DEUXIEME PARTIE : MATERIEL
ET METHODES
2.1. Cadre de l'étude
Les essais ont été conduits au laboratoire de
Pathologie de la Station de l'IITA-Bénin située dans la Commune
d'Abomey-Calavi à 12 km au Nord de Cotonou. Elle s'étend sur une
superficie de 50 ha de terre dans le voisinage de l'Université
d'abomey-Calavi. C'est le Centre de Lutte Biologique pour l'Afrique.
2.2. Matériel
2.2.1. Matériel entomologique
Pour le déroulement de nos essais, nous avons
utilisé des chenilles de M. vitrata à deux
différents âges à savoir : 4 jours et 5 jours. Ces deux
âges larvaires correspondent respectivement aux stades L2 et au
début du stade L3 (Atachi, 1998). Toutes ces chenilles nous ont
été fournies par le Laboratoire d'élevage de la Section
niébé de la Station de l'IITABénin.
Nous avons aussi utilisé des parasitoïdes
femelles déjà accouplées de A. taragamae et
possédant toutes leurs potentialités génétiques.
Tous ces insectes nous ont été fournis par le Laboratoire
d'élevage de la Section niébé de notre élevage.
2.2.2. Matériel entomopathogène
Le virus polyédrose nucléaire (MaviNPV) ,
spécifique à M. vitrata qui est un virus
pathologène spécifique d'insectes les mieux connus dans le
contexte de la lutte biologique, a été utilisé ( Miller
et al., 1983). Ce virus a été importé de Taiwan
et introduit au Bénin par l'IITA en 2006.
2.3. Condition de laboratoire
Tous nos essais se sont déroulés dans une gamme de
température et d'humidité. La température variait entre 24
et 26°C avec une humidité relative variant entre 75 et 85%
2.4. Matériel de laboratoire
Plusieurs équipements ont été
utilisés au laboratoire au cours de nos travaux de recherche surtout
pour la production de virus :
- une hotte de marque BIOHAZARD MICROFLOW : c'est une
enceinte qui protège le manipulateur contre toute contamination,
explosion et brisure de verres. Elle permet aussi d'éviter les
microorganismes non désirés présents dans les alentours
immédiats de même que les particules et odeurs provenant de la
manipulation des produits ;
- un petit pulvérisateur de capacité 250 ml
nécessaire pour l'application de la suspension virale sur le milieu
nutritif artificiel lors de l'infestation en masse des chenilles ;
- une centrifugeuse de marque ALC-PK 121, série 30007057
CE, pour centrifuger le broyat lors de la purification du virus ;
- un microscope optique de marque LEICA DMLB muni d'une
caméra vidéo couleurs
JVG de marque SANYO, série TK-1280E, pour
visualiser les corps d'occlusion ;
- une microbalance de marque Denver Instrument (Max = 220 mg ;
Min = 10 mg, d = 0,1
mg) qui permet de peser la poudre de SDS (Dodecyle Sulfate de
Sodium) afin de
préparer la solution SDS 0,1% ;
- un homogénéiseur de marque JANKE &
KUNKEL-IKA, qui sert à faire dissoudre la poudre de SDS dans l'eau
distillée stérilisée ;
- un agitateur magnétique de marque JANKE &
KUNKEL-IKA qui sert à faire dissoudre la poudre de SDS dans l'eau
distillée stérilisée.
- un réfrigérateur de marque VESTFROST, dont la
température interne est maintenue à 4° C servant à la
conservation des suspensions virales ;
- un congélateur de marque LIEBHERR dont la
température interne est maintenue à - 12°C et qui sert
à conserver les chenilles mortes ou malades ;
- des boîtes pour garder les chenilles et les
parasitoïdes ;
- des toiles pour couvrir les boîtes et permettre aux
chenilles de respirer ;
- des plateaux dans lesquels on met les boîtes ;
- des étiquettes pour numéroter les boîtes
et les plateaux ;
- une boîte contenant du miel pour nourrir les
parasitoïdes ;
- un incubateur de marque Percival ayant l'image d'un
réfrigérateur dans lequel les
plateaux contenant les chenilles
sont stockées et gardées durant toute la durée de l'essai
;
- un hématimètre de type NEUBAVER qui est
l'élément indispensable pour la numération
du virus. Il
présente 25 grands carreaux subdivisés chacun en 16 petits
carreaux de
surface de base 1/400 mm2 et de profondeur 0,1 mm
;
- des lames et lamelles servant aux montages microscopiques pour
observer les chenilles mortes afin de constater la présence de virus
;
- une trousse à dissection comportant ciseaux, pincette
et pinceau ;
- un mixeur de marque WARING BLENDOR qui sert à broyer
les chenilles mortes au cours de la production ;
- un compteur manuel de marque VEEDOR-ROOT (V/R) qui sert
à compter afin de calculer les différentes concentrations ;
- un distillateur GFL de type 2008, fréquence 50/60,
puissances 6kw qui sert à préparer de l'eau distillée ;
- une autoclave de marque SYSTEC modèle 3870 EL type
TUTTAUER Autoclave permettant la stérilisation de certains
matériels utilisés au cours de l'essai ;
- des béchers, des erlenmeyers ;
- des désinfectants tels que : (l'alcool, l'eau de javel
et le savon MIR) pour nettoyer les
boîtes utilisées évitant ainsi toute
autre contamination pouvant biaiser les données ; - un
thermomètre et un hygromètre pour relever la température
et l'humidité relative ; - des micropipettes de capacité 10 ul et
1000jtl pour pipeter la quantité de la suspension
virale voulue ;
- un aspirateur muni d'embouchure servant à
prélever les parasitoïdes pour l'inoculation et ;
- des papiers aluminium et torchons pour emballer le reste du
milieu nutritif et nettoyer les outils utilisés.
