Memoire Online - Etude du pouvoir coagulant et antioxydant de l’artichaut sauvage et de l’artichaut cultivé au maroc

UNIVERSITE CHOUAIB DOUKKALI
Faculté des Sciences EL Jadida
Département de Biologie

« Biotechnologie Appliquée à la Production Végétale
et Industrie Agroalimentaire »

Etude du pouvoir coagulant et antioxydant de
l'artichaut sauvage et de l'artichaut cultivé au Maroc

Avant toute chose, je remercie Dieu, le tout puissant, de m'avoir donné la force, la
patience et la bonne santé pour achever ce travail.
Je remercie le doyen de la Faculté des Sciences le professeur Mohammed BLAGHEN
qui m'a accueilli dans cette institution. Grace à lui j'ai eu la chance de la découvrir et en
fin d'aboutir aux résultats de ce modeste travail.

Je tiens à remercier également le professeur Tayeb KOUSSA le coordinateur de Master
Biotechnologie Appliquée à la Production végétale et Industrie Agroalimentaire pour ses
conseils et orientation qu'il trouve ici mes sincères remerciements.

J'adresse mes sincères remerciements à Madame Aouatif BENALI mon encadrante dans
le laboratoire de Technologie Alimentaire de l'Institut National de Recherche
Agronomique de Rabat, d'avoir accepté de m'encadrer lors de mon stage de fin d'études,
je la remercie pour sa disponibilité et son aide tout le long de ce modeste travail, qu'elle
trouve ici toutes mes gratitudes.
Je remercie vivement le Professeur Abdelali BITAR malgré ses préoccupations a accepté
de m'accompagner lors de la rédaction et correction de ce mémoire, ses conseils et
recommandations m'ont été si noble.

Vifs remerciements aux membres du jury Professeur DHABI Abdallah, Professeur
CHAOUTI Abdellatif et Professeur BITAR Abdelali qui ont accepté de juger et
d'évaluer mon travail. Leurs conseils et recommandations m'ont envoyé à une
amélioration digne.
Mes remerciements à Monsieur Abdenbi SAADI Technicien du laboratoire de
Technologie Alimentaire de l'INRA Rabat sans lui ce travail n'aura pas été achevé.
Je tiens également à remercier tous les professeurs du master BAVIA, pour leurs efforts
fournis enfin d'arriver à ce jour, qu'ils trouvent ici mes sincères remerciements.
Un grand merci à tous mes amis de la 6è promotion BAVIA, pour leur aide, leur amitié,
leur gentillesse et leur soutien moral.
Nous remercions également toute personne ayant contribué de près ou de loin à la
réalisation de ce travail.
Un grand merci à vous tous.

A mes parents, leur affection m'a toujours été d'un grand soutien. Qu'ils trouvent dans ce
travail le fruit de leur indéfectible effort et qu'ils puissent récompenser leur patience. Que
le bon Dieu vous accorde santé et longévité.

A mes frères et ma soeur : Méthode, Aimable, Régis et Estella. C'est pour moi l'occasion
de vous remercier pour tous les efforts, la prière, sacrifices consentis à l'endroit de ma
modeste personne. Notre force résidera toujours dans notre entente. Que notre amour
fraternel demeure inébranlable. Infini attachement.

A mes oncles Léonidas NDABUTWINTARA et Pontien BATAKANWA. Leur soutien financier et moral ainsi que le respect mutuel m'ont permis d'arriver à ce moment

A mes amis Ménard SABUSHIMIKE et Nadia NITUYIZERE pour leur conseil et soutien moral m'ont aidé à arriver au bout.

III.3.3. Discussion sur les composés phénoliques et l'activité antioxydante 49

Figure 3. Structure d'un globule de matière grasse du lait (Lapointe-Vignola, 2002). 12

Figure 9. Modification de la structure micellaire au cours de l'acidification 25

Figure 10. Modification de la structure micellaire au cours de la coagulation présure. 25

Figure 11. Formation d'un caillé par action de la présure sur les caséines du lait 27
Figure 12. Effet du stress salin sur la concentration des flavonoïdes au niveau des

Figure 32. Pourcentage d'inhibition d'un radical DPPH sur les deux stades. 47

Figure 33. Pourcentage d'inhibition d'un radical ABTS sur les deux stades. 49

Figure 34. Activité protéolytique de deux extraits des fleurs comparée avec celle de la

Tableau 1: Identification des pics UHPLC - UV - MS des métabolites dans les extraits de feuilles d'artichaut (les pics sont énumérés dans l'ordre du temps de rétention en

Tableau 2. Valeur alimentaire comparative des cultures maraîchères (FAO, 1998) 7

Tableau 3. Arbre taxonomique de l'artichaut cultivé et l'artichaut sauvage (Lemordant,

Tableau 6. Composition vitaminique moyenne du lait cru (Amiot et coll., 2002). 14

Tableau 13. Temps de floculation différents selon les concentrations de l'extrait et de

L'Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), est un établissement public dont les origines remontent à 1914 avec la création des premiers services de la recherche agricole officiel. Il a connu dernièrement une réorganisation structurelle visant la modernisation de son processus de gestion.

L'INRA opère à travers dix centres régionaux de la recherche agronomique et 23 domaines expérimentaux répartis sur le territoire national et couvrant les divers agro systèmes du pays. L'INRA vise à :

? Améliorer la productivité, la compétitivité et la durabilité de la production

Le Centre Régional de la Recherche Agronomique de Rabat (CRRA) mène ses activités de recherche dans les domaines prioritaires tels que : Environnementale et la conservation des ressources naturelles, Protection des plantes, Production animale et les fourrages, Biotechnologie, Technologie Agro-alimentaire et qualité, Amélioration des plantes, conservation et valorisation des ressources phylogénétiques.

L'unité d'accueil au sein du centre de Rabat notamment celle de la technologie alimentaire a pour mission principale de mener des activités de recherche pour la valorisation des produits agricoles d'intérêt et la maitrise de la qualité de la sécurité sanitaire des produits alimentaires.

Introduction

Un grand nombre de plantes (plantes épices, légumes, plantes aromatiques, médicinales et autre) possèdent des propriétés biologiques très intéressantes qui trouvent des applications dans divers domaines à savoir en agroalimentaire, médecine, pharmacie, cosmétologie et agriculture (Madina, 2008). Cependant les composés phénoliques (principalement flavonoïdes, acides phénoliques et tannins) constituent une richesse largement exploitée par les industries agro-alimentaire, cosmétique et pharmaceutique (Nkhili, 2009). L'extraction de principes actifs de ces métabolites est une étape très importante dans leur isolement, aussi bien que dans leur identification (Mahmoudi et al., 2013).

Une consommation élevée de fruits et légumes a pu être associée à la diminution du risque des maladies métaboliques telles que les pathologies cardiovasculaires, l'obésité, le diabète, les maladies neurodégénératives, le cancer dans de nombreuses études épidémiologiques. De multiples constituants et micronutriments de ces aliments tels que les fibres, les vitamines, les minéraux et les polyphénols jouent potentiellement un rôle dans cet effet protecteur qui s'explique en partie par leurs propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires (Roumeissa et al., 2015).

Les enzymes sont des protéines qui agissent comme des catalyseurs hautement efficaces dans les réactions biochimiques. L'utilisation d'enzymes a souvent de nombreux avantages car cela ne peut pas être obtenu avec les traitements chimiques traditionnels. Elles comprennent une qualité de produit supérieure, des coûts de fabrication inférieurs, moins de déchets et en consommation d'énergie. Les enzymes industrielles représentent le coeur des procédés biotechnologiques(Guevara et Raul, 2018).

L'hydrolyse des protéines alimentaires, par exemple, est mise en oeuvre pour diverses fonctions: amélioration des caractéristiques nutritionnelles, retarder la détérioration, modification des propriétés fonctionnelles différentes (solubilité, moussage, coagulation, et capacités d'émulsification), prévention des interactions indésirables, changement de saveurs et d'odeurs et l'élimination des facteurs toxiques ou inhibiteurs (Pardo et al., 2000).

L'étape clé de la réussite d'un fromage quel que soit son type est la coagulation. Elle consiste à la formation d'un gel suite à des modifications physico-chimiques intervenant sur les micelles de caséines du lait. L'agent coagulant le plus anciennement utilisé en fromagerie est la présure (Zikiou, 2013). La coagulation du lait est traditionnellement obtenue par action de la présure extraite des caillettes provenant des petits ruminants. Le

caractère irrégulier de l'approvisionnement en présure a conduit les industries à utiliser des préparations enzymatiques coagulant le lait dans lesquelles la chymosine est remplacée plus ou moins totalement par d'autres enzymes à mode d'action analogue, et ce, parallèlement à l'usage traditionnel de la présure de veau qui assurait encore la coagulation de 90 % des fromages en 1980 (Desmazeaud, 1983).

Plusieurs recherches ont été activement pressées ces dernières années, visant à la mise en évidence des enzymes de remplacement dits succédanés de la présure de différentes origines (animales, végétales et microbiennes), capables de coaguler le lait et d'assurer des meilleurs rendements fromagers, l'industrie est à présent capable de produire, en quantité pratiquement illimité.

A part la valeur nutritive importante de l'artichaut, les fleurs contiennent des protéases capables de coaguler le lait ayant des propriétés catalytiques similaires à la chymosine. Ses bractées sont riches en composés phénoliques en grande quantité les polyphénols et les flavonoïdes (Petropoulos et al., 2019).

