3- Le conseil génétique
Après exploration cytogénétique et
diagnostic d'aberrations chromosomiques chez l'un ou les deux partenaires
consultants pour un problème d'ASR, un conseil génétique
doit être proposé pour des fins, soit :
- De poser l'indication du prélèvement pour
exploration cytogénétique foetale, en déterminant
le
risque potentiel.
- D'avoir un enfant porteur d'une aberration chromosomique.
- D'expliquer au couple ce risque et les apports du Diagnostic
Pré-Natal (DPN).
- D'informer le couple sur les modalités pratiques de
cette exploration ainsi que ses limites
liées essentiellement au risque technique ainsi
qu'à l'interprétation rigoureuse des résultats.
- D'aider le couple à la prise de décision si
une anomalie a été décelée.
Ce conseil génétique doit être très
rigoureusement adapté au couple concerné ainsi qu'à
l'anomalie chromosomique parentale détectée. En effet, devant une
translocation réciproque, les problèmes qui se posent sont ceux
de l'évaluation du risque de déséquilibre à terme
et, selon l'intensité de ce dernier, du mode de prévention
à proposer (Frikha et al., 2012). Le conseil
génétique pour les porteurs d'inversion peut être
basé sur les principes suivants :
- Les inversions péricentriques des régions
hétérochromatiques ainsi que les inversions
paracentriques ont
un risque qui n'est pas différent de celui de la population
générale : l'examen chromosomique prénatal ne semble donc
pas indispensable.
- Les inversions péricentriques des régions
euchromatiques ne sont pas dénuées de risques
pour la descendance de leurs porteurs ; ce risque est
différent selon :
- La taille du segment inversé par rapport à la
taille du segment impliqué.
- Le sexe du porteur : les hommes auront plus de risque de
stérilité que les femmes.
- le mode de recrutement : il y aurait un risque plus
élevé pour les inversions recensées
à partir d'un enfant anormal et porteur d'une aneusomie
de recombinaison.
Il serait justifié dans ces cas de proposer un DPN.
Ainsi, le conseil génétique constitue un acte médical
assez particulier, au cours duquel le rôle du médecin
généticien ne se limite pas à poser un diagnostic ou
à le confirmer et à tirer des conséquences
immédiates pour la prise en charge. Le généticien doit
évaluer la probabilité qu'une anomalie chromosomique parentale
équilibrée se manifeste à nouveau ou sous une forme
déséquilibrée et qui aboutira soit à l'avortement,
soit à la naissance d'un enfant atteint. À l'issue de cette
consultation, le couple doit faire un choix et prendre une décision. Le
couple doit consulter avant de procréer car les étapes conduisant
à une évaluation correcte du risque génétique
peuvent demander un long laps de temps (Poncelet et Sifer, 2011 ; Frikha et
al., 2012).
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Patients et méthodes
Notre travail de recherche est répartie en deux volets
complémentaires : une étude statistique suivie d'une étude
cytogénétique. Les couples enrôlés dans cette
étude sont recrutés au niveau du service de gynécologie du
CHU Benbadis ainsi que de la maternité Sidi Mabrouk - Constantine. Le
seul critère d'inclusion retenu est le fait que ces couples ont
vécus = 2 avortements spontanés répétés
inexpliqués. Nous avons exclu de cette prospection les couples qui ont
refusé de participer à cette étude.
1- Étude statistique
Ce volet de notre étude vise à prospecter sur
une cohorte de couples ayant vécus plusieurs fausses couches
spontanées à répétition, par la réalisation
d'un questionnaire (annexe I), les étiologies possibles
à ce dysfonctionnement de la santé reproductive. Plusieurs types
de données sont recueillis : les paramètres
anthropométriques de la femme, son état de santé, ses
habitudes alimentaires, l'aspect de l'utérus à
l'échographie. Les valeurs du bilan hormonal sont relevés. La
recherche du syndrome métabolique est faite. Des précisions
concernant le recours à une procréation médicalement
assistée sont demandées (nombre de tentatives, type de PMA, taux
de réussite). Des informations sur la santé reproductive du
conjoint sont également demandées. Enfin, des renseignements sur
la santé reproductive de la fratrie sont sollicités dans la
perspective d'une possible étiologie génétique familiale
héréditaire. Les données ainsi recueillies sont
traitées par Excel.