2.5. Méthodes
Pour atteindre les objectifs que nous nous sommes fixés,
les étapes suivantes ont été adoptées.
2.5.1. Formation à la Station de l'Institut
International d'Agriculture Tropicale (IITA)
Une formation de deux mois a été
organisée à notre intention. Cette formation a eu lieu d'une
part, au niveau du prototype où se fait l'élevage en masse de
M. vitrata sur milieu artificiel, à l'insectarium où se
fait l'élevage en masse de A. taragamae et d'autre part, dans
la
section pathologie où la production en masse du virus se
fait.
A l'issue de notre formation, nous avons été
capable de :
- identifier les adultes (papillons) de M. vitrata ;
- identifier les différents stades larvaires;
- identifier les pupes et les adultes de A. taragamae
et ;
- produire en masse le virus MaviNPV.
Il est important de mentionner que tous les objectifs
préfixés pour la formation ont été atteints
à la fin de celle-ci.
2.5.2. Production en masse de Maruca vitrata
La production en masse des adultes de M. vitrata se
fait déjà au Laboratoire suivant les techniques d'élevage
développées par Jackai & Raulston (1988). La production en
masse consiste à produire en nombre très important des chenilles
de M. vitrata devant être infectées avec le virus.
Ainsi, cette production consiste à recueillir les
oeufs de M. vitrata dans les boîtes de 60cc qui sont
déposées sur le milieu nutritif artificiel à la veille de
l'éclosion. Dès l'éclosion, les chenilles quittent les
boîtes pour le milieu nutritif où elles s'alimentent
jusqu'à leur chrysalidation. A l'étape chrysalide, les chenilles
cessent de s'alimenter jusqu'à l'émergence des papillons. Ces
adultes sont transférés dans les cages d'élevage au sein
desquelles, des boîtes de Petri contenant du coton imbibé de
solution de saccharose à 10% et du coton imbibé d'eau
distillée comme substrat alimentaire sont mises. Trois jours
après leur émergence, les adultes sont soumis à
l'accouplement pendant 24 heures. Les femelles sont ensuite isolées dans
les boîtes de 60 cc et incubées dans une chambre noire pour la
ponte des oeufs. Les oeufs évoluent en chenilles de même âge
et sont nourries au milieu artificiel jusqu'au stade larvaire
désiré, isolées du milieu à l'aide des pincettes
pour servir à la production en masse du virus. La même technique
est utilisée pour assurer la fourniture régulière des
chenilles aux stades désirés pour nos essais.
2.5.3. Préparation du milieu nutritif artificiel de
Maruca vitrata
Pour préparer le milieu nutritif artificiel, il faut
en un premier temps, verser 59,2 g d' agar dans deux litres d'eau
distillée. On porte le mélange à ébullition,
remué à l'aide d'une cuillère pour éviter la
formation des grumeaux. On laisse le mélange ainsi obtenu se refroidir
jusqu'à une température de 60°C environ. Cette
température nous permet d'obtenir un gel qui est un fluide.
En second temps, on verse deux litres d'eau distillée
avec les ingrédients du tableau 6. Le mélange ainsi fait est
ajouté au mélange d'agar obtenu au préalable. L'ensemble
du mélange est remué énergiquement afin
d'homogénéiser le mélange. Après un moment de
remuage, le mélange ainsi obtenu est coulé sous hotte dans les
boîtes cylindriques réservées à cette fin. Il faut
noter que la hauteur du milieu coulé dans les boîtes est environ 1
cm. C'est de ce milieu nutritif que se nourrissent les chenilles jusqu'à
l'émergence des adultes.
Tableau 6 : La composition du milieu artificiel
d'élevage de M. vitrata et les
Rôles de quelques composantes.