Dans ce contexte, l'objectif global de ce travail est centré sur l'étude de deux plantes de la famille des astéracées Cynara scolymus et Cynara cardunculus afin d'étudier l'activité protéolytique et coagulante des fleurs en comparaison avec celle de la présure d'origine microbienne. Dans une deuxième partie nous allons procéder au dosage de composés phénoliques contenu dans les bractées tout en évaluant leur pouvoir d'inhibition des radicaux libres DPPH (2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle) et ABTS (acide 2,2'-azino-bis (3-éthylbenzothiazoline-6-sulphonique).

CHAPITRE I. Généralités sur les plantes étudiées

Au Moyen-Orient on appelle souvent l'artichaut (Figure 1) «Ardhi Chouki», qui signifie littéralement «épine de terre». Les mots «Artichaut» en français, «Carciofo» en italien, «Artichoke» en anglais, «Alcachofa» en espagnol et «Artishoke» en allemand, trouvent tous leur origine dans le mot arabe «Harsciof», qui signifie «épine de terre» (Dridi, 2003). Bigot et al., (1984) ont été les premiers à affronter le problème de la propagation in vitro de l'artichaut, ils utilisèrent du matériel issu de graines pour contourner les difficultés de désinfection du matériel provenant du champ. Pena-Iglesias et Ayuso (1974) sont partis de

culture d'apex méristèmatique ; ils ont réussi à obtenir des plants indemnes de virus de `Tudela', cependant, l'enracinement demeurait problématique (Dridi, 2003).

I.2.2. Origine

L'artichaut est une culture appartenant à la famille des Astéracées (Tableau 3), originaires de la région méditerranéenne où il est traditionnellement cultivé et couramment consommé comme légume. Il est connu depuis l'Antiquité comme une nourriture et un remède en médecine (Negro et al., 2012).

L'artichaut est une plante vivace de 8-15 dm, dressée, raide, robuste anguleuse (Figure 1). Les feuilles sont blanchâtres ou tomenteuses (couverte d'une pubescence cotonneuse, entrecroisée, feutrée) en dessous dépourvues d'épines, pennatipartites (feuille pennée, à partitions dépassant le milieu de chaque demi-limbe), les supérieures pennatifides (feuille pennée, à lobes atteignant à peu près le milieu de chaque demi-limbe), lobées ou presque entières. Le capitule est souvent gros.

L'involucre (réunion des bractées, verticillées ou imbriquées, insérées à la base d'une ombelle ou de toute inflorescence) à folioles largement ovales ordinairement échancrées et mucronées au sommet, charnues à la base (Dridi, 2003).

I.2.4. Répartition géographique au Maroc

La culture d'artichaut est largement distribuée dans le monde. La production mondiale avoisine 1,32 millions de tonnes (FAO, 2003) sur une superficie d'environ 122 mille hectares. 67% des superficies mondiales en artichaut sont localisées en Europe et produisent 66% de la production mondiale.

Au Maroc, la superficie de la culture de l'artichaut représente 2,5% de la superficie mondiale et produit 3,4% de la production mondiale (Elattir et al., 2009).

La superficie de la culture d'artichaut a été de l'ordre de 8.500 Ha en 1964 et ceci grâce à la haute valeur ajoutée dégagée par les exportations vers la France. Cependant en 1981, la superficie a chuté à 6.200 Ha puis à environ 2.200 Ha en 1984. Cette chute s'explique surtout par la réduction des exportations, par la baisse des prix sur le marché local, et par la sécheresse qui a causé la dégénérescence des plants (Elattir et al., 2009).

Les principales régions de production sont le Gharb (80%) suivi de la Basse Moulouya, le Saïs et le Haouz. Les surfaces cultivées sont de l'ordre de 4130ha (2007/08), alors que les superficies potentiellement cultivables rien que dans le Gharb sont estimées à 6000 ha (Krira, 2010)

L'artichaut (Cynara scolymus L.) est une plante méditerranéenne largement utilisée en médecine traditionnelle pour ses propriétés biologiques attribuées essentiellement aux polyphénols (Mahmoudi et al., 2013).

Les composants chimiques de l'artichaut ont fait l'objet de nombreuses études et se sont révélés être une riche source d'acides caféoylquiniques et de flavonoïdes (Tableau 1). Parmi les hydroxycinnamates, les acides chlorogéniques et l'acide 1,5-dicaféoylquinique sont les composés prédominants (Petropoulos et al., 2019). Cependant, l'acide 1,3-dicaffeoylquinique était le composé dicaffeoylquinique majeur rapporté par d'autres études (Tableau 1) (El et al., 2014).

Les fleurs des espèces de plantes à cardon (C. cardunculus et C. scolymus) contiennent une grande quantité de protéases de coagulation du lait (cardosines et cynarases) ayant des propriétés catalytiques similaires à la chymosine. Ils appartiennent au même groupe de

chymosine (protéinase aspartique, EC. 3.4.23), jusqu'ici considérée comme la meilleure des protéases pour la fabrication du fromage (Guevara et Raul, 2018).

Tableau 1: Identification des pics UHPLC - UV - MS des métabolites dans les extraits de feuilles d'artichaut (les pics sont énumérés dans l'ordre du temps de rétention en minutes sur la colonne RP-18 (El et al., 2014).

Peak No.	R (min)	Identification	UV (nm)	M-H (m/z)
1	5.90	Luteoline-o-glucoside	345	705
2	6.03	5-o- Acide Caffeoylquinique (acide chlorogenique	2950 shd, 325	353
3	6.12	3-o-acide feruloylquinique	290 shd, 325	367
4	7.35	Luteoline-7-o-rutinoside (scolymoside)	271,341	593
5	7.63	Luteoline-7-o-glucoside (cynaroside)	270,344	447
6	7.70	Hespertine glucoside	Nd	463
7	7.87	Apigenine-7-o-rhamnosyl-glucoside	Nd	577
8	7.91	Luteoline-7-o-glucuronide	Nd	461
9	7.95	1,5-di-o- acide caffeoylquinique	296 shd, 325	515
10	8.02	1,5-di-o-acide caffeoylquinique(isomère)	296 shd, 325	515
11	8.09	Acide caffeique conjugué (inconnu)	296 shd, 325	519
12	8.15	Luteoline-7-o-acetyl-glucoside	Nd	489
13	8.27	Apigenine-7-o-glucoside (cosmoside)	265,330	431
14	9.92	Luteoline	330	285
15	10.32	Cynarasaponine E	Nd	809
16	10.88	Acide Trihydroxy octadecadenoique	Nd	327
17	11.28	Cynarasaponine J	Nd	941
18	11.42	Acide trihydroxy octadecenoique	Nd	329
19	11.53	Cynarasaponine C	Nd	793
20	15.62	Acide hydroxy octadecatrienoique	Nd	293
21	16.43	Acide hydroxy octadecadienoique	Nd	295

I.2.6. Utilisations

L'artichaut est cultivé pour ses capitules, dotés de principes actifs dont la nature phénolique joue un rôle prépondérant dans leurs caractéristiques organoleptiques. En alimentation, la valeur nutritive globale du coeur d'artichaut est comparable, sinon supérieure, à celle de la majorité des cultures maraîchères (Tableau 2) (Dridi, 2003).

Tableau 2: Valeur alimentaire comparative des cultures maraîchères (FAO, 1998).

Les feuilles sont principalement utilisées pour la production d'extraits commerciaux de nutraceutiques, enrichies en polyphénols, considérant que les capitules et les racines, sont une source d'inuline, utilisés comme ingrédient pré biotique dans les aliments fonctionnels (Petropoulos et al., 2019). La tête d'artichaut (capitulum) est un aliment sain en raison de sa faible teneur en graisse et riches en fibres, protéines, minéraux et composés phénoliques (Nouraei et al., 2018).

En plus d'être consommé comme aliment, l'artichaut est reconnu comme un médicament à base de plantes (El et al., 2014). Les extraits de feuilles peuvent réduire le cholestérol dans le sérum selon deux mécanismes : soit par l'induction de son élimination, soit par une action inhibitrice sur sa synthèse de novo (Dridi, 2003).

Cynara cardunculus est une plante herbacée vivace érigée pouvant mesurer entre 60 et 150 cm (Figure 2), mais qui peut atteindre la hauteur de 2 m avec un écart de 2 m (W. of Australia, 2016). Il a une grande racine pivotante qui régénère chaque année (Pepper, 1996). Les tiges sont épaisses et rigides, se ramifient souvent dans les parties supérieures,

elles sont côtelées longitudinalement et recouvertes d'un duvet de coton. hors sol une partie de la plante meurt chaque année, mais les ramifications se développent à partir du porte-greffe lors de la prochaine saison de croissance (Kelly, 2000; Botanica, 2011).

Les feuilles sont vert grisâtre sur la face supérieure et légèrement velues et forment une rosette basale pouvant atteindre 120 x 30 cm. Les extrémités des feuilles sont couvertes d'épines jaunâtres / oranges de 5 à 20 mm de long (Kelly, 2000).

L'inflorescence est isolée au sommet d'une branche, sur une tige épaisse de 1 à 6 cm de long. Les capitules sont presque en forme arrondis et ils sont constitués de fleurons bleus, roses ou violets disposés sur un réceptacle charnu, et entourée d'un certain nombre de grandes bractées. Les bractées sont de couleur violacée et se terminent en une épine aplatie (Kelly, 2000).