2- Étude cytogénétique
Ce volet de notre étude vise à l'application des
techniques de cytogénétique pour la réalisation du
caryotype sur des prélèvements sanguins issus de couples avec
antécédents plusieurs FCS. L'analyse cytogénétique
s'est faite au niveau de l'unité de cytogénétique du CRBt
- Constantine. Les prélèvements sanguins sont recueillis dans des
conditions stériles par ponction veineuse, dans des tubes de 4 ml
contenant l'héparine de lithium ou l'héparine de sodium comme
anticoagulants. Ces prélèvements sont acheminés dans
l'immédiat au CRBt pour la mise en culture cellulaire.
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Patients et méthodes
2-1- Matériel et réactifs 2-1-1-
Matériel
- Tubes coniques de 15 ml (aliquotes du milieu de culture),
- Lames de microscope 26×76 mm (labbox®),
- Boites de rangement des lames,
- Micropipettes (20-200 ìl),
- Pipettes de transfert en plastique,
- Hotte à flux laminaire (ALS- STERIL-
HELIOS®),
- Hotte chimique (Shinsaeng®-model : SFH-2012
(UP)),
- Centrifugeuse à grande vitesse (SIGMA®
2-16 KL),
- Vortex (IKA®), (VELP®, WIZARD
Advanced IR Vortex Mixer),
- Station cytogénétique motorisé
(Leica® DM6000b) reliée à un ordinateur
disposant
d'un système de traitement d'image (logiciel
Cytovision®),
- Étuve (Memmert®),
- Réfrigérateur à 4°C,
- Congélateur à -20°C,
- Bain marie (Memmert®),
- Becher en verre (20 ml, 25 ml, 100 ml, 600 ml et 1000 ml),
- Becher en plastique (50 ml, 100 ml et 400 ml),
- Pince,
- Cuve à coloration (Hellendahl®),
- Papier absorbant,
- Éprouvettes graduées en verre (250 ml, 500
ml),
- Bac en verre,
- Portoir pour tube,
- Pipette graduée 0,5 ml,
- Présentoir de lames,
- Gant nitrile non stérile (non poudré),
- Embouts à Pipette (ISOLAB®
200ìl).
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Patients et méthodes
2-1-2- Réactifs
- PBMax : préparé 8 ml, conservé à
-20 °C
- Thymidine (100 pl) : 0,6 g dans 100 ml de PBS (Phosphate
Buffered Saline)
- PBS : 1 comprimé de PBS dans 200 ml d'eau
bidistillée (Sigma®),
- Eau distillée,
- Eau minérale,
- Eau bidistillée,
- Acide acétique 100%,
- Éthanol pure 99-100°.
- Giemsa liquide Fluka®.
- Huile d'immersion,
- Sérum de Veau Foetal (SVF) (1,5 ml),
- RPMI 1640 Medium avec L-glutamine et sodium bicarbonate (6,5
ml),
- Colchicine (60 pl) : 0,1 g dans 100 ml d'eau
distillée,
- KCl : 5,6 g/l,
- Sodium phosphate monobasique di-hydraté
(NaH2PO4+2H2O) : 78 g de poudre de phosphate
+ 500 ml d'eau distillée
- Carnoy : 3V Éthanol +1V d'Acide acétique.
- Tampon de Gürr,
- Giemsa : 10 ml solution de Gürr + 5 ml de Giemsa + eau
minérale.
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Patients et méthodes
2-2- Méthodologie 2-2-1-
Prélèvement
Tous nos prélèvements ont été
réalisés par des infirmiers par ponction veineuse dans des
conditions stériles et en utilisant des tubes héparinés au
lithium ou au sodium.
2-2-2- Mise en culture
- La mise en culture a été être
réalisée avec du sang frais le jour même du
prélèvement.
