Rapport de stage dans un secteur médical

E.coli :

Recherchée systématiquement chez l'enfant moins de trois ans.

Autres germes :

Nous réalisons cette recherche selon le contexte : demande, observation microscopique.

Levures :

Leur présence se révèle lors de l'observation microscopique à l'état frais.

Dans ce cas, on utilise le milieu Sabouraud + chloramphénicol.

Staphylococcus aureus :

Recherchée en cas de toxi-infection alimentaire, le milieu utilisé Chapman.

Vibrio cholerae :

Recherchée directement sur milieu sélectif(GNAB) et après enrichissement par EPA, puis repiquage après 3heures sur GNAB et sur EPA, puis repiquage de ce dernier dans GNAB. Incubation 37°C/24h.

Deuxième jour :

Repérage des colonies :

Caractérisation et identification biochimiques des colonies suspectes.

1- Les colonies suspectes de Salmonelles et de Shigelles sur gélose Hektoen sont transparentes, vertes, elles sont lac, H2S + ou -.

- On réalise un test d'oxydase instantané, afin d'éliminer les Pseudomonas qui sont oxy +

- Réaliser un test d'uréase

- Après incubation, ajouter le réactif de KOWACS

- Ensemencer sur milieu Kliger Hajna?incubation 24h/37°C.

- Pour les colonies saumons, on élimine les Proteus par le test d'uréase sur milieu urée indole, Proteus est uréase+ (le milieu devient rouge en 2heures)

a- Urease + :Proteus.

b- Urease : ajouter le réactif de Kowacs?indole +? possibilité

d'avoir E.coli.

2- Les tests effectués pour E.coli sont : lactose, acétoïne, citrate, H2S, gaz.

3- Les Staphylocoques pathogènes forment des colonies pigmentées, entourées d'une auréole jaune due à la fermentation du mannitol.

Les tests effectués sont : cat(+), coagulase(+).

4- Pour l'identification des Vibrio cholerae, qui se présentent en colonies transparentes bleutées, on effectue un test d'oxydase (oxy+), catalase (cat+), urée indole, TDA

L'antibiogramme :

L'antibiogramme est impératif pour Salmonella, Shigella, E. coli et pour V cholerae.

Troisième jour :

Lecture des résultats d'identification biochimique et de l'antibiogramme.

Salmonella, Shigella :

Tests	Lac	H2S	Uréase	Indole	Hajna Kligler
					glucose	gaz	LDC
Salmonella	-	+/-	-	-	+	+	+
Shigella	-	-	-	-	+	-	-

- Les Salmonelles sont sensibles à l'amoxicilline

- Les Shigelles sont sensibles à la céphalosporine.

E.coli : oxy, Lac+, indole+, acétoïne, citrate, H2S, gaz+, uréase.

Staphylococcus aureus: cat+, coagulase+, mannitol+.

Vibrio cholerae: oxy+, cat+, urée, indole+, TDA.

- Les Vibrio sont sensibles aux sulfamides et aux tétracyclines.

* Réalisation d'un sérotypage pour Salmonella, Shigella, Vibrio

Donc, un résultat normal se traduit par l'absence de bactéries entéropathogenes, il ya seulement la présence de la flore commensale dont on retrouve 10% d'Entérobactéries surtout les Colibacilles.

En cas de pathologie, il y ait la présence d'Entérobactéries pathogènes, ce qui confirme le contexte.

Parasitologie des selles

Un examen parasitologique est la mise en évidence directe des parasites dans un produit biologique tel que les selles, les urines, le sang, la peau, les crachats, les sécrétions vaginales.

Donc, la parasitologie des selles met en évidence les parasites qui colonisent le tube digestif de l'homme.

Cet examen est prescrit pour toute personne présentant des douleurs abdominales, diarrhées, fièvres. Il est demandé également pour des personnes ayant des troubles digestifs.

But d'examen :

Il permet d'affirmer l'existence d'une parasitose intestinale.

Prélèvement :

Avant le prélèvement, éviter les aliments riches en fibres, et certains médicaments (suppositoires)

Les selles recueillies dans un pot stérile devront être rapidement transmises au laboratoire.