II.2. Taxonomie et nomenclature

L'artichaut sauvage est une espèce acceptée de la famille des Asteraceae, parfois appelée famille des Compositae (Tableau 3). C'est parfois appelé à tort artichaut, une espèce cultivée étroitement apparentée (Gatto et al., 2013).

Tableau 3. Arbre taxonomique de l'artichaut cultivé et l'artichaut sauvage
(Lemordant, 1982 ; Kelly, 2000).

Des recherches ont été menées pour préparer du biodiesel à partir d'huile de Cynara cardunculus (Alexandre et al., 2012), utilisant le méthanol pour caractériser les esters méthyliques, en vue de l'utilisation pour les moteurs à biodiesel (Encinar et al. 2002) ou après transestérification à l'éthanol pour caractériser les esters éthyliques obtenus, en vue de son utilisation pour l'allumage par compression moteurs (Pandino et al., 2011).

La capacité antioxydante des feuilles et de la tige florale dépendait qualitativement et quantitativement du profil des acides phénoliques et des flavonoïdes. Les acides phénoliques et les flavonoïdes contenus dans des parties normalement non consommées

d'artichaut sauvage et cultivé pourraient être exploités en tant que sources d'antioxydants naturels (Pandino et al., 2011).

II.5. Constituants chimiques

Différentes études ont été menées au cours des dernières années pour évaluer l'huile de Cynara cardunculus, en fonction des rendements obtenus et des différents modes d'application. Les grains de l'artichaut sauvage (Cynara cardunculus) ont montré qu'ils renferment des huiles en composition d'acides gras (Raccuia et al., 2012).

Les principaux composés présents dans la feuille étaient les dérivés de lutéoline dans les artichauts du globe et les dérivés d'apigénine chez le cardon sauvage et cultivé. En plus de Cimiciusa di Mazzarino (var. Scolymus), les acides caféoylquiniques représentent les principaux composés phénoliques de la tige florale. `Sylvestris Creta' (var. sylvestris) et `Violetto di Sicilia' (var. scolymus) présentent la teneur la plus élevée en acide caféoylquinique 95% du total des polyphénols mesurés. (Pandino et al., 2011; KhaKhaldi et al., 2013)

CHAPITRE II : La coagulation du lait

A. Le lait

Le lait était défini en 1908 au cours du congrès international de la répression des fraudes à Genève comme étant « Le produit intégral de la traite totale et ininterrompue d'une femelle laitière bien portante, bien nourrie et nom surmenée. Le lait doit être recueilli proprement et ne doit pas contenir du colostrum : les laits mal propres présentent des inconvénients tant du point de vue hygiénique que du point de vue économique » ( Codou Latyr, 1997; Souheila, 2011).

Le lait est un liquide sécrété par les glandes mammaires des femelles après la naissance du jeune. Il s'agit d'un fluide aqueux opaque, blanc, légèrement bleuté, d'une saveur douceâtre et d'un pH (6.6 à 6.8) légèrement acide, proche de la neutralité, il peut être considéré comme une émulsion de matière grasse dans une solution aqueuse (Zikiou, 2013).

De très nombreux facteurs peuvent intervenir sur la composition du lait dont l'espèce, la race, le stade de lactation, la saison, l'état sanitaire, l'alimentation (Zikiou, 2013).

? Une émulsion de matière grasse ou phase grasse constituée de globules gras et de vitamines liposolubles (A, D) ;

? Une phase colloïdale qui est une suspension de caséines sous forme de micelles ;

? Une phase aqueuse qui contient les constituants solubles du lait (protéines solubles, lactose, vitamine B et C, sels minéraux, azote non protéique) ;

? Une phase gazeuse composée d'O2, d'azote et de CO2 dissous qui représente environ 5% du volume du lait.

L'analyse du lait permet de distinguer des composants chimiques majeurs (Tableau 4) (eau, matière grasse, matières azotées, glucides et matières minérales) et mineurs (vitamines et enzymes) (Codou Latyr, 1997).

L'eau du lait provient du sang par filtration au niveau de la glande mammaire. Elle représente la phase dispersante des constituants non hydrosolubles du lait et la phase solvant des substances solubles (glucides, matières minérales et vitamines hydrosolubles) (Tableau 4) (Codou Latyr, 1997).

Dans le lait de vache, les glucides sont représentés essentiellement par le lactose, ou galactosido 1-4 glucose, qui est synthétisé dans la glande mammaire. C'est un disaccharide à saveur relativement peu sucré, peu soluble, et possèdent un groupement réducteur.

Le lactose joue un rôle important dans les produits laitiers en tant que substrat de fermentation pour les bactéries lactiques qui l'hydrolysent en glucose et galactose, puis transforment ces hexoses en acide lactique. (Codou Latyr, 1997).

Le lait de vache, comme le lait de femme, contient environ 35 g/L de lipides. Les lipides du lait sont en partie synthétisés dans la glande mammaire. Le fait que le lait de vache présente un rapport acides gras saturés/acides gras insaturés bien plus élevé que celui de la nourriture végétale ingérée par l'animal s'explique toutefois aussi par le fait que des acides gras non saturés sont hydrolysés dans le rumen de la vache, sous l'influence des bactéries (Codou Latyr, 1997).

Les globules gras (Figure 3) dans le lait sont en émulsion huile dans l'eau, chaque globule est formé de différentes couches de triglycérides : les triglycérides liquides, à bas point de fusion, sont au centre du globule et les triglycérides solides, à haut point de fusion se superpose au précédents. Le globule est entouré à la périphérie d'une sorte d'enveloppe contenant des phospholipides, qui jouent le rôle d'émulsifiant dans la stabilité du globule gras, et des lipoprotéines (Zikiou, 2013). L'objectif principal de ces lipides est de fournir une source d'énergie au nouveau-né.

Figure 3. Structure d'un globule de matière grasse du lait (Lapointe-Vignola, 2002).

L'azote non protéique (ANP) correspond à toutes les molécules renfermant de l'azote, autres que les protéines. Selon (Alais, 1984), ce sont des substances de bas poids moléculaire. Elles ne précipitent pas dans les conditions de précipitation des protéines du lait : acidification, élévation de température ou addition de présure. Elles sont peu abondantes 1,5 à 16 g/L dans le lait de vache (Zikiou, 2013).

Les matières minérales sont représentées dans le lait à une proportion variant de 8 à 12 grammes par litre. C'est une fraction mineure par rapport aux lipides, glucides et protides, mais leur importance est considérable. Les matières salines les plus importantes sont les citrates, le calcium, le phosphore et les chlorures.

Le lait contient des quantités importantes de différents minéraux (Tableau 5). Les principaux minéraux sont calcium, magnésium, sodium et potassium pour les cations et phosphate, chlorure et citrate pour les anions (Souheila, 2011).

Les concentrations de calcium rapportées dans diverses études varient de 25 à 35 mg / 100 ml. Le phosphore à 13 - 16 mg / 100 ml est beaucoup plus constant mais proportionnellement plus faible à la caséine et au calcium que dans les laits de la plupart des autres espèces (Williamson, 1944).

Le lait a presque toutes les vitamines appartenant aux deux groupes liposoluble et hydrosoluble (Tableau 6). Ces vitamines sont essentiellement apportées par l'alimentation

et se retrouvent dans le lait sous forme de traces. Ainsi leur taux est en relation avec le régime alimentaire et aussi avec le stade de lactation. Certaines vitamines sont inactivées par la chaleur, par l'oxydation ou par la photolyse (effet de la lumière solaire et des rayonnements) (Laurent, 1992).

On distingue d'une part les vitamines hydrosolubles (vitamine du groupe B et vitamine C) en quantité constantes, et d'autre part les vitamines liposolubles (A, D, E et K) (Tableau 6).

Tableau 6. Composition vitaminique moyenne du lait cru (Amiot et coll., 2002).

Vitamines	Teneur moyenne (ìg/100ml)
Vitamines liposolubles Vitamine A (+carotènes) Vitamine D Vitamine E Vitamine K		40 2.4 100 5
Vitamines hydrosolubles
Vitamine C (acide ascorbique)		200
Vitamine B1 (thiamine)		45
Vitamine B2 (riboflavine)		175
Vitamine B6 (pyridoxine)		50
Vitamine B12 cyanocobalamine)		0.45
Niacine et niacinamide		90
Acide pantothénique		350
Acide folique		5.5
Vitamine H (biotine)		3.5

Le lait est un fluide sécrété par la femelle de toutes les espèces de mammifères, principalement pour répondre aux besoins nutritionnels complets du nouveau-né.

Le lait de renne et de lapin domestique contient aux environs de 12% de protéines. Cette valeur est supérieure à celle que peut contenir le lait humain ou de vache. (Tableau 7) (Fox, 2011). Différentes structures et propriétés physicochimiques distinguent les protéines du lait. On les classe en deux catégories d'après leur solubilité dans l'eau et leur stabilité : d'une part, les différentes caséines qui sont en suspension colloïdale, qui se regroupent sous forme de micelles, d'autre part les protéines du sérum qui sont en solution colloïdale et qui précipitent sous l'action de la chaleur (Zikiou, 2013).

