2.2.3- Méthode
d'identification des germes
2.2.3.1-
Prélèvement
Les prélèvements d'organes ont
été effectués de façon aseptique à l'aide
d'une pince hémostatique à dents de souris et d'une paire de
ciseaux stérilisées. Quant aux prélèvements
liquides, ils ont été réalisés à l'aide d'un
écouvillon stérile.
2.2.3.2- Isolement
Les organes prélevés ont été mis
en culture dans du bouillon enrichi (annexe 3), puis incubés une nuit
à l'étuve à 37°C. Ces cultures ont été
ensemencées par épuisement le lendemain sur de la gélose
enrichie (annexe 3) coulée en boîte de Pétri et
incubées à nouveau pendant 24 Heures à 37 ° C. En ce
qui concerne les prélèvements réalisés à
l'aide d'écouvillons, ils ont été directement
ensemencés sur de la gélose enrichie et incubés pendant 24
heures à 37 ° C.
2.2.3.3- Identification
A partir d'une culture pure, les étapes de
l'identification ont été :
- les tests d'orientations (annexe 4) : Il s'agit de la
coloration de Gram, du test de catalase, d'oxydase, de mobilité et d'O/F
(Oxydation-Fermentation)
- la recherche des caractères biochimiques par les
méthodes décrites par COWAN(1993) à l'aide d'une
mini-galerie.
a) Confection de frottis
L'opération débute par la coloration de Gram
qui se fait après l'obtention des colonies isolées. Chaque
colonie observée est émulsionnée dans une goutte d'eau
distillée stérile déposée sur une lame propre. A
l'aide d'une oëse la colonie est étalée,
séchée puis fixée à la flamme du bec Bunsen avant
d'être colorée par la méthode de Gram (annexe 4).
Cette coloration a permis de distinguer les coques des
bacilles ainsi que les bactéries Gram positif des bactéries Gram
négatif, ce qui a favorisé l'orientation du choix des
différents milieux sélectifs.
Les lames fixées et colorées ont
été observées à l'immersion à l'objectif
100.
b) Identification des bacilles
Gram-
Les bacilles Gram négatif isolés en culture
pure ont été ensemencés sur Mac-conkey (annexe 3). Les
colonies obtenues ont été soumises au test de mobilité,
de catalase, d'oxydase et de réduction de lactose afin de
différencier les entérobactéries, des non
entérobactéries et de diviser le groupe des
entérobactéries en coccobacilles et bacilles.
Ces tests ont été complétés par
une mini galerie (annexe 5) permettant d'identifier les différentes
espèces de bacilles Gram négatif, conformément à la
technique de COWAN (1993).
c) Identification des coques
Gram+
Les Coques Gram+ ont été
soumis au test de catalase afin de différencier les
staphylocoques (catalase+), des streptocoques (catalase-). Le dégagement
du bulle gazeuse signifie que la colonie est catalase (+).
Outre le test de la catalase, ces colonies ont
été ensemencées sur milieu de Chapman (annexe 3) ;
spécifique aux staphylocoques.
d) Identification des bacilles Gram+
Les bacilles Gram+ du genre Bacillus ont
été identifiés par les caractères biochimiques de
COWAN (1993) après les tests de catalase et d'oxydase. Pour la recherche
du genre Clostridium, nous avons utilisé le système
GasPaKR qui crée un milieu anaérobie strict.
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