Constituant
|
Rôle /utilité
|
Quantité
|
Premier mélange Eau
|
|
2000 ml,
|
Agar agar
|
Liant nécessaire pour donner une certaine
consistance au milieu
|
59,2 g,
|
Deuxième mélange
Farine de graine de
niébé
|
Utilisé pour rapprocher le milieu artificiel de la
nourriture naturelle des chenilles
|
400 g,
|
Farine de germe de blé
|
Permet d'apporter l'énergie à partir du glucose
pour assurer la croissance des chenilles
|
127 g,
|
Sucre
|
Permet d'apporter de l'énergie
|
60 g,
|
Mélange de sels de
Wesson
|
|
44 g,
|
Auréomicine
|
Antibiotique qui empêche le développement des
bactéries sur le milieu
|
11 g,
|
Acide sorbiques
|
Rôle de stabiliseur du milieu
|
6.82 g
|
Méthyl. Parahydroybenzoate
|
|
3.64 g,
|
Acide L. ascorbique
|
A un rôle phagostimulant pour les chenilles ; c'est un
élément nutritif indispensable à leur croissance
|
25 ml,
|
Acide acétique
|
Rôle de stabiliseurs du milieu
|
50 ml,
|
Formaldéhyde
|
Antibiotiques qui empêchent le développement des
bactéries sur le milieu
|
60 ml,
|
Hydroxyde de
potassium
|
|
22 ml,
|
Choline chloride
|
|
29.2ml
|
Vitamine B-complexe
|
|
30 ml
|
Eau
|
|
2000ml
|
|
Source : Jackai & Raulston, (1988)
2.5.4. Obtention et multiplication des adultes de Apanteles
taragamae
Les adultes de A. taragamae utilisés ont
été obtenus au centre AVRDC (Asian Vegetable Research and
Development Center) à Taïwan et introduits à l'insectarium
de l'IITA-Bénin où ils sont produits et élevés en
masse. A l'aide d'un aspirateur, on introduit deux (2) femelles fécondes
de A. taragamae dans chacune de ces boîtes. Ces dernières
sont ensuite couvertes par un tissu en mousseline sur lequel on dépose
une goutte de miel pour l'alimentation des parasitoïdes. Elles sont
ensuite fermées avec des couvercles perforés. Les femelles du
parasitoïde A. taragamae pondent dans les chenilles. Après
24 heures, les femelles sont retirées des boîtes. On introduit
ensuite dans les boîtes où séjournent les chenilles de
M. vitrata parasitées, un autre morceau du milieu nutritif
artificiel et un bout de papier torchon pour réduire l'humidité
dans les boîtes. Les oeufs de A. taragamae se développent
et éclosent à l'intérieur des chenilles. Sept à
huit jours après l'inoculation, les larves de A. taragamae
sortent des chenilles de M. vitrata et se transforment en pupes au
bout de quelques heures (Ekpodilé, 2006). Ensuite on procède au
dépouillement qui consiste à la collecte des pupes des
boîtes de 30 cc dans les boîtes cylindriques de 60 cc. On les
couvre de toile en mousseline sur laquelle on met une goutte de miel pour
l'alimentation des adultes dès leur émergence.
2.5.5. Production, Purification et Comptage du virus
MaviNPV
Dans le but de disposer d'une quantité suffisante de
suspension virale pour effectuer nos essais, nous avons procédé
à une production en masse du virus MaviNPV.
Pour produire le virus en masse, la suspension virale de
MaviNPV de concentration 4,07.108 PIB/ml préparée
à partir de la poudre de ce virus produite à Taïwan à
partir d'une autre lignée de chenille de M. vitrata a
été utilisée. Elle a été conservée au
réfrigérateur à 4°C.
· Méthode de production du virus
Le travail se fait sous hotte à flux laminaire pour que
l'inoculation se réalise sans
contamination et s'inspire des travaux de Shapiro (1986). Les
étapes sont les suivantes :
- 4000 chenilles de 2ème stade ont
été dépouillées au Laboratoire d'élevage de
M. vitrata ;
- une suspension virale à inoculer aux chenilles en
fonction du nombre de chenilles à
infecter est préparée ; soit à inoculer 5
iil de cette suspension à la dose virale de
104PIB/ml à chaque chenille ;
- sous une hotte, le milieu nutritif artificiel a
été découpé en petits morceaux cubiques sur
du papier aluminium ;
- le milieu nutritif artificiel ainsi découpé, a
été pulvérisé avec la suspension virale
préparée en prenant soin de bien mouiller chaque morceau cubique
;
- le milieu infecté est versé dans un bac
d'alimentation en plastique où les chenilles sont déposées
;
- les chenilles sont suivies quotidiennement ;
- après être nourries de la
quasi-totalité du milieu infecté, les chenilles sont
isolées par lots de cinq (05) dans les boîtes de 30 cc où
elles sont nourries au milieu nutritif sain, c'est-à- dire exempt de
suspension virale ;
- les chenilles infectées sont
récoltées. Les premiers symptômes apparaissent après
4 jours. Les chenilles infectées portent dans leur corps un pus
blanchâtre visible à travers la cuticule. La récolte se
fait avant la mort de la chenille pour éviter la contamination par les
spores de champignons et ;
- les chenilles récoltées sont stockées
dans un congélateur à - 12°C.
Au total 3568 chenilles malades ont été
collectées excepté celles éclatées et qui suintent
déjà. La production en masse a duré huit (08) jours
environ. Les chenilles gardées au congélateur sont soumises
à l'extraction et à la purification du virus.
· Extraction et purification du virus
C'est la méthode de centrifugation différentielle
décrite par Harrap et al. (1977) et Hunter et al.
