II.2.5.2. Dosage du
cholestérol HDL (Young, 2001)
a) Principe
Les lipoprotéines (chylomicrons, VLDL et LDL) sont
précipitées par l'ajout de l'acide phosphotungstique et du
chlorure de magnésium. Après centrifugation, le surnageant clair
contenant la fraction de HDL qui est testée avec le réactif du
kit Chronolab pour la détermination du taux de HDL
cholestérol.
b) Réactifs (kit Chronolab)
R1 : Réactif précipitant
(le réactif précipitant est prêt pour
l'utilisation)
acide
phosphotungstique...................................................14
mmol/l
chlorure de
magnésium......................................................2
mmol/l
R2: Solution étalon
cholestérol
standard...........................................................200 mg/dl
c) Mode opératoire
Pipeter dans un tube, 200ul de l'échantillon et 20ul du
précipitant.
Laisser reposer pendant 10 minutes à température
ambiante. Centrifuger à 4000 tours/min pendant 10minutes. Collecter le
surnageant.
Pipeter respectivement dans les tubes à essai et
étalon
10ul du surnageant, 10ul de standard y ajouter 1000ul de
tampon cholestérol, mélanger et incuber pendant 10 minutes
à température ambiante. Lire l'absorbance de l'échantillon
contre le blanc réactif à 505 nm à l`aide d`un
spectrophotomètre.
d) Expression des résultats
La concentration en HDL cholestérol
dans le sérum est donnée par la relation :
DO échantillon
DO étalon
X 200 (mg/dl) = [HDL
cholestérol] (mg/dl)
II.2.5.3. Estimation du
cholestérol LDL (Friedewald et al., 1972)
La concentration en LDL sérique a été
déterminée par la méthode de différence selon
l'équation de Friedewald et al., 1972 :
Cholestérol LDL = cholestérol total -
cholestérol HDL - triglycérides / n
n = 2, lorsque les valeurs sont exprimées en mmol/l
n = 5, lorsque les valeurs sont exprimées en mg/dl
II.2.5.4. Dosage des
triglycérides (Fossati et Principe, 1982)
a) Principe
Sous l'action de la lipoprotéine lipase (LPL), le
glycérol, produit par hydrolyse enzymatique des triglycérides,
est phosphorylé par l'ATP pour produire la glycérol-3- phosphate
et l'ADP à travers une réaction catalysée par la
glycérol kinase (GK). La glycérol-3-phosphate oxydase (GPO)
catalyse ensuite l'oxydation du glycérol -3-phosphate pour produire le
dihydroxyacétone-3-phosphate et H2O2. Ce dernier
se combine au 4-aminoantipyrine et au 4-chlorophénol pour former la
quinonéimine sous l'influence catalytique de la peroxydase (POD).
L'intensité de la coloration est proportionnelle à la
concentration des triglycérides présente dans
l'échantillon.
LPL
GK
GPO
POD
Triglycérides + H2O
glycérol + acides gras
Glycérol + ATP
glycérol-3-phosphate + ADP
Glycérol-3-phosphate + O2
dihydroxyacétone phosphate + H2O2
2H2O2 + 4- aminoantipyrine + 4-
chlorophénol quinonéimine +
4H2O
b) Réactifs
R1: Tampon
Tampon GOOD pH
7,5................................................................50mmol/l
p-chlorophénol............................................................................2mmol/l
R2 : Réactif enzyme
Lipoprotéine lipase
(LPL)..........................................................150000U/L
Glycérol kinase
(GK).....................................................................500U/L
Glycérol-3-phosphate oxydase
(GPO................................................2500U/L
Peroxydase (POD)
.......................................................................440U/L
4-aminophénazone................................................................
....0,1mmol/L
ATP.....................................................................................0,1mmol/L
R3 : Solution étalon
Triglycérides
standard................................................................250
mg/dl
R1 + R2 : Solution de travail
La solution de travail est stable pendant six semaines entre
2°C à 8°C ou pendant 7 jours entre 15 à 25°C.
c) Mode opératoire
Introduire dans une cuve, 10 ul d'échantillon
sérique ou de standard et 1000ul de réactif, mélanger et
incuber pendant 10 minutes à 25°C. Lire l'absorbance de
l'échantillon contre le blanc réactif à 505 nm à
l`aide d`un spectrophotomètre.
d) Expression des résultats
La concentration des triglycérides dans le
sérum est donnée par la relation :
DO échantillon
DO étalon
X 250 (mg/dl) =
[triglycérides] (mg/dl)
[Triglycérides] (mmol/l) = 0,0113 ×
[triglycérides] (mg/dl)
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