- Étiqueter les tubes du milieu de culture avec le
numéro d'organisation.
- Travailler sous hotte à flux laminaire horizontale,
ouvrir les tubes et éviter de passer les mains
au-dessus des tubes.
- Mettre 10 gouttes de sang dans le milieu de culture PBMax.
- Fermer les tubes et les incuber horizontalement
(légèrement inclinés) dans une étuve à
37°C
pour une période de 72 heures.
2-2-3- Synchronisation
- Ajouter 100 ul de Thymidine après 48h de mise en culture
et les remettre en culture. 2-2-4- Lavage
- Retirer les tubes de l'étuve,
- Procéder à la centrifugation des tubes à
1500 tours par minute (tpm) durant 5 minutes 30,
- Verser le surnageant, ajouter environs 1 ml de PBS (le PBS aide
à enlever la thymidine),
- Vortexer pour bien mélanger,
- Mettre 10 ml de PBS (jusqu'à l'étiquette) et bien
mélanger,
- Centrifuger une deuxième fois et procéder
à un deuxième lavage « aspiration du surnageant,
dilution au PBS, mélanger au vortex, rajouter du PBS et
remettre à la centrifugeuse ».
2-2-5- Remise en culture
- Après centrifugation rajouter 1,5 ml de RPMI et
vortexer, - Compléter avec 5 ml de RPMI et 1,5 ml de SVF.
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Patients et méthodes
2-2-6- Blocage en métaphase
- Après incubation de 5h à 5h30, sous haute
à flux laminaire ajouter 60 ul de colchicine pure à l'aide d'une
micropipette (20-200 ìl) dans chaque tube, homogénéiser et
remettre à l'étuve en position horizontale pendant 30 minutes.
2-2-7- Choc hypotonique et préfixation
- Centrifuger les tubes de culture à 1500 tpm pendant 5
minutes 30. Sous hotte chimique, verser le surnageant et ajouter 1 à 2
ml de KCl à la concentration de 5,6 g/l préchauffé
à 37°C. - Vortexer et compléter avec 10 ml de KCl,
- Homogénéiser par retournements puis incuber en
position horizontale pendant 20 minutes.
2-2-8- Préfixation
- Procéder à la préparation du carnoy en
mélangeant 3V d'éthanol avec 1V d'acide acétique, -
Ajouter 0,5 ml à 1 ml de carnoy et homogénéiser par
retournements,
- Centrifuger les tubes de culture à 1500 tpm pendant 5
minutes 30, puis, sous la hotte, verser le surnageant.
2-2-9- Fixation
- Ajouter 1 à 2 ml de carnoy, vortexer et compléter
avec du carnoy,
- Homogénéiser par retournements et fixer à
température ambiante pendant 20 minutes,
- Centrifuger les tubes de culture à 1500 tpm pendant 5
minutes 30,
- Sous hotte chimique, verser le surnageant et refaire une de
deuxième fixation :
ajouter le carnoy, vortex, compléter jusqu'à 10 ml
et on met au réfrigérateur à 4°C.
2-2-10- Étalement
- Préchauffer jusqu'à 86°C. Placer les
lames dégraissées et les préchauffer en l'exposant
à l'humidité du bain marie. Laisser tomber deux gouttes de culot
à une certaine distance (~20 cm) de chaque lame, rincer au carnoy,
- Bien sécher les lames sur le bord du bain marie.
NB : Il faut savoir que les conditions
atmosphériques (température, humidité, pression
atmosphérique) influent sur la qualité des étalements.
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Patients et méthodes
2-2-11- Coloration
- Coloration sans dénaturation
- Placer directement les lames séchées dans le
Giemsa pendant 5 minutes,
- Sortir les lames et les rincer avec l'eau du robinet.
- Coloration avec dénaturation et
(RHG)
- Réhydrater les lames dans de l'eau distillée
durant 5 min.
- Plonger les lames dans la solution phosphate (NaH2PO4+2H2O)
à 86°C pendant 14 minutes,
- Plonger les lames dans le Giemsa durant 5 minutes,
- Rincer les lames à l'eau du robinet.
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