Déroulement d'examen :

1- Examen macroscopique :

Cet examen permet de noter la couleur, la consistance, la présence du sang, de mucus, ainsi la présence de parasites visibles á l'oeil nu.

2- Examen microscopique :

Met en évidence les kystes et les formes végétatives de protozoaires ainsi que les oeufs et les larves d'helminthes.

Il comprend deux étapes :

  a- Examen direct :

Se fait a l'état frais entre lame et lamelle et s'effectue sur des selles fraîches liquides ou en suspension (selle solide), il permet de rechercher le maximum de protozoaires et de kystes.

 b- Examen après concentration :

Permet la recherche des oeufs et des kystes qui sont en petites quantités invisibles par l'examen direct.

Cet examen dure de 1 à 3 jours.

Résultats :

Résultats normaux :
Absence de parasites dans les selles.

Résultats anormaux :
La présence de parasites.

Tab : Principaux parasites des selles chez l'homme

Protozoaires	Sporozoaires (coccidies) Infusoires (Balantidium coli) Flagellés(Giardia) Rhizopodes (amibes)
Helminthes=Nématodes (vers ronds)	Ascaris lombricoïdes Trichuris trichiura (trichocéphale) Enterobius vermicularis (oxyure) Strongyloides stercoralis (anguillule intestinale)
Plathelminthes (vers plats)	Distomatoses (douves) Schistosoma (bilharzies) Cestodes(Taenia)

Giardia intestinalis

Analyse bactériologique des eaux de consommation

Tout produit destiné á la consommation humaine doit être analysé, divers paramètres sont utiles (organoleptiques, physicochimiques, microbiologiques).

L'analyse microbiologique d'une eau représente la recherche des germes pathogènes (Salmonella) et met en évidence la présence d'une pollution fécale dans cette eau par la recherche de certains germes considérés comme indicateurs.

Objectif :

Evaluer la qualité hygiénique d'une eau de consommation

Prélèvement :

Pour ne pas fausser les résultats, le prélèvement se fait dans des conditions aseptiques dans un flacon stérile.

Il faut bien noter l'heure et le lieu du prélèvement.

La démarche :

1- Dénombrement des germes totaux :

=

Flore Totale Aérobie Mésophile(FMAT)

* But :

Son dénombrement nous renseigne sur la charge microbienne du produit et le risque de présence de germes pathogènes.

* Technique :

Nous avons préparé des dilutions d'eau à analyser, par l'eau physiologique.

Poser 1ml de chaque dilution et même la solution mère (eau) dans deux boites de Pétri, puis verser le milieu TGEA et mélanger, laisser solidifier, puis incuber.

* Lecture :

Comptage direct des colonies : le nombre de colonies est exprimé en UFC/ml

Le nombre des bactéries par ml est selon la formule suivante :

Ó n

n=

(N1+0.1N2) d

n : nombre de colonies dans chaque boite pour deux dilutions successives

N : nombre de boites pour une dilution

d : dilution

1ml 1ml 1ml 1ml

9ml d'eau physiologique

Eau á 1/10 1/100 1/1000 1/10000

Analyser

1ml de dilution

Gélose TGEA dilution

Incuber la 1^ere série de boites à 37°C pendant 48h

Incuber la 2^eme série de boite á 22°C pendant 72 heures

Lecture :

Prendre en considération les boites contenant entre 30 et 300 colonies

Fig : Schéma représentant la technique du dénombrement de FMAT

2- Colimétrie :

=

Recherche et dénombrement des coliformes dans l'eau

Les Coliformes sont des Entérobactéries (G+, oxy, glu, NR+, aero-anaerobies),

Se divisent en deux groupes :

- Coliformes totaux(C.T) : fermentent le lactose avec production de gaz á 37°C

- Coliformes fécaux(C.F) : fermentent le lactose avec production de gaz á 44°C

Le dénombrement se fait par la méthode NPP (Nombre le Plus Probable).

* But :

Mise en évidence d'une contamination fécale.