Espèces	Solides totaux	Lipides	Protéines	Lactose	Cendres
Humain	12.2	3.8	1.0	7.0	0.2
Vache	12.7	4.5	2.9	4.1	0.8
Mouton	19.3	7.4	4.5	4.8	1.0
Porc	18.8	6.8	4.8	5.5	_
Cheval	11.2	1.9	2.5	6.2	0.5
Ane	11.7	1.4	2.0	7.4	0.5
Renne	33.1	16.9	11.5	2.8	_
Lapin domestique	32.8	18.3	11.9	2.1	1.8
Bison	14.6	3.5	4.5	5.1	0.8
Eléphant indien	31.9	11.6	4.9	4.7	0.7
Ours polaire	47.6	33.1	10.9	0.3	1.4
Phoque gris	67.7	53.1	11.2	0.7	_

La caséine représente 80 % des protéines du lait. La caséine constitue le coagulum qui donnera naissance, après égouttage et maturation, au fromage.

L'appellation caséine regroupe en fait quatre protéines majeures : les caséines OEs1, OEs2, f3 et K et des protéines mineures (existant en plus faibles quantités) ainsi que des composants issus de l'hydrolyse de la caséine f3 par la plasmine (ã caséines et protéase-peptones). La micelle de caséine est une particule sphérique d'un diamètre de 150 à 200 nm (Ado, 2017).

Chez les mammifères, elles permettent la transmission des nutriments, et particulièrement de minéraux de la mère à sa progéniture. Les caséines sont des protéines phosphorylées et naturellement riches en minéraux. De plus, elles sont principalement associées au phosphate de calcium qui est indispensable pour le développement des os. Les concentrations en calcium dans le lait sont si importantes que sans la présence des caséines celui-ci précipiterait (McMahon et Brown, 2010).

Jusqu'à maintenant, on a proposé différents modèles structuraux de micelles et il semble clair que les micelles sont formées de sous-micelles reliées ensemble par des ponts phosphate de calcium. Les sous-micelles périphériques sont plus hydrophiles et contiennent une plus grande proportion de K-caséine.

La submicelle de caséine n'a pas une structure homogène (Figure 4). Elle possède un coeur hydrophobe constitué par la caséine f3 associée aux parties hydrophobes des autres caséines. En périphérie, on retrouve les parties hydrophiles des différentes caséines (partie phosphorylée pour les caséines áS1 et S2) ainsi que la partie glycosylée de la caséine K. La caséine kappa serait susceptible de stabiliser 10 fois son propre poids en caséine áS1, áS2 et f3 (Soumeya, 2017).

De nombreux modèles ont été proposés au fur et à mesure de l'avancée des connaissances sur les caractéristiques physico-chimiques des micelles de caséine. Ces modèles reposent sur des méthodologies différentes et peuvent être classé en trois catégories: les modèles coeur-enveloppe, les modèles à sous unités et les modèles à structure ouverte (Dalgleish et Corredig, 2012).

La micelle serait composée de sous unités, appelées submicelles de 10 à 20nm de diamètre qui seraient l'unité de base de la macrostructure. Ces submicelles sont structurées comme dans le modèle de Waugh, mais elles sont reliées entre elles par du phosphate de calcium colloïdal (Schmidt et al., 1982).

C'est un modèle basé sur la polymérisation du réseau caséinique. Il s'agit d'un assemblage de caséines individuelles par des liaisons hydrophobes et des ponts de phosphate de calcium colloïdal. La formation et l'intégrité des micelles sont contrôlées par un équilibre entre les forces attractives et répulsives des micelles de caséines (forces hydrophobes, forces électrostatiques). D'un autre côté, du fait que la caséine k ne peut avoir que des liaisons hydrophobes avec les autres caséines, elle semble agir comme une chaîne terminale (superficielle) stabilisante (Horne, 2002).

La formation et l'organisation de la micelle de caséine implique des liaisons de nature hydrophobe et des liaisons électrostatiques entre les caséines. Les liaisons résultant de l'affinité entre les groupements phosphoséryls et les ions calcium et magnésium interviennent aussi (Brule et al., 1997). La structure et les propriétés de la micelle de caséine ont été largement étudiées en raison de son rôle déterminant dans les propriétés physico-chimiques du lait et des produits laitiers (Ado, 2017).

B. Les Enzymes coagulantes

Les protéases (également appelées enzymes protéolytiques ou protéinases) désignent un groupe d'enzymes dont la fonction catalytique consiste à hydrolyser les liaisons peptidiques des protéines. Celles-ci sont largement distribuées dans tous les végétaux, animaux et microorganismes (Guevara et Raul, 2018).

Elles sont impliquées dans une grande diversité de processus cellulaires, notamment la photo-inhibition dans les chloroplastes, les mécanismes de défense, la mort cellulaire programmée et la photo morphogenèse chez les jeunes plants en développement (Mockaitis et Estelle, 2008).

Les protéases sont également impliquées dans tous les aspects du cycle de vie des plantes, de la mobilisation des protéines de stockage pendant la germination des graines au lancement des programmes de mort cellulaire et de sénescence (Guevara et Raul, 2018).

La présure est un coagulant du lait essentiel à la fabrication du fromage. Elle fait passer le lait de l'état liquide à l'état solide. Le phénomène de coagulation du lait est rendu possible

grâce à la caséine (protéine contenue dans le lait). La caséine réagit lorsqu'elle est placée dans un milieu acide généralement obtenu lorsqu'on ajoute de la présure ou des ferments lactiques dans le lait.

Il existe divers types de présures non issus des sucs gastriques d'animaux. En effet, la technique de coagulation du lait n'est pas unique, puisque d'autres méthodes quoique plus lentes permettent cette étape. Entre autres, il y a la présure microbienne, dont l'enzyme coagulante est issue de la fermentation de champignons comme le Rhizomucor miehei, le Rhizomucor pusillus, le Mucor miehei. Des présures végétales, extraites de plantes comme le figuier, le gaillet jaune, le petit artichaut sauvage ou les fleurs de chardon sauvage existent également (Guevara et Raul, 2018).

La présure est toujours considérée comme étant l'enzyme la plus adaptée pour coaguler le lait dans la production fromagère, cependant, son utilisation est confrontée à la contrainte de sacrifice des jeunes veaux (Mohanty et al., 2003). En conséquence l'industrie fromagère subit une crise dans l'approvisionnement de ce coagulant et cette situation a donné une impulsion aux recherches sur les enzymes de remplacement de la présure, elles concernent diverses sources potentielles de protéases (Zikiou, 2013).

La production de fromage est en croissance constante et il est prévu que, dans un prochain avenir, l'utilisation des protéases d'origine végétale vont augmenter, produisant un nouveau fromage de spécialité favorisant le marché aux fromages (Guevara et Raul, 2018).

La chymosine est sécrétée inactive sous forme de « pro-chymosine » dans la caillette. Sous l'action de l'acidité provenant du suc gastrique, elle se transforme en « chymosine active ». C'est une protéase acide aspartate. Son poids moléculaire est de 30 700 Da. Elle est constituée d'une seule chaîne peptidique renfermant 323 acides aminés (Foltmann et al.,1979).

La pepsine est une protéase acide sécrétée dans le sac gastrique de tous les mammifères après sevrage sous forme de précurseur inactif appelé pepsinogène d'un poids moléculaire de 42000 daltons. Contrairement à la chymosine, la pepsine à une acidité plus élevée et une activité coagulante faible (Soumeya, 2017).

La présure traditionnelle telle que la chymosine est très utilisé dans les industries fromagères. La forte demande subite l'approvisionnement de la présure est plus difficile. Des travaux ont été lancés afin de trouver d'autres sources potentielles de protéase pour remplacer la présure nommées des succédanés de présure (Nouani et al., 2009).

Les enzymes coagulantes appelées aussi les succédanés de présure sont classées en 3 catégories selon l'origine de l'enzyme :

A Bonne solubilité dans l'eau : celle-ci conditionne la répartition du produit et permet l'obtention d'une coagulation homogène dans toute la masse du lait.

A Une odeur et couleur faible ou nulle de façon à ne pas modifier l'aspect et les qualités organoleptiques du fromage.

A Un degré de pureté élevée, indispensable pour éviter divers accidents dus à la prolifération des micro-organismes indésirables ou à des activités d'enzymes contaminants.

A Activité antibiotique nulle de façon à ne pas perturber le développement des ferments lactiques au cours du processus d'élaboration du fromage.

Les succédanés de présure d'origine animale les plus utilisés sont d'origine bovine, porcine et du poulet. La pepsine A provient de l'estomac d'animaux adultes, sa masse moléculaire est de 33370 Da et contient 313 acides aminés (Fox, 2011). La pepsine bovine a une activité protéolytique proche de celle de la chymosine, cette activité dépend du pH du milieu, et est généralement active dans des milieux acide ou le pH est de 1.5 à 2 et l'activité soit plus élevée. Par contre dans des milieux basique pH supérieure de 6.3, l'activité baisse rapidement et le lait ne coagule pas (Eck et Gillis, 1997).

Nommée aussi pepsine B d'origine porcine, elle a une particularité plus limitée que la pepsine bovine et dégrade faiblement l'hémoglobine (Linden et Humbert, 1991). Elle est composée d'une seule chaine polypeptidique de 321 résidus d'acides aminés et sa masse moléculaire est de 35000 Da (Kageyama et Takahashi, 1976).

Nommée aussi pepsine C, elle a une forte activité vis-à-vis l'hémoglobine (Linden et Humbert, 1991). Elle est extrait de pro ventricule de poulet utilisé pour la fabrication du fromage à pâte molle, les résultats obtenus sont comparés avec un fromage fait par la présure confirme qu'il n y a aucune différence dans le rendement et la qualité du fromage.

