférer le surnageant dans les tubes Falcon contenant le phénol-chlo, fermer avec du parafilm et homogénéiser le tout doucement

4- centrifuger les tubes 10-15min à 1200rpm

5- répéter les étapes 2 à 4 deux fois

0- transférer environ 2mL du surnageant final sur les centricons (colonnes sur grands tubes fournis) et fermer à moitié avec du parafilm

7- centrifuger 2-5h à 3000rpm

8- jeter l'éluât, retourner la colonne sur les petits tubes fournis et ajouter 100uL d'eau sur la colonne

9- centrifuger 10min à 3000rpm

10- récupérer les éluats dans des eppendorfs

3- AMPLIFICATION

 

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

 

12 14 16 18 20 22 24 26

r

30 32 34 36 38

U

1,5 1,75 2 2,25 2,5 2,75 3 3,25 3,5 3,75 4 4,25 4,5 4,75

L

H2O d16NT9P2 149 165 182 12235 m30

Tampon 10 X 2,5 5 7,5 10 12,5 15 17,5 20 22,5 25 27,5 30 32,5 35 37,5 40 42,5 45 47,5 50

MgCl2 25 mM 2 4 6 8 10

BSA 20 mg/mL 1,25 2,5 3,75 5 6,25 7,5 8,75 10 11,3 12,5 13,8 15 16,3 17,5 18,8 20 21,3 22,5 23,8 25

dNTP 25 mM chaque 0,25 0,5 0,75 1 1,25

amorce Upper 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10

amorce Louver 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10

Taq 5 U/mL 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10

4- VERIFICATION AMPLIFICATION

Faire migrer sur un gel d'agarose 2u L de bleu + 8u L de produit PCR

Prendre une photo

5- CLONAGE

Préparation des boîtes de culture

- diluer grossièrement le LB agar dans l'eau

- autoclaver la bouteille de mi lieu 15min à 121°C

- ajouter l'ampicilline lorsque le liquide est tiède (pas trop chaud)

- Couler dans les boîtes (assez épais)... du coup avec le mélange pour 20 boites, on en fait 12

épaisses

nombre de boîtes

eau (mL)

LB (g)

ampicilline (pi.)

1

25

0,8

12,5

2

50

1,6

25

3

75

2,4

37,5

4

100

3,2

50

5

125

4

62,5

6

150

4,8

75

7

175

5,6

87,5

8

200

6,4

100

9

225

7,2

112,5

10

250

8

125

11

275

8,8

137,5

12

300

9,6

150

13

325

10,4

162,5

14

350

11,2

175

15

375

12

187,5

16

400

12,8

200

17

425

13,6

212,5

18

450

14,4

225

19

475

15,2

237,5

20

500

16

250

- laisser refroidir sur la pà llasse et mettre au frigo (entourées de papier alu

La solution stock d'ampicilline doit être à 10mg/mL (20mL sur 200mg) et être conservée au

frigo.

Ligation - clonage

- Préparer la réaction de ligation (volume final 3uL): ingrédients conservés à -20°C 1 uL de produit PCR

0,5 uL de Salt solution

1 uL eau pure

0,5uL de TOPO vector

- Mélanger doucement et laisser incuber 5-30 min sur la paillasse

- Pendant l'incubation, préparer les bactéries :

. Préparer la glace

. Allumer le bain-marie à 42°C

. Décongeler dans la glace 1 tube de bactéries pour 2 réactions (aliquoter 30uL dans 2 eppendorfs et les placer dans la glace)

. Sortir le SOC du frigo (125 uL par réaction)

- Après incubation de la réaction de clonage, ajouter 1 uL de réaction de ligation à chaque tube de bactérie (conservation du rab' du produit de ligation au congélateur pour réemploi)

- Laisser les tubes de bactéries transformées dans la glace 5-30 min

- Plonger les tubes 30s au bain-marie à 42°C pour le choc thermique

- Transférer immédiatement dans la glace quelques minutes

- Hors glace, ajouter 125 uL de SOC

- Mettre sous agitation 1h, à 37°C, avec les boites

- Etaler 50uL de produit de transformation sur les boites, autour du bec bunzen (nettoyage paillasse alcool 70°c)

- incuber les boites retournées, à 37°c, toute la nuit (max. 18h puis à 4°C)

DECHETS !

- autoclaver les boites pétri dans les sacs biohazard

- stocker les cônes/eppendorfs dans une poubelle remplie de javel puis dans les sacs biohazard jusqu'à l'autoclave

5- VERIFICATION DES CLONES

- préparer une plaque avec 50uL d'eau ultra-pure dans chaque puit

- piquer un cône dans une colonie puis le laisser tremper dans les 50uL d'eau (dans plaque) = produit stock ADN clone. On récupère 24 clones par produit PCR

- Préparer le mix PCR sous la hotte

Pour 35uL final : 15uL MasterMix 2.5x

0.375uL M13FOR1 (10uM)

0.375uL M13REV1 (10uM)

14.25uL H2O

5uL ADN

- dispatcher le mix dans la plaque/ la barrette (30uL par puits) et ajouter 5uL de produit stock ADN clone.

- Fermer avec un autocollant alu la plaque PCR. Fermer avec un autocollant plastique la plaque des stocks ADN clone.

- lancer la PCR : programme M 13

- vérifier la taille des inserts sur gel d'agarose (5uL produit PCR + 2uL bleu)

- envoyer 30uL de produit PCR + additionnée de 10uL d'eau à Génome Express, dans des eppendorfs (IECB mardi matin 10h)

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