II.2.5.5. Dosage de quelques
marqueurs du stress oxydatif
II. 2.5.5.1.
Malondialdéhyde (MDA) (Yagi, 1976)
a) Principe
Les composés carbonylés à l'instar du
malondialdéhyde réagissent avec l'acide thiobarbiturique (TBA)
pour donner des chromophores de couleur rose absorbant à 532 nm.
b) Réactif : Pour 100 ml de
réactif
Acide trichloroacétique (TCA) 20% P/V; Acide
thiobarbiturique (TBA) 0,375% P/V;
Butylhydroxytoluène (BHT) 0,01% P/V ; Chlorure
d'hydrogène (HCl) 1 N.
375 mg de TBA, 20g de TCA, 0,01g de BHT, 25 ml de HCl 1 N et
50 ml d'eau distillée ont été introduit dans un
bécher. La solution obtenue a été chauffée à
40°C dans un bain Marie jusqu'à dissolution complète du TBA,
puis transférée dans une fiole de 100 ml et le volume
complété à l'eau distillée jusqu'au trait de
jauge.
c) Mode opératoire
Pipeter dans les tubes à essai en verre et à
vis, 100ul d'échantillon, 400ul de réactif TBA et fermer
hermétiquement. Chauffer le mélange au bain Marie à 100
°C pendant 15 minutes. Puis refroidir dans un bain d'eau froide pendant 30
minutes en laissant les tubes ouverts pour permettre l'évacuation des
gaz formés lors de la réaction. Centrifuger à 3000
tours/minutes pendant 5 minutes et lire l'absorbance du surnageant à 532
nm à l`aide d`un spectrophotomètre.
d) Expression des résultats
La concentration de TBARS a été
déterminée en utilisant le coefficient d'extinction
moléculaire du MDA (å = 1,53 105 M-1
cm-1). Les résultats ont été exprimés en
umol/l.
II. 2.5.5.2.
Protéines totales (Lowry et al., 1951)
a) Principe
Les protéines en milieu alcalin forment avec les ions
Cu2+ un complexe hexacoordonné dont la couleur varie du rose
violet au bleu violet suivant la quantité de protéines
présente dans le milieu. Le complexe dont la longueur d'onde
d'absorption maximale est 540 nm est proportionnel à la quantité
de protéine présente.
b) Réactifs
· Réactif A: 2% NaCO3 mélangé avec
un volume égal de 0.4% NaOH
· Réactif B: 1% CuSO4 mélangé avec
un volume égal de 1% Na K tartrate.
· Réactif 1: 1 volume du réactif B est
mélangé avec 100 volumes de réactif A.
· Réactif 2: 50% réactif de Folin -
Ciocalteu
c) Mode opératoire
100ul d'échantillon, d'eau distillée (blanc) ou
de BSA (Bovine Sérum Albumin: 5 mg dans 5 mL d'eau) est introduit dans
un tube à essai avec 1 ml du réactif 1. Le mélange est
incubé à température ambiante pendant 10 minutes
ensuite100ul du réactif 2 est ajouté. Le mélange est
incubé à température ambiante pendant 30 minutes. La
densité optique est lue 750nm contre le blanc. L'albumine a
été utilisée comme étalon.
d) Expression des
résultats
x [étalon]
=
DO échantillon
DO étalon
[Protéines] (en g/L)
Concentration de l'étalon albumine = 50g/L
| 