(1984) pour les baculovirus qui est utilisée. Elle se déroule
comme suit :
- à l'aide d'un mixeur, les chenilles infectées
sont broyées et homogénéisées dans un
volume égal de 0,1% de Dodécyl Sulfate de Sodium
(SDS = Sodium Dodecyl
Sulphate) ;
- l'homogéinat obtenu est filtré (filtre de maille
de 90 iim) pour enlever les cuticules et les débris grossiers ;
- le filtrat obtenu est rincé avec de la solution de SDS
à 0,1% puis distribué dans des tubes appelés godets ;
le filtrat est centrifugé à 100g avec une vitesse
de 1350 rpm pendant 25 secondes puis on recupère les surnageants ; le
culot solide du bas reste dans le tube ;
- Le culot est lavé au SDS à 0,1% ;
l'homogéinat a été distribué dans les tubes
à essai puis centrifugé avec une vitesse de 6750 rpm pendant 30
mn ;
- L'opération précédente a
été répétée 3 fois de suite ;
- Les culots obtenus ont été lavés avec de
l'eau distillée stérilisée puis centrifugés une
dernière fois avec une vitesse de 6750 rpm pendant 30 mn.
Cette étape a permis d'éliminer les graisses
contenues dans la suspension virale. La suspension virale obtenue a
été mise dans un flacon puis conservée à 4°C
au réfrigérateur pour comptage des corps d'occlusion au
microscope optique muni d'une caméra digitale.
La méthode qui est utilisée ici a un haut
degré de pureté (Cherry et al., 1997) mais
l'inconvénient est sa cherté (Jones, 1994). Elle convient aux
applications à petite échelle.
· Comptage du virus de la polyédrose
nucléaire.
Ici, trois opérations sont exécutées : les
dilutions, le comptage proprement dit et les calculs de concentrations virales
(Wigley, 1980)
La détermination précise de la concentration
virale est essentielle. Toute erreur dans l'estimation de la concentration
influence les résultats et fausse la discussion.
> Les différentes dilutions
Les premières opérations effectuées dans le
cadre du comptage concernent les différentes dilutions de la suspension
virale mère contenue dans le flacon.
La première dilution (10-1) se fait avec 900 u
l d'eau distillée stérilisée et 100 u l de la suspension
mère. A partir de celle-ci, cinq (05) autres dilutions ont
été faites.
10-1 = 100 u l de suspension virale mère dans
900 u l d'eau distillée stérilisée (1ère
dilution) 1 0-2 = 100 u l de la 1ère dilution dans
900 u l d'eau distillée stérilisée (2ème
dilution)
1 0-3 = 100 u l de la 2ème dilution
dans 900 u l d'eau distillée stérilisée
(3ème dilution) 1 0-4 = 100 u l de la
3ème dilution dans 900 u l d'eau distillée
stérilisée (4ème dilution) 1 0-5 =
100 u l de la 4ème dilution dans 900 u l d'eau
distillée stérilisée (5ème dilution)
10-6 = 100 ul de la 5ème dilution dans 900 ul
d'eau distillée stérilisée (6ème
dilution)
> Le comptage des corps d'inclusion au microscope.
Le comptage se fait avec l'hématimètre de
Noubar amélioré qui est convenable aux suspensions de Baculovirus
hautement purifiées. L'hématimètre est une lame en verre
ayant sur sa surface 25 grands carreaux (5 sur la ligne, 5 sur la colonne)
contenant chacun 16 petits carrés de 0,002 5 m2 chacun. La
profondeur du champ est 0,1 mm. Cette méthode a été
décrite par Wigley (1980) et améliorée par Hunter-Fujita
et al. (1998).
Elle suit les étapes suivantes :
- l'hématimètre et sa lamelle ont
été nettoyés avec de l'eau savonneuse et de l'eau de javel
puis séchés ;
- parmi les différentes dilutions faites, la solution la
moins concentrée est choisie ;
- la solution choisie est bien
homogénéisée et on prélève 10 ul de cette
solution qu'on introduit dans la chambre de l'hématimètre
après avoir pris soin de le fermer au préalable ; - la
préparation faite a été montée au microscope
optique puis on passe à la mise au
point ;
- avec un compteur manuel, on a compté tous les corps
d'inclusion retrouvés dans les 25 grands carreaux du champ de
l'hématimètre.
Le comptage manuel est répété 2 fois pour
calculer la concentration de la suspension
X1 = nombre de corps d'inclusion énuméré
dans le champ 1.
X2 = nombre de corps d'inclusion énuméré
dans le champ 2
Xm = moyenne des deux comptages
> Calcul des concentrations virales.
La concentration de la suspension virale a été
calculée par la formule de (Grzywacz, 1987). C = F Xm/KV ; avec
C = Concentration de la suspension virale
Xm = Moyenne des comptages
F = 1/D = Facteur de dilution, avec D = dilution faite ;
K = nombre de petits carreaux sur l'hématimètre
V = Volume de l'hématimètre ; V = 0,1 mm x 0,0025
mm2 = 2,5. 10-4 mm3
· Méthode de préparation d'une
suspension virale à partir d'une suspension virale mère
connue.