Des travaux très récents menés sur des substrats de plantes ont été publiés montrant le nouvel intérêt que suscite les protéases d'origine végétale (Chazarra et al., 2007; Petropoulos et al., 2019). Il existe plusieurs préparations coagulantes issues de règne végétale et sont extraite par macération de différentes parties de plantes supérieures (Eck et Gillis, 1997).

Parmi les espèces connues de climat tempéré on peut citer : le gaillet, l'artichaut et le chardon (Silva et Malkata, 2005). Actuellement la tendance tend vers les coagulants végétaux grâce à la disponibilité de matériel végétale et la forte stabilité de coagulase (Nadhour et Belloul, 2003).

Plusieurs protéases d'origine microbienne ont été utilisées dans la fabrication du fromage car ils ont le même fonctionnement que celle de la chymosine. Elles sont produites par fermentation. Elles présentent des inconvénients telle que une grande activité protéolytique, un rendement faible dans la fabrication fromagère (Harboe et al., 2010).

Parmi les espèces microbiennes utilisées pour la fabrication à grande échelle sont : Rhizomucor miehei, Rhizomucor pusillus, Cryphonectria parasitica (Claverie-Martìn et Vega-Hernàndez, 2007). D'après Germonville (2003), la protéase aspartique produite par Rhizomucor miehei est la plus utilisée dans les industries fromagères. En Algérie une protéase transgénique d'origine microbienne Aspergillus niger var. awamori est actuellement utilisée par les fromagers dans la coagulation du lait.

La coagulation du lait est provoquée par la dénaturation de la caséine, protéine majoritaire du lait. Les différentes caséines sont organisées en micelles qui sont des agrégats de plusieurs molécules de caséine. C'est un complexe de protéines phosphorées précipitant à pH 4,6 ou bien sous l'action d'enzymes spécifiques comme par exemple la chymosine,

extrait de macération de la caillette de veau qui, avec une autre enzyme, la pepsine, forment la présure.

La coagulation enzymatique est une étape essentielle dans la plupart des fromages où la composante caséine du système protéique du lait forme un réseau de gel qui piège les graisses. La chymosine bovine est l'enzyme préférée utilisée à cette fin; cependant, des protéases d'origine animale, microbienne et végétale ont également été utilisées avec succès (Guevara et Raul, 2018).

II.4.2. Types de coagulation

La coagulation du lait est une étape importante dans la préparation du fromage. Il s'agit de la transformation du lait liquide en un gel, appelé aussi coagulum ou caillé. On distingue deux types de coagulation : la coagulation acide et la coagulation enzymatique. Cependant, en fromagerie, la coagulation du lait résulte le plus souvent de l'action combinée d'une enzyme et de l'acidification, seule varie l'importance relative de leur action coagulante respective (Soumeya, 2017).

Le mécanisme de la coagulation par voie fermentaire dite coagulation acide est de nature électrochimique. Elle est induite par les ferments lactiques. Les genres Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, et Streptococcus sont les plus utilisés tout en variant en fonction des fromages et des technologies. Le Camembert présente par exemple une majorité de Lactococcus, et seuls les laits fermentés par Streptococcus thermophilus et Lactobacillus bulgaricus peuvent prétendre à l'appellation yaourt (Ronez, 2012).

Elle consiste à précipiter les caséines à leur point isoélectrique (pHi = 4,6) soit :

? par acidification biologique à l'aide de bactéries productrices d'acide lactique (bactéries lactiques contaminant à l'état naturel le lait ou apportées sous forme de levains) (Jeantet et Garric, 2005).

? par acidification chimique (injection de CO2 addition de gluconodeltalactone) (Jeantet et Garric, 2005).

Le gel formé présente une perméabilité satisfaisante, mais une friabilité élevée avec une élasticité et plasticité pratiquement nulles dues au manque de structuration du réseau (Figure 9).

Figure 9. Modification de la structure micellaire au cours de l'acidification
(Jeantet et Garric, 2005)

Il s'agit de l'action de la présure (plus précisément de la chymosine) qui va hydrolyser préférentiellement la caséine á en un site préférentiel de coupure (Figure 10). La coagulation de type présure a généralement lieu pour des pH compris entre 6.2 et 6.7, pH pour lesquels la déminéralisation de la micelle est nulle ou faible. Dans ces conditions, la structure de la micelle est stabilisée (Lenoir et al., 1985).

Figure 10. Modification de la structure micellaire au cours de la coagulation présure
(Jeantet et Garric, 2005).

Ce type de coagulation consiste en l'action de la présure et l'acidification du lait. C'est la voie la plus utilisée dans les industries fromagères en particuliers pour la fabrication des fromages frais (petit suisse, demi sels....) et des fromages à pâte molle (Camembert, Brie...) (Soumeya, 2017).

Dans les deux cas, après formation de coagulum, celui-ci s'exsude et se détache du lactosérum : c'est la synérèse de caillé ou égouttage. Ce phénomène de synérèse est rapide pour le coagulum par emprésurage et lent pour le coagulum acide (Lenoir et al., 1985).

II.4.3. Mécanismes d'action de coagulation On distingue 3 phases de coagulation :

? La phase primaire est la phase enzymatique. Le caséinomacropeptide, qui constitue un fragment hydrophile et chargé de la caséine K, est hydrolysé par l'action enzymatique de la présure (Figure 11) et est éliminé dans le lactosérum. Le fragment de caséine restant est appelé paracaséine K et possède des propriétés hydrophobes. Dans les premières minutes suivant l'apport de l'enzyme coagulante dans le lait, une diminution de la viscosité du lait apparaît; elle s'explique par la diminution de la dimension moyenne des micelles suite à leur hydrolyse (Fox, 2011; Soumeya, 2017).

? La phase secondaire est le début du rapprochement des micelles (Figure 11). Cette phase démarre lorsque environ 85 à 90% des caséines K sont hydrolysées à un pH 6,6

( Soumeya, 2017). La paracaséine K va alors s'agréger aux caséines hydrophobes áS1 et áS2. Les caséines K formant le manteau hydrophile délimitant les micelles voient alors leur hydrophobicité augmenter. Les micelles de caséine perdent alors leur affinité pour la phase aqueuse et vont se rapprocher et s'agréger entre elles sous l'effet des interactions hydrophobes, faisant ainsi cailler le lait (Ronez, 2012).

Le segment 1-105 ou para caséine k est hydrophobe, basique et reste intégré à la micelle, le segment 106-169 ou caséinomacropeptide est très hydrophile, acide et passe dans le lactosérum. Des liaisons hydrophobes et électrostatiques s'établissent alors entre les micelles modifiées et vont entrainer la formation du gel (Zikiou, 2013).

? La phase tertiaire est ce que l'on appelle la phase de réticulation du gel. Celui-ci devient de plus en plus organisé et structuré. Au niveau microscopique, on observe un accroissement des liaisons entre les micelles modifiées (Figure 11), principalement des interactions hydrophobes et électrostatiques, ainsi que la formation des ponts phosphocalciques. Elle correspond au niveau macroscopique au durcissement du gel. (Ronez, 2012).

Les micelles agrégées subissent de profondes réorganisations par la mise en place de liaisons phosphocalciques et peut être de ponts disulfures entre les para caséines (Zikiou, 2013). Des liaisons électrostatiques et des liaisons hydrophobes participent à la formation du gel. Le calcium ionique et le phosphate de calcium colloïdal jouent aussi un rôle déterminant dans le phénomène (Soumeya, 2017).

Figure 11. Formation d'un caillé par action de la présure sur les caséines du lait
(d'après de modèle de Schmidt & Walstra, 2012)

CHAPITRE III. Les métabolites secondaires

Les métabolites secondaires végétaux sont des molécules essentielles à la vie des plantes et leur interaction avec l'environnement. Ils sont également des sources importantes pour les produits pharmaceutiques, les additifs alimentaires et les arômes.

La concentration de ces molécules dans les différentes parties des plantes est influencée par plusieurs facteurs environnementaux tels que la température, l'humidité, l'intensité lumineuse, l'eau, les sels minéraux et le CO2 (Ramakrishna et Ravishankar, 2011). A titre d'exemple, Gengmao et al., (2015) ont observé que l'effet du stress salin est hautement significatif sur la concentration des flavonoïdes (métabolites secondaires) au niveau des feuilles du carthame (Figure 12) (Roumeissa et Maya, 2015; Rachedi et al., 2018).

Figure 12. Effet du stress salin sur la concentration des flavonoïdes au niveau des
feuilles du carthame (Roumeissa et Maya, 2015)

Les composés phénoliques sont des substances présentes dans tous les végétaux et dans tous les organes de la plante. Ils possèdent un noyau aromatique portant un ou plusieurs groupements hydroxyles (Roumeissa et Maya, 2015).

Les composés phénoliques jouent un rôle essentiel dans la structure et la protection des plantes (Stalikas, 2007). Ils offrent également, pour la santé humaine, une protection contre certaines maladies impliquant un stress oxydatif, comme les cancers et les maladies cardiovasculaires et neurodégénératives (Sun et al., 2011).

Les polyphénols sont caractérisés par la présence d'au moins un noyau benzénique auquel est directement lié au moins un groupe hydroxyle, libre ou engagé dans une autre fonction : éther, ester, hétéroside (Boubekri, 2014a).

Les flavonoïdes constituent un groupe de plus de 6000 composés naturels qui sont quasiment universels chez les plantes vasculaires. Ils constituent des pigments responsables des colorations jaune, orange, et rouge de différents organes végétaux. Tous les flavonoïdes possèdent la même structure de base (C6-C3-C6), ils contiennent quinze atomes de carbone dans leur structure de base: deux cycles aromatiques A et B à six atomes de carbones (Figure 13) liés avec une unité de trois atomes de carbone qui peut ou non être une partie d'un troisième cycle C (Boubekri, 2014a).

