Analyse des bacteries non cultivables

2. ANALYSES ET METHODES DE RECHERCHE DES BACTERIES NON CULTIVABLE.

2.1 Analyse par fluorimétrie.

Plusieurs méthodes de recherche et de numération des bactéries viables sont basées sur la fluorimétrie. Cette technique nécessite l'utilisation de système de microscopie à épifluorescence (figure 2). Le principe de cette microscopie consiste à exciter un fluorochrome à une longueur d'onde donnée afin de pouvoir en observer le signal émis. Le traitement de l'image reçue peut être réalisé à l'aide d'un système informatique relié à une caméra CCD.

Figure 2 : schéma d'un microscope à épifluorescence, système microscopie à épifluorescence ZEISS (Source :
http://www.clermont.inra.fr/plateau_technique_microscopie/equipements_principaux/microscopie_a_epifluorescence)

2.1.1 Double coloration CTC / DAPI

La double coloration CTC-DAPI permet de dénombrer et de différencier les cellules mortes des cellules vivantes. Le CTC est un sel de tétrazolium qui, une fois réduit en sel de formazan insoluble, émet de la fluorescence rouge (après excitation à 450nm, émission de fluorescence rouge à 630nm). Le CTC est le colorant permettant de dénombrer les cellules viables, la réduction du CTC par les cellules est le signe que la respiration cellulaire à lieu, cela signifie que le métabolisme est actif. (Garrec N. et al., 2005 [13] - Joux F. et al., 1997 [15])

La coloration au DAPI permet de dénombrer la totalité des cellules, ce fluorophore se lie spécifiquement à l'ADN et émet une fluorescence bleue avec un maximum d'émission à 456nm (excitation à 372nm, lumière violette). Les colorations peuvent être réalisées simultanément (figure 3), ou séparément sur deux échantillons.

Figure 3 : Coloration : A) DAPI - B) CTC observé en microscopie à fluorescence (Source :
http://www.biochemj.org/bj/380/0859/bj3800859f05.htm?resolution=HIGH)

L'acridine orange est aussi fréquemment utilisée pour le dénombrement de la flore totale. Ce fluorochrome est un agent intercalant de l'ADN qui émet une fluorescence verte (maximum d'émission à 525nm).

2.1.2 LIVE/DEAD® BacLightTM

Il existe plusieurs versions de la méthode LIVE/DEAD^® BacLight^TM développée par Molecular Probes. Ce paragraphe décrit les versions principales utilisables pour l'étude des cellules viables Procaryotes et microorganismes unicellulaires Eucaryotes.

La version LIVE/DEAD^® BacLight^TM Bacterial viability kit est utilisable pour l'analyse des bactéries, levures, mycoplasmes et protozoaires. Le principe de ce kit est basé sur une double coloration par l'intermédiaire de deux florophores : le SYTO9^® et le Propidium Iodide (PI). Le SYTO9^® est un fluorophore qui, après excitation à 470nm, émet une fluorescence de couleur verte (540nm). Ce marqueur possède la capacité de diffuser dans les cellules, intègres ou non, et d'émettre de la fluorescence une fois lié à l'ADN. Le SYTO9^® permet donc de marquer la totalité les cellules d'un échantillon. Le Propidium Iodide est un agent intercalant de l'ADN, une fois lié à ce dernier le PI émet une fluorescence rouge (635nm) après excitation à 470nm. Ce fluorophore ne peut pénétrer dans les cellules que si les membranes sont altérées, seules les cellules mortes fluorescent en rouge (figure 4).

Figure 4 : coloration LIVE/DEAD BacLight Bacterial viability kit SYTO9/ Propidium iodide (source : brochure
Invitrogen). En vert les cellules viables, en rouge les autres cellules.

Deux autres kit Baclight sont disponibles : le RedoxSensor^TM Green vitality kit et le RedoxSensor^TM CTC vitality kit.

Dans le RedoxSensor^TM Green vitality kit. La différenciation entre cellules mortes et viables se fait grâce à deux fluorochromes : le PI et le RedoxSensor^TM Green. Ce dernier est un indicateur de respiration cellulaire, à l'état réduit il émet un signal fluorescent vert. Les cellules viables sont marquées en vert et les autres cellules sont marquées en rouge par le PI.

Le kit RedoxSensor^TM CTC vitality kit reprend la méthode de la double coloration CTC/DAPI vu dans le paragraphe précédent. Dans ce kit le DAPI peut être remplacé par le SYTO^®24 dont le principe est similaire.

Molecular Probes a donc développé une série de kits permettant de différencier et de dénombrer les cellules viables et mortes.

Une étude comparative a été réalisée sur la flore totale d'eau potable entre le kit LIVE/DEAD^® BacLight^TM et colorations au CTC et à l'acridine orange (Boulos L. et al., 1999 [5]). Il ressort de cette étude que le système BacLight^TM permet d'obtenir des résultats équivalent à une coloration au CTC sur une population de cellules non stressées. Les auteurs décrivent également que le nombre de cellules viables détectées par le système BacLight^TM est supérieur à celui dénombré en coloration CTC et par dénombrement sur milieux de culture dans le cas de cellules stressées.