Le stock de suspension virale précédemment
préparée a une concentration élevée
(4,07.108PIB/ml). Ainsi pour obtenir la concentration voulue pour
les inocula, on est obligé de faire des dilutions. Pour y parvenir, on a
utilisé la méthode qui suit :
C1 V1 = C2 V2 où C1 est la concentration de la
suspension virale mère et C2 est la concentration de la nouvelle
suspension virale à préparer, mais connue et fixée
d'avance. Dans notre cas ici, elle est de 2,16.103 PIB/ml.
V1 est le volume de la suspension à prélever,
V2 est le volume de la nouvelle suspension.
2.6. Protocole des expériences
Trois expériences ont été menées
au Laboratoire de la section Entomopathologie de l'IITA. En effet, nos essais
ont été stockés dans un incubateur au sein duquel
règne une de température variant entre 24 et 26°C et une
humidité relative variant entre 75 et 85%. Tous ces paramètres
sont fonctions des conditions environnementales favorables pour les
différentes unités (espèces)
entomologiques utilisées. Au cours de ces expériences,
différents paramètres ont été
évalués. Ainsi, pour les différentes méthodes de
contamination du parasitoïde, les paramètres suivants ont
été mesurés : la transmission et l'acquisition du virus
par le parasitoïde (A. taragamae) ; évaluation des effets
conjugués du virus et du parasitoïde.
2.6.1. Expérience : conception des
différentes méthodes de Contamination de
Apanteles taragamae
Pour la réalisation de nos essais, nous avons
utilisé une suspension virale de concentration 2,16.103
PIB/ml.
Cette suspension a été préparée par
la méthode suivante :
- Nous avons prélevé un volume donné de
la suspension virale mère. Pour chercher ce
volume, nous avons
maintenu la concentration initiale qui est 2,16.103 PIB/ml. Le
nombre de
chenilles à infecter est connu ; à partir de ces
données, le volume de la suspension virale mère
C1 x nbre de chenille
est prélevé : Vmère =
Cmère
Vmère = Volume de la suspension virale mère
à prélever
C1 = Concentration de la suspension virale à
préparer
n = Nombre de chenilles
Cmère = Concentration de la suspension virale
mère.
Après, on a supposé qu'une chenille peut
être infectée par une quantité de suspension virale de
5iil. Ainsi, le volume total pour infecter les chenilles est obtenu en faisant
le volume par chenille multiplié par le nombre total de chenilles. Pour
cela, la quantité d'eau distillée et stérilisée est
obtenue en soustrayant du volume total, le volume de la suspension virale
mère.
En effet, trois méthodes de contamination ont
été définies pour effectuer nos essais afin d'atteindre
les objectifs prédéfinis.
· Première méthode de contamination
(T1)
Elle consiste à contaminer l'ovipositeur du
parasitoïde femelle adulte à l'aide d'un pinceau plongé
préalablement dans une suspension contenant des corps d'inclusion. Etant
donné que le parasitoïde est un Hyménoptère, on a
essayé de le faire endormir à une température basse
(4°C) pour pouvoir toucher effectivement l'ovipositeur par le pinceau.
Après la contamination, on a orienté la lumière de la
lampe de la binoculaire sur le parasitoïde pour le réveiller.
Ensuite on met les parasitoïde pendant 2 heures et 24 heures, dans une
boîte
contenant un mélange de 30 chenilles de
M.vitrata au stade L2 et au début de L3 (5ème jour)
à raison de 15 chenilles par stade, pour faire l'inoculation.
Après, le parasitoïde est retiré et mis dans une autre
boîte. On isole ensuite les chenilles à raison d'une chenille par
boîte pour s'assurer de l'effectivité de la piqûre de la
chenille par le parasitoïde .Dans chaque boîte est mis du milieu
nutritif artificiel sain c'est-à-dire exempt de tout virus pour nourrir
chaque chenille. Cette chenille est suivie jusqu'à la mort et est
écrasée pour être observée au microscope afin
d'identifier la présence des corps d'inclusion ou à la pupaison
après piqûre. Les pupes qui en sont sorties, sont
collectées de chaque boîte et sont mises dans une autre
boîte couverte par une toile sur laquelle du miel sera mis pour nourrir
les adultes de parasitoïde qui seront émergés 3 jours
après la pupaison. Après l'émergence, à deux
femelles considérées comme la première
génération, sont soumises trente (30) chenilles saines de
M.vitrata de sorte que toutes les femelles soient inoculées.
Ainsi, ces chenilles ont été examinées au microscope
après leur mort pour voir la présence de virus.
La même opération est faite pour un
parasitoïde contaminé et laissé après 24 heures.
· Deuxième méthode de
contamination (T2)
Les mêmes opérations, comme dans le cas
précédent, sont reprises seulement, ici, on évite de
toucher à l'ovipositeur tout en contaminant toute la surface du corps du
parasitoïde .La suite des opérations demeure la même que
précédemment.