Les flavonoïdes jouent un rôle très important dans la croissance des plantes, la floraison, la fructification et la défense contre les maladies et les microorganismes. Ils ont également un rôle très important pour la santé humaine. A titre d'exemple, ils sont efficaces pour l'inflammation chronique, les maladies allergiques, les maladies coronariennes et le cancer. (Roumeissa et Maya, 2015).

Les tanins sont des substances poly phénoliques de structures variées, ayant en commun la propriété de tanner la peau, c'est-à-dire de rendre imputrescible. Ces substances ont en effet la propriété de se combiner aux protéines, ce qui explique leur pouvoir tannant.

On distingue: les tanins hydrolysables et les tanins condensés. Les tanins sont largement répandus dans les organismes végétaux et plus particulièrement dans les fruits, les graines

de céréales et diverses boissons. Dans l'alimentation humaine, les sources les plus importantes de tannins sont le vin et le thé (Boubekri, 2014b).

Ce sont des oligomères ou des polymères de flavane-3-ol dérivés de la catéchine ou de son isomère. Ils ont la propriété de coaguler les protéines du derme, d'où leur utilisation dans le tannage des peaux (Nadir, 2016).

Les tanins condensés (Figure 14) sont des polyphénols de masse molaire élevée. Ils résultent de la polymérisation auto-oxydative ou enzymatique des unités de flavan-3,4-diol liées majoritairement par les liaisons C4-C8 (parfois C4-C6) des unités adjacentes, et se nomment ainsi pro anthocyanidines de type B. Lorsque la condensation se produit entre les unités adjacentes par la liaison C4-C8 et par une liaison d'éther additionnelle entre et C7, les pro anthocyanidines sont dits de types A (Boubekri, 2014a).

Les tanins hydrolysables (Figure 15) ou acides tanniques sont des polymères de l'acide gallique ou de son produit de condensation ; l'acide éllagique. Ils ont un poids moléculaire plus faible et précipitent beaucoup moins les protéines que les tanins condensés.

Ils peuvent diminuer la dégradation des parois dans le rumen et être hydrolysés dans l'intestin en libérant des produits toxiques pour le foie et le rein. Ils sont divisés en

éllagitannins et gallo tannins. Les gallo tannins libèrent de l'acide gallique par hydrolyse acide, hydrolyse basique, à l'eau chaude ou par action enzymatique (Boubekri, 2014a).

Les propriétés biologiques que possèdent un certain nombre de plantes présentent un intérêt énorme pour l'Homme dans le domaine agroalimentaire, pharmaceutique, médicale et même dans la recherche scientifique. Cependant des composés phénoliques ou des coagulants sont beaucoup utilisés dans le domaine alimentaire et médical.

Le but de notre travail pratique est de contribuer à la valorisation de deux plantes du genre Cynara (Cynara scolymus = artichaut cultivé) et (Cynara cardunculus = artichaut sauvage) sur l'évaluation de l'activité coagulante des extraits de fleurs dans le lait de vache en comparaison de celle de la présure. Aussi, le dosage des composés phénoliques dans les fleurs et bractées, et l'évaluation de leurs activités antioxydantes.

Pour rendre compte des résultats de notre travail, nous avons procédé comme suit :

Le présent travail a été réalisé au niveau du laboratoire de Technologie Alimentaire de l'Institut National de Recherche Agronomique de Rabat (INRA).

? Volet échantillonnage : inclue l'échantillonnage du matériel végétal du l'artichaut sauvage (Cynara cardunculus) et l'artichaut cultivé (Cynara scolymus), celui du lait frais de bovin et de la présure.

? Volet biochimique : inclue l'extraction des composés phénoliques à partir des bractées de l'artichaut cultivé et celui sauvage, dosage des polyphénols totaux, des

flavonoïdes, des tanins condensés et aussi de l'activité antioxydante par deux méthodes (DPPH, ABTS).

Ce volet inclue aussi l'extraction de l'extrait coagulant du lait à partir des fleurs de l'artichaut sauvage et de l'artichaut cultivé, et l'évaluation de l'activité coagulante et protéolytique de ces extraits dans le lait.

L'échantillonnage de la partie florale de ces deux plantes a été effectué sur les deux stades c'est-à-dire le premier stade où il n'y a pas l'ouverture de la fleur tandis que le second stade correspond à la présence d'une ouverture concrète de la fleur.

Pour le premier stade, les fleurs de l'artichaut cultivé (Figure 16) ont été récoltées dans la région de Sidi Slimane (ville du Nord-Ouest du Maroc, située environ à 60 km de la ville portuaire de Kénitra) au début du mois d'avril 2019, et au mois de juin avec l'apparition nette des fleurs (Figure 17) on a procédé à l'échantillonnage pour le second stade. Les fleurs de l'artichaut sauvage (Figure 18) ont été récoltées dans les montagnes d'Oulmès au début du mois d'avril pour le premier stade et le mois de juin pour le second stade (Figure 19).

Le matériel végétal utilisé est constitué de la partie florale (bractées et fleurs) de l'artichaut Cynara scolymus et Cynara cardunculus. Les fleurs et les bractées sont séchées par lyophilisation afin de conserver les molécules sensibles à la chaleur telle que les enzymes, les protéines. Cette technique de déshydratation conserve la qualité nutritionnelle et organoleptique des aliments et les propriétés biologiques des molécules. Après séchage, le broyage est effectué à l'aide d'un Moulinex à café (Figure 20) ou un broyeur électrique (Figure 21).

Le lait utilisé pour la détermination de l'activité coagulante est le lait de vache (Figure 22) et a été récolté dans la région de Zaër. La présure (Figure 23) est celle utilisée par la société Ajbane Chefchaouen spécialisée dans la fabrication du fromage. Elle est un

coagulant microbien issu du mucor pepsine, produit par fermentation en utilisant une souche sélectionnée du champignon Rhizomucor miehei.

II.2. Extraction des composés phénoliques II.2.1. Préparation des extraits

La méthode d'extraction suivie dans notre étude est l'extraction par macération effectué selon le protocole proposé par Romani et al., (2006) avec quelques modifications. Le principe de cette méthode se base sur la macération de matériel végétal dans un solvant d'extraction acétone 70% suivi d'une agitation ainsi que la centrifugation pendant 20 minutes. La partie de la plante utilisée est le capitule du chardon et d'artichaut : bractées.

Le protocole se résume comme suit (Romani et al., 2006) : 2g de poudre de fleur/bractée d'artichaut

Macération au bain marie 40°C avec agitation dans 20 ml d'acétone 70% pendant 3h

II.2.2. Dosage des composés phénoliques II.2.2.1. Dosage des polyphénols totaux

Le dosage des polyphénols totaux a été fait en utilisant le réactif de Folin-Ciocalteu. Cette méthode a été décrite Singleton et Rossi (1965). Depuis, son utilisation s'est largement répandue pour caractériser les extraits végétaux d'origines plus diverses.

Le réactif de Folin-Ciocalteu est un acide de couleur jaune constitué par un mélange d'acide phosphotungstique _(H3PW12O40) et d'acide phosphomolybdique _{(H3PMo12O40).} Il est réduit lors de l'oxydation des phénols, en un mélange d'oxydes bleus de tungstène et de molybdène (Ribéreau-Gayon et Peynaud, 1968). La coloration produite, dont l'absorption maximum à 765nm est proportionnelle à la quantité de polyphénols présents dans les extraits végétaux (Boizot et Charpentier, 2006).

Les polyphénols (PP) ont été déterminés par spectrophotométrie, suivant le protocole appliqué par Li et al. (2007). 100 ìl d'extrait végétal dilué 20 fois est mélangé avec 500 ìl de réactif de Folin Ciocalteu (FCR) dilué 10 fois dans de l'eau distillée. Après 4 minutes d'incubation, 400 ìl de carbonate de sodium (Na2CO3) à concentration de 7,5% sont ajoutés. Après une incubation du mélange réactionnel pendant 1 heure 30 minute à température ambiante en l'obscurité, l'absorbance est mesurée à 765 nm.

La courbe d'étalonnage (Annexe 2) est effectuée par l'acide gallique à différentes concentrations (0 - 50 ìg/ml), dans les mêmes conditions et les mêmes étapes du dosage. Les résultats sont ainsi exprimés en mg/ml en se référant à la courbe d'étalonnage d'acide gallique.

Les flavonoïdes possèdent un groupement hydroxyle (OH) libre, en position 5 qui est susceptible de donner avec le groupement CO, un complexe coloré avec le chlorure d'aluminium.

Les flavonoïdes forment des complexes jaunâtres par chélation des métaux (fer et aluminium). Ceci traduit le fait que le métal (Al) perd deux électrons pour s'unir à deux atomes d'oxygène de la molécule phénolique agissant comme donneur d'électrons.

La détermination des flavonoïdes totaux a été effectuée selon la méthode décrite par Dehpour et al., (2009) ayant subi quelques modifications : 500 ìl de chaque extrait à analyser sont ajoutés à 1500 ìl de acétone 70 %, 100 ìl de AlCl3 à 10 % (m/v), 100 ìl d'acétate de sodium 1 M et 2,5 ml d'eau distillée.

