Analyse des bacteries non cultivables

2.1.3 Cytométrie en flux

La cytométrie en flux (CMF) est une technologie largement utilisée en biologie notamment pour ses performances d'analyse mais aussi parce qu'elle permet un tri physique des populations étudiées ainsi qu'un dénombrement des cellules viables. La CMF permet de passer au crible les cellules une par une dans un flux, la rapidité d'analyse peut aller jusqu'à plusieurs milliers de cellules par seconde voir plusieurs dizaines de milliers.

Figure 5 : représentation schématique d'un cytomètre de flux (source INRP : http://www.ifr87.cnrs-
gif.fr/pbc/equipement/cytometre.html)

L'analyse par CMF passe par une préparation des échantillons : la détection des caractères étudiés nécessite une coloration fluorescente. Les cellules marquées sont convoyées dans une buse de très faible diamètre et sont soumises à un rayonnement LASER pour provoquer l'excitation du fluorophore. La fluorescence émise par le fluorochrome, provoquée par le passage du rayon laser dans la gouttelette, est mesurée par un ou plusieurs photomultiplicateurs ou une photodiodes. Les variations des signaux permettent de sélectionner différentes populations de l'échantillon et de les séparer à l'aide d'un champ électrique (Figure 5).

Plusieurs fluorophores permettent de mesurer la viabilité cellulaire et notamment la Rhodamine 123 (Rh-123) (Lopez-Amoros R. et al. 1997 [22]). Ce fluorophore se lie aux membranes plasmiques ; c'est un marqueur cationique révélant la présence de potentiel membranaire. Plus l'activité énergétique des cellules est élevée plus la différence de potentiel au niveau de la membrane seront élevés et plus les cellules accumuleront la Rh-123 (Kaprelyants A.S. et Kell D.B., 1991 [17]). La fluorescéine diacétate est également utilisée comme marqueur de cellule viable. La fluorescéine diacétate permet de détecter une activité métabolique dans les cellules, il s'agit d'un ester qui une fois hydrolysé par une estérase bactérienne libère un composé fluorogène (Diaper J.P. et al., 1994 [12]). Le défaut de ces colorations est que toutes les souches bactériennes ne présentent pas la même sensibilité à ces différents colorants. La même étude montre que le

marquage par le colorant ChemChrome B balayerai un plus large nombre d'espèces bactériennes qu'elles soient à GRAM positif ou négative alors que le FDA serait plus approprié pour colorer les bactéries à GRAM positif (Diaper J.P. et al., 1994 [12]).

D'autres fluorophores vus dans les précédents paragraphes peuvent aussi être utilisés, le CTC, le DAPI, le propidium iodide, le SYTO9 et d'autres (Morin N., 2008 [25]). L'intérêt d'utiliser la cytométrie en flux est d'augmenter la sensibilité et la rapidité de dénombrement par rapport à l'étude microscopique. De plus, le nombre de cellules étudiées par CMF peut être plus important qu'en microscopie ce qui permet un traitement statistique plus fiable.