· Troisième méthode de contamination
(T3)
Elle consiste à contaminer le milieu nutritif qui,
pulvérisé sous hotte, sert de nourriture aux chenilles
préalablement à jeun pendant 24 heures.Ainsi on découpe le
milieu nutritif en de petits carrés afin que le milieu soit bien
imprégné de la suspension virale de concentration
2.16103 PIB/ml. Après, le milieu nutritif est mis dans une
boîte de 60cc contenant un mélange de 30 chenilles aux stades L2
et L3. Après 24 heures, les chenilles sont retirées de cette
boîte pour être mises dans une boîte contenant du milieu sain
pendant 12 heures. Après cette phase, ces chenilles sont retirées
à nouveau de cette boîte pour être mises dans une autre
boîte sans milieu nutritif. Dans cette boîte, elles subissent
l'action de deux parasitoïdes femelles saines pendant 2 heures et 24
heures. Chacune des chenilles est mise ensuite dans une boîte contenant
du milieu nutritif artificiel sain c'est-à-dire exempt de tout virus
pouvant le contaminer. Chacune des chenilles est suivie jusqu'à la mort
et est écrasée pour être observée au microscope afin
de constater la présence des corps d'inclusion. Les chenilles peuvent
donner de pupes ou non avant de mourir. Les pupes sont collectées de
chaque boîte
et sont mises chacune dans une autre boîte couverte par
une toile sur laquelle du miel est mis pour nourrir les adultes de
parasitoïde qui ont émergé 3 jours après la pupaison.
Il est soumis à chacune des femelles émergées, une
chenille de M.vitrata. Ainsi ces chenilles sont examinées au
microscope après leur mort pour voir la présence de virus.
La même opération est faite pour le délai de
24 heures.
Chaque expérience est répétée 5
fois.
Pour chacune des méthodes, nous avons utilisé deux
parasitoides pour 30 chenilles et par durée représentant ainsi
une répétition.
· Témoin (T0)
Le témoin a été realisé avec des
parasitoïdes non contaminés.A ces parasitoides, sont soumises 30
chenilles saines en fonction des durées.Chaque témoin est
répété 5 fois.
2-6-2 Analyses statistiques
Les données sont enregistrées avec le logiciel
Excel version (2001). Nous avons fait l'analyse de variance (ANOVA ; Analysis
of Variance) en utilisant la procédure GLM (Generalized Linear Model) du
programme statistique SAS Version 8. Les moyennes sont séparées
par le test de Student-Newman et Keuls.
Les moyennes cumulées de mortalité,
d'émergence et de présence de virus ont subi la transformation
arc sinus dans le test de Student et de Newman et Keuls pour l'analyse de la
variance afin de stabiliser la variance et rendre homogène la
population.
Nous sommes partis d'une génération de
parasitoïdes notée Go. Les tests utilisés prennent seulement
en compte les parasitoïdes de la première génération
G1.
TROISIEME PARTIE : RESULTATS
3.1- Acquisition et Transmission du virus par les
parasitoïdes aux chenilles
de Maruca vitrata à partir des
différentes méthodes de Contamination.
3.1.1- Comparaison de la mortalité des
chenilles
Pour toutes les méthodes utilisées, on a
enregistré des chenilles mortes et ceci durant les deux temps
utilisés.
· Comparaison de la mortalité des chenilles entre
les différentes méthodes de contamination durant 2 heures
d'inoculation.
L'analyse de la variance a indiqué une
différence significative (au seuil de 5%) entre la mortalité des
chenilles due au virus (toutes méthodes de contamination confondues) et
le témoin.Cependant, deux (2) heures après l'inoculation,la
mortalité des chenilles ne diffère pas significativement entre
les diffèrentes méthodes de contamination (Tableau 7).
· Comparaison de la mortalité des chenilles entre
les différentes méthodes de contamination durant 24 heures.
L'analyse du tableau 7 révèle, vingt quatre
heures après l'inoculation, la mortalité des chenilles est
significativement élevée au niveau des diffèrentes
méthodes de contamination en comparaison avec le témoin.
Toutefois, l'analyse de variance ne révèle aucune difference
significative entre les differentes méthodes de contamination.
Les moyennes cumulées pour les deux durées,
révèlent une différence significative au seuil de 5 %.
Tableau 7. Mortalité des chenilles de
Maruca vitrata en fonction de differentes méthodes de
contamination : 2h et 24h après l'inoculation par le virus.
Traitements
|
Durée de l'essai
|
Moyenne
|
|
24 H
|
|
0,43 b
|
0,44 b
|
0,43 B
|
T1
|
0,91a
|
0,96 a
|
0,93 A
|
T2
|
0,94 a
|
0,97 a
|
0,95 A
|
T3
|
0,90 a
|
0,98 a
|
0,94 A
|
P>F
|
<0,0001***
|
<0,0001***
|
-
|
Cv%
|
11,18
|
9,15
|
-
|
Moyenne
|
0,79A
|
0,84 A
|
-
|
|
Les moyennes suivies de la même lettre ne sont pas
statistiquement différentes au seuil de 5% ; *** : différence
significative au seuil de 0,1%
Les résultats d'ANOVA montrent une différence
hautement significative entre méthodes de contamination de 2 h et 24 h
avec le témoin.
3.1.2 - Comparaison de l'existence de virus dans les
chenilles mortes
· Comparaison de l'existence de virus entre les
différentes méthodes de contamination durant 2 heures
d'inoculation.