Le mélange est agité puis incubé à l'obscurité et à température ambiante pendant 30 min. Le blanc est réalisé par remplacement de l'extrait par d'acétone 70% et l'absorbance est mesurée à 415 nm en utilisant un spectrophotomètre UV (Perkin Elmer). Les résultats sont exprimés en concentration mg/ml en se référant à la courbe d'étalonnage de la quercétine. (Annexe 3)

Les tanins condensés sont déterminés par la méthode de la vanilline en milieu acide décrite par (Taouzinet, 2017). Le réactif de vanilline a été préparé en mélangeant 4 g de vanilline dans 100 ml de l'éthanol.

Le mélange a été maintenu à 30 °C avant le dosage. 100 ìl de chaque extrait à analyser ont été ajoutés à 1500 ìl du réactif de vanilline 4 % et après on ajoute 750 ìl de HCl concentré à 37%. Le mélange a été agité puis incubé à l'obscurité à 30°C pendant 20 min. L'absorbance est mesurée à 550 nm par un spectrophotomètre UV (Perkin Elmer) contre un blanc constitué d'un mélange d'acétone 70% et de HCl (37%) à volume égal. Les résultats sont exprimés en concentration mg/ml en se référant à la courbe d'étalonnage du catéchol (Annexe 4).

L'activité antioxydante a été évaluée en testant l'activité scavenging du radical DPPH, et ABTS+.

Le test au 2,2-diphényl-2-picryl-hydrazyle (DPPH.), permet de mesurer le pouvoir réducteur des substances antioxydantes contenues dans un extrait.

Le DPPH est un radical libre de couleur violette qui devient jaune quand il est réduit par un donneur de proton H⁺.

Où AH est un composé capable de céder un H⁺ au radical DPPH (Ibra et al., 2017). ? Protocole

Le protocole expérimental utilisé est celui de Ibra et al., (2017) avec quelques modifications. La solution de DPPH est préparée par solubilisation de 4mg de DPPH dans 100 ml d'éthanol. 200 ìl de l'extrait mélangé avec 1800 ìl de la solution de DPPH. Le mélange est agité puis incubé à l'obscurité et à température ambiante pendant 30 min. Le blanc est réalisé par remplacement de l'extrait par d'acétone 70% et l'absorbance est mesurée à 517 nm en utilisant un spectrophotomètre UV (Perkin Elmer).

Le pouvoir anti-radicalaire de l'extrait est exprimé en pourcentage d'inhibition du radical

Ce test est basé sur le mécanisme d'oxydoréduction de l'ABTS (sel d'ammonium de l'acide 2,2-azino bis-(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique)).Au cours de ce test, le sel d'ABTS perd un électron pour former un radical cation (ABTS. +) de couleur sombre (vert bleu) en solution. En présence de l'agent antioxydant, le radical ainsi formé est réduit pour donner le cation ABTS⁺, ce qui entraine la décoloration de la solution (Owen et Johns, 1999).

L'addition d'un antioxydant à une solution de ce radical cationique entraine la réduction de ce radical et une diminution de l'absorbance. Cette diminution dépend de l'activité antioxydant des composés testes, du temps et de la concentration (Re et al., 1999)

Le pourcentage d'inhibition du radical ABTS.⁺ est évalué par la méthode de (Nadir, 2016).

La solution d'ABTS. + est préparée par mélange de 7 mM d'ABTS et de 2,45 mM de persulfate de potassium incubé pendant 12-16h à l'abri de la lumière et à température ambiante avant l'utilisation. La solution d'ABTS est diluée avec l'éthanol jusqu'à l'obtention d'une absorbance de 0,7(#177; 0,02) à 734 nm. 1,9 ml de la solution d'ABTS sont additionnés à 100 ìl de l'extrait.

Après l'incubation pendant 7 min à l'obscurité et à température ambiante, on mesure la réaction de réduction de la solution d'ABTS à 734 nm. La capacité antioxydante des extraits testée, est exprimée par rapport aux concentrations de standard Trolox (TEAC) ; ce qui donne des indications utiles sur le potentiel antioxydant de l'extrait de plantes.

Le pouvoir anti-radicalaire de l'extrait est exprimé en pourcentage d'inhibition du radical ABTS+ :

II.2.4. Extraction du système enzymatique des fleurs II.2.4.1. Obtention de l'extrait enzymatique des fleurs

Le système enzymatique utilisé a été obtenu à partir des fleurs lyophilisées (Figure 26). Elles ont subi une congélation pendant trois jours suivis d'une lyophilisation d'une semaine puis un broyage grâce à un broyeur électrique.

Le protocole utilisé dans ce travail est celui décrit par Tsouli (1974)et optimisé par (Nouani et al., 2009) subit quelques modifications : broyage et macération (Figure 27) pendant 24h à température ambiante et à l'obscurité de 10 g de fleurs sèches dans 100 ml du tampon d'acétate de sodium (0,1 M à pH 5) additionné de 0,2% d'acide borique afin d'éviter ultérieurement toute prolifération de microorganismes. Dans le but d'extraire le maximum de matière enzymatique le tout est congelé à -22°C pendant 48h puis décongelé à température ambiante sous une agitation douce pendant 1h, le liquide est ensuite centrifugé à 4200 g pendant 10 minutes, le surnageant est ensuite filtré et l'extrait brut des fleurs de l'artichaut est obtenu (Figure 28).

L'activité protéolytique est mise en évidence par un dosage colorimétrique des groupements tyrosine à l'aide du réactif de Folin-Ciocalteu ; conformément à la technique décrite par Aicha (2003) cité dans Zikiou et Zidoune (2019) avec quelques modifications. La comparaison de l'activité protéolytique a été faite entre l'extrait enzymatique des fleurs séchées et la présure d'origine microbienne avec un gradient de concentration de: 25%, 50%, 75% et 100%.

? La première étape étant la réaction enzymatique, dont le mélange est constitué de : 1 ml de l'extrait! présure, 1.5 ml de tampon citrate ! sodium 0.05 M, pH 5.5 et 2.5

L'incubation se fait au bain marie à 40°C, après 1 h on ajoute 5 ml de T.C.A à 4% pour arrêter la réaction et permet la précipitation de la caséine non hydrolysée. Les blancs réactionnels sont préparés de la même manière que l'échantillon sauf qu'ici le TCA est rajouté bien avant le substrat afin d'empêcher la réaction enzymatique. La centrifugation a été faite de 3000 rpm pendant 5 minutes enfin de récupérer le surnageant.

? La deuxième étape étant le dosage colorimétrique, après centrifugation les composés azotés non protéiques qui se trouvent dans la phase soluble, sont dosés selon la méthode d'Anson (1958) : 0.5 ml de surnageant avec 2.5 ml de Na2CO3 à 2% dans NaOH 0.1 N.

Après agitation et repos 10 min, on ajoute 0.25 ml de réactif de Folin-Ciocalteu dilue au 1/2. Bien agiter et incuber 30 minutes à température ambiante. L'absorbance est lue contre le blanc réactionnel à 750 nm au spectrophotomètre.

L'activité est calculée par référence à une courbe d'étalonnage établie en utilisant la tyrosine comme standard. La gamme étalon est réalisée à partir d'une solution de tyrosine dont les concentrations sont comprises entre 0 et 80 jig /ml. L'unité de l'activité protéolytique correspond à 1 jig de la tyrosine libéré par 1ml d'extrait enzymatique en une heure d'incubation. La concentration de la tyrosine contenue dans le filtrat est déduite par référence à une courbe d'étalonnage de la tyrosine (Annexe 1).

L'activité protéolytique de l'extrait des fleurs est comparée à celle de la présure, prise comme témoin.

L'activité coagulante est déterminée selon la méthode de Berridge (1952) et tel que modifié par Collins et al. (1977), Nouani et al. (2009) et Soumeya (2017). Cette méthode permet d'exprimer l'activité de l'extrait enzymatique en force coagulante. Il représente le volume

du lait coagulé par unité de volume de l'extrait enzymatique en 40 min, à 35 ° C et à pH 6,4 en fonction de la formule. Une unité Soxhlet (US) est définie comme la quantité d'enzyme qui coagule 1 ml d'une solution de substrat de Berridge à 30°C pendant 40minutes.

L'analyse des données a été effectuée par le logiciel Graphpad Prism 7.0 et les analyses statistiques ANOVA ont été réalisées à l'aide du logiciel SPSS version 23 . L'analyse de la variance a été appliquée pour déterminer la différence significative à p<0,05 entre plantes et stades.

III.1.Teneur en eau du matériel végétal

La teneur en eau est le rapport entre le poids sec et le poids total du matériel végétal

Après lyophilisation de l'échantillon végétal, la perte d'eau de la fleur de deux plantes a été considérable. De ce fait pour le premier stade nous remarquons que la teneur en eau est supérieure à celle du second stade quand la partie florale est mature. La teneur en eau de la partie florale utilisée pour toutes ces deux plantes est de 80% pour le premier stade tandis qu'elle est de 63% pour le second stade.

D'après les analyses statistiques effectuées par SPSS montrent une différence très significative (p<0,007) entre le second stade plante cultivée et le premier stade plante sauvage. Une différence significative (p<0,05) se manifeste entre le second stade plante sauvage et second stade plante cultivée. La comparaison des autres stades surtout entre le premier stade plante cultivée ne montre pas des différences entre eux. Les résultats des concentrations en polyphénols totaux sont présentés dans la figure 29.

