3.5- Séquençage
Depuis, les années 1970 une autre découverte
notable dans le domaine de la biologie moléculaire a été
développée « méthode de lecture de la séquence
d'un fragment d'ADN ». L'analyse des séquences d'ADN est l'une des
bases de la compréhension de l'évolution moléculaire. A
ses débuts, le séquençage nécessitait une
procédure laborieuse de clonage dans des vecteurs bactériens, et
le temps et le coût de ces manipulations limitaient son utilisation. Il
faudra attendre la découverte de l'amplification de fragments d'ADN par
PCR pour que le séquençage prenne la place qu'il occupe de nos
jours dans les études des mécanismes
d'évolution. La réaction de séquence est
basée sur une amplification PCR au cours de laquelle une certaine
proportion de dideoxynucleotides (ddNTP ou "nucléotides stop") stoppant
l'élongation du fragment sont utilisés, en plus des dNTP. Les
cycles d'amplifications sont similaires à ceux employés pour une
amplification "classique", mais seule une amorce est utilisée pour
chaque réaction. La synthèse d'ADN débute à
l'extrémité 3' de l'amorce et, à chaque cycle
d'amplification un certain pourcentage de fragments est stoppé par
l'incorporation d'un ddNTP lors de l'élongation. Il en résulte
une amplification unidirectionnelle, dont la cinétique n'est pas
sigmoïde (comme pour une amplification "classique"), mais linéaire.
Selon que le marquage des ddNTP est radioactif ou fluorescent, l'amplification
des séquences se fait dans une ou quatre réactions PCR. Le
séquençage est bien évidemment, la principale technique de
détection du polymorphisme de l'ADN. Il est très largement
utilisé, notamment pour des études phylogénétiques
au travers du séquençage de l'ADN mitochondrial (ADNmt). Dans le
cadre des espèces domestiques, Loftus et al. (1994) et Luikart
et al. (2001) ont mis en évidence plusieurs centres de
domestication des races bovines et caprines, au travers du
séquençage de portions de l'ADNmt. Le séquençage
selon (Klungland et Vage, 1999 ; Lagziel et al., 2000) est bien
évidemment un passage obligé pour obtenir la séquence de
gènes économiquement importants et pour mettre en évidence
leur polymorphisme.
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