II. 2.5.5.3. Hydroperoxydes
(ROOH) (Jiang et al., 1992)
a) Principe
En milieu acide, l'ion peroxyde
entraîne l'oxydation de l'ion ferreux (Fe2+) en ion ferrique
(Fe3+). Le xylénol orange présent forme avec le
Fe3+ un complexe Fe3+-xylénol orange dont la
densité optique peut être lue à 560 nm. Le calibrage de la
réaction se fait avec des standards hydroperoxydes à l'exemple du
peroxyde d'hydrogène, de l'hydroperoxyde linoléique, du tert -
butylhydroperoxyde ou encore des cumènes peroxydes (å = 4,52.
104 M-1 cm-1).
b) Réactifs
· BHT (butylated hydroxytoluène) 88mg
· Xylénol orange 7,6mg
· Sulfate d'ammonium 9,8mg
· Méthanol 90ml
· Acide sulufurique (250mM) 10ml
c) Mode opératoire
Préparation du réactif de
FOX
Le réactif de FOX est préparé en
mélangeant 88 mg de BHT, 7,6mg de xylénol orange et 9,8mg de
sulfate d'ammonium. On y ajoute ensuite 90ml de méthanol et 10ml d'acide
sulfurique 250mM. Le mélange obtenu est homogénéisé
et conservé.
Procédure
100ul d' hémolysât et d'homogénat sont
additionnés à 900 ul du réactif de FOX. Après
homogénéisation, les différents tubes sont incubés
au bain marie à 37°C pendant 30 min. La densité optique du
complexe coloré formé est lue à 560 nm contre le blanc
réactif à l`aide d`un spectrophotomètre.
d) Expression des résultats
La concentration des hydroperoxydes est exprimée en uM
d'hydroperoxydes (plasma) et en uM d'hydroperoxydes /100 g de tissue
(homogénat).
II. 2.5.5.4. Catalase (CAT)
(Sinha, 1972)
a) Principe
La méthode est basée sur le fait
que la catalase présent dans l'échantillon réduit
l'H2O2 en H2O et O2.
b) Réactifs
· 0,2 M de peroxyde d'hydrogène
(H2O2).
· Tampon phosphate 0,01 M pH 7.0
· Dichromate de potassium 5%
· Dichromate acide acétique (mélanger 100 ml
de dichromate de potassium avec 300 ml d'acide acétique
concentré).
c) Mode opératoire
A 0,1ml d'échantillon ou d'eau distillée
(blanc), on ajoute 250uL de tampon phosphate et 200 ul de peroxyde
d'hydrogène et la réaction est arrêtée après
30s et 60s par addition de 1 ml du mélange dichromate - acide
acétique. Tous les tubes sont incubés au bain marie bouillant
(100°C) pendant exactement 10 minutes, refroidis et l'absorbance est lue
à 620 nm contre le blanc à l`aide d`un spectrophotomètre.
d) Expression des résultats
L'activité de la catalase est
exprimée en mmoles de l'H2O2
consommés/min/g protéine
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