L'analyse du nombre moyen cumulé de virus
présents dans les chenilles mortes révèle une
différence significative entre les méthodes et le témoin
non contaminé avec le virus (Tableau 7). Toutefois, aucune
différence n'est observée entre ces différentes
méthodes.
· Comparaison de l'existence de virus entre les
différentes méthodes de contamination durant 24 heures.
L'analyse du nombre moyen cumulé de virus
présents dans les chenilles mortes pour une durée de 24 h de
contamination révèle une différence significative entre
les méthodes utilisées et le témoin (Tableau 7). Par
contre, aucune différence n'est observée entre ces
différentes méthodes.
La comparaison des effets des deux durées n'a
montré aucune différence significative.
Tableau 8. Présence de Virus dans les
chenilles de Maruca vitrata en fonction de differentes méthodes
de contamination : 2h et 24h après l'inoculation par le virus.
Traitements
|
Durée de l'essai
|
Moyenne
|
|
24 H
|
|
0 b
|
0 b
|
0 B
|
T1
|
0,91 a
|
0,96 a
|
0,93 A
|
T2
|
0,94 a
|
0,97 a
|
0,95 A
|
T3
|
0,90 a
|
0,98 a
|
0,94 A
|
P>F
|
<0,0001***
|
<0,0001***
|
-
|
Cv%
|
12,8
|
10,26
|
-
|
Moyenne
|
0,68 A
|
0,73 A
|
-
|
|
Les moyennes suivies de la même lettre ne sont pas
statistiquement différentes au seuil de 5% ; *** : différence
significative au seuil de 0,1%
L'analyse globale d'ANOVA révèle une
différence hautement significative pour différentes
méthodes et aussi pour les durées d'acquisition du virus.
3.1.3- Comparaison de l'émergence des
parasitoïdes
· Comparaison de l'émergence après 2 heures
d'inoculation
L'analyse de variance n'a révélé aucune
difference significative entre les méthodes pour ce qui concerne le taux
d'émergence des parasitoides après 2h d'inoculation (Tableau 8).
La structuration des moyennes de l'émergence n'a présenté
aucune différence significative entre les différentes
méthodes de contamination. Mais, par contre il y a une différence
significative au seuil de 5 % entre les méthodes et le témoin.
· Comparaison de l'émergence en fonction de : 24
heures d'inoculation.
La structuration des moyennes révèle une
différence hautement significative entre les méthodes d'une part
et entre les méthodes et le témoin d'autre part avec un
coefficient de variation (CV = 9,19 %).
Les moyennes des durées ne sont pas statistiquement
différentes. (Tableau 8). L'analyse dans ANOVA révèle une
différence significative pour les différentes méthodes en
ce qui concerne l'émergence des parasitoïdes.
L'analyse de la variance n'a présenté aucune
différence entre les deux durées utilisées. Tous les
résultats sont consignés dans le tableau 9.
Tableau 9. La structuration des moyennes de
l'émergence des parasitoïdes (moyennes#177;erreur standard) issues
de l'analyse de la variance suivant le test de Student, Newman et Keuls.
|
Traitements
|
Durée de l'essai
|
|
Moyenne
|
|
2 H
|
24 H
|
|
|
T0
|
0,41 b
|
0,42 d
|
0,41 C
|
|
T1
|
0,63 a
|
0,57 c
|
0,60 B
|
|
T2
|
0,73 a
|
0,69 b
|
0,71 A
|
|
T3
|
0,67 a
|
0,85 a
|
0,76 A
|
|
P>F
|
0,0009***
|
<0,0001***
|
-
|
|
cv%
|
12
|
9,19
|
-
|
|
Moyenne
|
0,61 A
|
0,63 A
|
-
|
Les moyennes suivies de la même lettre ne sont pas
statistiquement différentes au seuil de 5% ; * * * : différence
significative au seuil de 0,1%
Tableau 10. Analyse de la variance à
deux critères de classification, modèle croisé mixte, des
paramètres de mortalité, d'émergence des parasitoïdes
et de leur infection au virus dans un essai de 4 traitements suivant deux temps
(2H et 24 H).
|
Sources
de variation
|
DL
|
Les carrés moyens
|
|
Mortalité
|
Emergence
|
Virus
|
|
Traitements
|
3
|
4,362 ***
|
1,096 ***
|
18,978 ***
|
|
Temps
|
1
|
0,488 ns
|
0,037 ns
|
0,45 8 ns
|
|
Traitement*Temps
|
3
|
0,068 ns
|
0,163 *
|
0,078 ns
|
|
Erreur
|
32
|
0,060
|
0,03 8
|
0,056
|
|
Total
|
39
|
-
|
-
|
-
|
|
Cv
|
-
|
10,14
|
10,4
|
11,5
|
Ces données ont subi une transformation arc sinus ; ns
: différence non significative au seuil de 5% ; * : différence
significative au seuil de 5% ; ** : différence significative au seuil de
1% ; *** : différence significative au seuil de 0,1%
QUARTRIEME PARTIE : DISCUSSION
4.1. Effet d'acquisition et de transmission du virus
4.1.1. Mortalité
De l'analyse globale des résultats, les
différentes méthodes ont un effet très hautement
significatif sur la mortalité des chenilles de M. vitrata
comparées au témoin (parasitoides non infectés mais
inoculés aux chenilles de M.vitrata saines). Cela signifie que
ces méthodes engendrent plus de mortalité que le témoin.Ce
qui nous conduit à dire que l'effet combiné du virus et du
parasitoïde a agi sur les chenilles de Maruca vitrata. Cette
observation confirme celle de Raimo et al. (1977), qui ont
démontré qu'il y a plus de mortalité des chenilles de
Lymantria dispar (Lepidoptera: Noctuidae) lorsque Apanteles
melanoscelus (Ratzeburg) est infecté avec le virus que lorsqu'il ne
l'est pas. En effet, Reardan & Podgwaite (1976) ont rapporté qu'il
existe une corrélation positive entre les actions de NPV et les adultes
de A. melanoscelus sur les populations de chenilles.