* Technique :

Eau a analyser

50ml

1ml

10ml

50ml BCPL D/C 10ml BCPL D/C 10ml BCPL S/C

+ + +

Cloche de Durham cloche cloche

Agitation des tubes et Incubation à 37°C pendant 24heures

Résultat + :

Virage du milieu au jaune translucide+gaz dans la cloche 1/10? présence de C.T

Résultat - :

Aucun changement

Pas de gaz

6gouttes de surface

Mélanger

Incubation 44°C/24h

Anneau rouge?

Indole +

Confirmation E.coli

Trouble + gaz dans la cloche? présence de C.F

Milieu Schubert pour détection de C.F et E.coli

R +

+R.Kowacs

R

Fig : Schéma représentant la recherche des C.T, C.F et E.coli

* Lecture :

Nous prenons en considération les tubes positifs seulement

Pour obtenir le nombre de C.T et C.F dans 100ml d'eau analysée, on se reporte à la table de MAC GRADY pour calculer l'indice du nombre le plus probable(NPP).

3- Recherche et dénombrement des Streptocoques fécaux :

=

Groupe des Entérocoques

Ces germes ne sont pas pathogènes pour l'homme mais leur présence en grand nombre peut indiquer qu'il y a des bactéries pathogènes.

Sont des Streptocoques du groupe D (généralement non hémolytique).

* But :

Confirmer ou infirmer une contamination fécale (témoins supplémentaires en plus des Coliformes).

* Technique :

Dans un 1^er temps en utilisant le milieu de ROTHE (bouillon glucosé á l'azide de sodium).

Après incubation á 37°C/24h, les tubes positifs sont présumés á contenir des Streptocoques.

Ainsi devient le test confirmatif qui est réalisé par l'utilisation du milieu EVA LITSKY.

* Lecture :

Après l'incubation, les tubes contenant des Streptocoques présentent un trouble avec la formation d'une pastille violette au fond du tube.

On se réfère à la table de MAC GRADY, pour avoir le nombre des Streptocoques dans 100ml d'eau.

Tab : Origine de pollution fécale selon le rapport C.F/S.F

Rapport C.F/S.F	Source de contamination
R< 0.7	Principalement ou entièrement d'origine animale
0.7<R<1	Mixte à prédominance animale
1<R<2	Origine incertaine
2<R<4	Mixte à predominance humaine
R>4	Exclusivement humaine

Test présomptif

Eau a analyser

1ml

50ml

10ml

50ml

50ml bouillon de 10ml bouillon de 10ml bouillon de

Rothe D/C Rothe D/C Rothe S/C

Agitation des tubes et Incubation à 37°C pendant 24 - 48h

Résultat - :

Aucun changement

Résultat + :

Troubles (cultures positives)

Test confirmatif

6 gouttes de surface

Mélanger

Incubation 37°C/24h

Virage au jaune translucide+ une pastille violette au fond du tube? présence de S.fecaux

R +

Aucun changement? absence de S.fecaux D

R

Milieu EVA Litsky pour confirmation de S.fecaux

Fig : Schéma représentant la technique du dénombrement des S.fecaux

4- Recherche des Vibrio cholerae :

=

Absence ou présence

Ce germe est pathogène pour l'homme, c'est l'agent du cholera.

Il ne se multiplie qu'en présence du Nacl

A l'état naturel, ce genre ne se trouve pas dans une eau de consommation.

* But :

Confirmer l'absence du germe dans une eau de consommation.

* Technique :

Eau a analyser

450ml eau

50ml EPA

Enrichissement des Vibrio cholerae

Mélanger le flacon

Incuber 37°C/6h

Refaire l'enrichissement 3 fois

A partir d'EPA précédent

Apres 24 heures

Isolement

des V.cholerae sur GNAB

Repérage des colonies suspectes de V.cholerae (colonies en gouttes d'eau)

Avec la pipette Pasteur, sur la surface d'EPA (5cm)

Trouble :

Eau suspecte

Aucun changement :

Absence de V.cholerae

Fig : Schema representant la technique de recherche des V.cholerae.

Pour la recherche de V.cholerae, il faut un enrichissement par EPA (Eau Peptonée Alcaline).

Ce germe se développe chaque 6 heures pendant 24 heures, donc :

- Soit, on effectue la lecture chaque 6 heures, dans ce cas on refait l'enrichissement á partir du tube précédent (3 fois pendant 24heures).

- Ou soit, une lecture après 24 heures d'incubation.