4.1.2. Présence de virus
L'analyse des chenilles mortes a révélé
la présence de virus en leur sein. Les parasitoïdes
contaminés ont donc pu transmettre le virus aux chenilles de M.
vitrata. Les progénitures des parasitoïdes contaminés
ont également transmis le virus à des chenilles saines de M.
vitrata. Ceci signifie qu'il y a acquisition du virus, c'est dire que
A. taragamae constitue un vecteur de Mavi NPV, ce qui confirme les
tests de Raimo et al. (1977) qui ont montré que A.
melanoscelus était un vecteur capable de transmettre des doses
létales de NPV pour les chenilles.
Ainsi, toutes les méthodes de contamination
utilisées dans la présente étude ont permis aux
parasitoïdes d'acquérir et de transmettre le virus aussi bien aux
chenilles qu'aux parasitoïdes provenant des chenilles contaminées.
Ces observations sont similaires à celles rapportées par Dung
et al. (2005) sur Meteows pulchricornis (Hymenoptera :
Braconidae) dans les chenilles de Spodoptera litura (Lepidoptera :
Noctuidae). Ces auteurs ont observé qu'une femelle de M.
pulchricornis émergée à partir de chenilles de
Spodoptera litura (Lepidoptera : Noctuidae) infectées, transmet le
virus à n'importe quel hôte sain et peut être
considérée comme un agent efficace de dispersion du virus. La
transmission du virus par les parasitoïdes peut être
catégorisée en 2 termes : un vecteur mécanique dans la
translocation du virus comme le résultat de la contamination d'une
partie du corps de l'hôte en contact avec une source d'aliment
infecté (Irabagon & Brooks, 1974 ; Sait et al., 1996) et un
vecteur
biologique dans la translocation du virus comme un
résultat d'une inoculation directe de l'hôte par un ovipositeur
contaminé par des virus (Levin et al., 1983 ; Hamm et
al., 1985).
Les études du comportement des hôtes
sélectionnés par les parasitoïdes en relation avec les
infections virales ont été conduites par plusieurs auteurs. Ainsi
Caballero et al. (1991), ont observé que les taux de
parasitisme des chenilles de Agrotis segetum (Lepidoptera :
Nocturidae) par Apanteles telengai (Hymenoptera : Braconidae) et
Aleiodes gasteratus (Hymenoptera : Ichneumonidae) sont plus
élevés que la mortalité des chenilles causée par
l'infection des Granulovirus.
4.1.3 Influence des Délais d'inoculation
Les analyses ont montré qu'il n'existe aucune
différence significative entre les deux délais d'inoculation
utilisés. Cela signifie, que le temps d'inoculation n'a aucun effet sur
la possibilité de transmission et d'acquisition du virus par le
parasitoïde. Ceci confirme les résultats obtenus par Raimo et
al.(1977) qui ont rapporté que le temps d'inoculation du
parasitoïde de A. melanoscelus contaminé avec le virus NPV
n'a aucun effet dans la transmission du virus aux chenilles de L.
dispar.
Nos tests démontrent qu'il existe une différence
significative pour l'émergence entre les différentes
méthodes de contamination utilisées et le témoin. En
effet, cela signifie que pour les différentes méthodes, nous
n'obtenons pas le même taux d'émergence, ce qui infirme les
résultats obtenus par Raimo et al. (1977) qui par contre n'ont
observé aucune différence significative. Ceci pourrait être
expliqué par les conditions hygrométriques. Les variations de
température au cours de notre étude ont été de
l'ordre de 24 à 26°C et l'humidité relative de l'ordre de 75
à 85%. Par contre, Raimo et al. (1977) ont travaillé
sous une température constante de 20°C et 50% d'humidité
relative.
L'analyse des résultats n'a présenté
aucune différence significative entre les deux délais. Ceci
signifie que les durées utilisées n'ont aucun effet sur la
mortalité et la transmission du virus. Mais l'interaction entre les
méthodes et le temps révèle une différence
signification de l'effet du facteur temps pour l'émergence des
parasitoïdes. Ceci signifie que les différentes méthodes de
contaminées appliqués ne se comportent pas de la même
façon pour l'émergence d'une durée d'inoculation à
une autre.
| 