* Lecture :

Une eau suspecte se traduit par un trouble dans le flacon d'EPA, on applique un isolement sur milieu GNAB.

Une eau potable (prête à consommation humaine) ne doit pas contenir des V.cholerae.

5- Recherche des Salmonelles :

=

Absence ou présence

Ces bactéries sont susceptibles de contaminer les aliments et provoquer des toxi infections alimentaires.

* But :

Evaluer la salubrité de cette eau

* Technique :

200ml d'eau sont ajoutés à 50 ml de SFB (bouillon au sélénite acide de sodium) pour l'enrichissement de Salmonella

Après incubation de 6 à 18 h. (le sélénite inhibe la croissance des Coliformes et des Entérocoques principalement dans 6h d'incubation) un ensemencement en masse sur BGA ou SS, et incubation á 37°C/24h

* Lecture :

Absence ou présence des colonies suspectes.

Normalement ce germe est absent dans un produit de consommation humaine et durant mon stage nous ne l'avons jamais trouvé.

Eau á analyser

Enrichissement

De Salmonella

200ml eau

50ml SFB

Mélanger

Colonies suspectes sur BGA (colonies plates lac-)

Incuber 37°C/6 a 18h

Isolement

De S

1ml du tube enrichi sur boite, puis ajouter BGA ou gélose SS

Colonies suspectes sur SS (colonies incolores avec ou sans centre noir)

Absence de colonies suspectes ? absence de Salmonella

Fig: Schéma représentant la recherche de Salmonella dans l'eau

5- Recherche et dénombrement des Clostridium

sulfito-réducteurs :

Ce sont des germes qui ont l'aptitude à se sporuler en conditions défavorables.

* But :

Mise en évidence d'une contamination fécale ancienne liée à leur aptitude à sporuler.

* Technique :

Une réalisation des dilutions d'eau á analyser

Afin de détruire les formes végétatives des CSR, nous réalisons un traitement thermique à 80°C pendant 10 minutes des tubes.

Laisser refroidir les tubes, puis ajouter le milieu Viande Foie en surfusion additionné de 0.4ml de sulfite de soude et 4 gouttes d'alun de fer.

* Lecture :

La présence des CSR sporulés se traduit par l'apparition des colonies noires, du fait de la réduction de sulfite en sulfure.

1ml 1ml 1ml 1ml

9ml d'eau physiologique

Eau a 1/10 1/100 1/1000 1/10000

Analyser

Chauffage a 80°C pendant 10 mn au bain marie de chaque tube

Les colonies de CSR sont entourées d'un halo noir

Incubation 37°C/48h

L'inoculum

10 ml de VF additionne de 0.4ml de sulfite de soude et 4 gouttes d'alun de fer

Fig : Schema representant la technique de recherche des CSR

Prélèvement sanguin

Après préparation de la salle et du matériel de prélèvement :

1- choix de la veine :

Poser un garrot légèrement serré au dessus du pli du coude

Recherche de la meilleure veine.

2- Antisepsie :

Passer sur la zone choisie un antiseptique le plus souvent de l'alcool sans repasser sur la zone déjà traitée

3- Introduction de l'aiguille :

Positionner l'aiguille  

Piquer, en tirant vers le bas, la peau sous le point de piqûre, puis aspirer

4- Retrait de l'aiguille :

Positionner au niveau du point de piqûre un coton propre et enlever l'aiguille

5- Remplissage des tubes :

Remplir le tube jusqu'au trait indique sur celui-ci et l'agiter.

Eliminer les aiguilles

Il faut identifier les tubes pour ne pas confondre les résultats.

Les tests effectués

1- Glycémie :

Cet examen est demandé pour la surveillance de l'évolution du taux de glucose.

Il est basé sur une méthode enzymatique colorimétrique.

Pour la mise en évidence du taux de glucose, on a besoin de 3 tubes :

Le 1^er du blanc contenant 1 cc du réactif de travail

Le 2^eme d'étalon contient 1ml du R de travail +0.1 ml R3

Celui d'ech, contient 1ml de R de travail +0.1ml du sérum

Il faut agiter les tubes et attendre 30mn pour mesurer la D.O á505nm.