D'après cette figure 29 on constate que les concentrations des polyphénols totaux de la plante sauvage sont supérieures à ceux de la plante cultivée sur les deux stades. Les moyennes avec leur valeur standard sont exprimées dans le tableau 8.

PPTs : Polyphénols totaux pour extrait de la plante sauvage ; PPTc : Polyphénols totaux pour extrait de la plante cultivée

III.2.2. Flavonoïdes

D'après les analyses statistiques avec SPSS, montrent des différences significatives (p<0,017) entre le premier stade plante cultivée et le premier stade plante sauvage (p<0,000) et entre le second stade plante cultivée. Les autres différences hautement significatives se trouvent entre la plante sauvage au premier stade et plante cultivée et sauvage au second stade (p<0,000), et aussi les différences hautement significatives se remarquent entre la plante cultivée et plante sauvage au second stade (p<0,000). Les résultats des concentrations en flavonoïdes sont présentés dans la figure 30.

Les extraits de la plante sauvage manifestent des concentrations en flavonoïdes supérieurs à celles de la plante cultivée. Les moyennes des concentrations sont mentionnées dans le tableau 9.

FLVs: Flavonoïdes pour l'extrait de la plante sauvage ; FLVc: Flavonoïdes pour l'extrait de la plante cultivée.

D'après les analyses statistiques avec SPSS, montrent des différences hautement significatives entre le premier stade plante cultivée et le second stade plante cultivée (p<0,000) et entre le second stade plante sauvage (p< 0,000). Les autres différences significatives se trouvent entre la plante sauvage au premier stade et plante cultivée au second stade (p<0,004), et aussi entre plante sauvage au premier stade et la plante sauvage au second stade (p<0.01). Les résultats des concentrations en tanins condensés sont présentés dans la figure 31 et dans le tableau 10.

Les concentrations en tanins condensés sont élevées en premier stade chez la plante cultivée par rapport à celles de la plante sauvage tandis qu'au second stade les concentrations sont un peu élevées cette fois ci pour la plante sauvage. Les moyennes des concentrations sont mentionnées dans le tableau 10.

TNCs: Tanins condensés pour l'extrait de la plante sauvage ; TNCc: Tanins condensés pour l'extrait de la plante cultivée.

La différence significative se remarque entre le premier stade de la plante sauvage et le second stade de la plante sauvage (p<0.013). Les autres stades ne manifestent pas une différence significative. Les résultats du pouvoir anti radicalaire par DPPH des différents extraits pour les deux stades sont rassemblés dans la figure 32 et le tableau 11.

Tous les extraits des plantes montrent des effets scavenger du radical DPPH sur tous les deux stades. Les moyennes des pourcentages d'inhibition de DPPH sont rassemblées dans le tableau 11.

Afin de valider les résultats de l'efficacité antioxydante des extraits de Cynara obtenus précédemment par le test anti-radicalaire du DPPH, nous avons utilisés un ^2ième test basé sur la capacité de piégeage du proton du radical cationique ABTS⁺. Les pourcentages d'inhibition pour les extraits de ces plantes sont représentés par la figure 33 et dans le tableau 12.

D'après les analyses statistiques montrent des différences hautement significatives (p<0.000) entre le premier stade de la plante cultivée et le second stade plante cultivée, et entre le premier stade de la plante cultivée et le second stade plante sauvage. D'autres différences hautement significatives (p<0.000) se remarquent entre le premier stade plante sauvage et second stade plante cultivée, et entre le premier stade plante sauvage et le second stade plante sauvage. Entre le premier stade de la plante cultivée et le premier stade plante sauvage, il n'y a pas de différence significative.

Tous les extraits des plantes montrent des effets scavenger du radical ABTS sur tous les deux stades malgré une diminution remarquable de pourcentage au second stade. Les moyennes des pourcentages d'inhibition d'ABTS sont présentées dans le tableau 12.

III.3.3. Discussion sur les composés phénoliques et l'activité antioxydante

D'après la figure 29 et le tableau 8 montrent que les concentrations des polyphénols totaux de la plante sauvage sont supérieures à ceux de la plante cultivée sur les deux stades. Le premier stade manifeste des concentrations plus élevées pour les deux plantes que dans le second stade. Ça peut s'expliquer par le fait que les plantes immatures ont besoin beaucoup de métabolites secondaires tels que les polyphénols totaux, flavonoïdes et autres pour se

protéger contre conditions climatiques défavorables, lutter contre les maladies, ravageurs. Au fur et à mesure que la plante devient mature les concentrations phénoliques diminuent.

Ces résultats sont similaires à ceux trouvés par (Velez et al. 2012) disant que entre les plantes ayant le même temps de récolte, la quantité de phénols est plus élevée chez le cardon sauvage (var. sylvestris) que chez le cardon cultivé. En plus Velez et ses collaborateurs (2012) confirment que la concentration en phénol dans les inflorescences dépend à la fois du moment de la récolte et de la variante du cardon. Les extraits obtenus à partir d'inflorescences immatures présentent des concentrations en phénol supérieures à celles obtenues d'inflorescences matures.

Les extraits de la plante sauvage manifestent des concentrations en flavonoïdes supérieurs à celles de la plante cultivée. En plus c'est avec le premier stade que manifestent beaucoup de concentrations (Figure 31 et Tableau 9) en flavonoïdes. Comme les polyphénols totaux, les flavonoïdes participent dans la protection des végétaux envers les conditions défavorables et surtout pour les plantes jeunes. On peut ajouter que les plantes qui poussent spontanément dans la nature ont besoin nécessairement plus de composés phénoliques pour s'y adapter.

Dixon et Pasinetti, (2010) confirment que la localisation vacuolaire de nombreux flavonoïdes permet leurs fonctions de filtrage de la lumière, de photo protection et de pigmentation, mais probablement pas leurs fonctions antioxydantes. En plus, Vicente et Boscaiu, (2018) confirment qu'ils remplissent beaucoup des fonctions biologiques, principalement médiatrices des interactions entre les plantes et l'environnement et participent à la défense des plantes contre les agents pathogènes. Ils participent également aux mécanismes de tolérance pratiquement à tous les types de stress abiotique, y compris les rayonnements UV, températures extrêmes, exposition à l'ozone, sécheresse ou salinité. Ça pourrait expliquer l'abondance des flavonoïdes dans les bractées de ces deux plantes pour le premier stade où les plantes sont immatures et aussi dans l'extrait sauvage car les plantes sauvages pour survivre ont tellement besoin de ces molécules bioactives en abondance pour s'y adapter.

Les résultats (Tableau 10) ont montré des faibles concentrations en tanins condensés par rapport aux autres composés phénoliques tels que les polyphénols totaux et flavonoïdes. En plus les concentrations en tanins condensés dans les extraits de la plante cultivée sont supérieures à celles de l'extrait de plante cultivée. Cela peut être expliqué par la méthode

d'extraction utilisée et aussi selon la nature de solvants car les tanins condensés sont extraits favorablement par la méthode de décoction aqueuse. Mahmoudi et al. (2013) le confirment en disant que la macération semble être meilleure pour l'extraction des polyphénols totaux et les flavonoïdes avec des solvants d'extraction tels que l'éthanol et l'acétone. En revanche, la décoction aqueuse est plus performante pour l'extraction des tanins condensés alors que pendant notre travail, c'est l'acétone utilisé comme solvant d'extraction.

De cela, il est important d'optimiser les méthodes d'extraction enfin d'extraire le maximum de tanins condensés. Nos résultats montrent des concentrations élevées quand le matériel végétal renferme plus d'eau c'est-à-dire pour le premier stade. Malgré le solvant qui n'est pas favorable à l'extraction des tanins condensés, peut être que la présence de plus d'eau serait la cause de cette concentration supérieure au second stade chez la plante cultivée voir même chez la plante sauvage.

D'après les résultats de notre travail, tous les extraits de deux plantes que ça soit au premier stade ou second stade ont montré des effets scavenging contre les radicaux DPPH et l'ABTS.

En effet, les pourcentages d'inhibition ne sont pas les mêmes pour les deux plantes selon la nature du radical ou selon le stade. Avec le radical DPPH, les analyses statistiques ne montrent pas une différence significative au niveau des stades des plantes. En revanche, entre le premier stade de la plante sauvage et le second stade de la même plante existe une différence significative (p<0.013). La différence dans l'activité anti-radicalaire au DPPH serait probablement due à leur composition en différents composés phénoliques. La réduction du DPPH n'est généralement pas due à l'action d'un seul composé mais aux interactions entre plusieurs composés, ces interactions peuvent exister dans un extrait mais pas dans un autre, conduisant ainsi à cette différence d'activité entre les extraits.

Avec le radical ABTS, la différence n'est pas significative seulement entre le premier stade de la plante cultivée et le premier stade de la plante sauvage. En revanche les autres stades manifestent des différences significatives voire même hautement significative.

De cela, les résultats (Figure 33) sur le pouvoir antioxydant avec le radical ABTS montrent des pourcentages d'inhibition (Tableau 12) très élevés au premier stade pour les deux extraits des plantes autour de 97% et 96% respectivement pour l'extrait sauvage et l'extrait cultivé. Mais au second stade les pourcentages d'inhibition diminuent de 42,7 et 25%

respectivement ceux d'extrait sauvage et d'extrait cultivé. Cette diminution d'inhibition pour le second stade serait expliquée par le fait qu'au fur et à mesure que la plante devient mature, la concentration en composés phénoliques diminue car c'est quand une plante immature a besoin beaucoup des métaboliques secondaires pour se protéger contre les agressions environnementales. Lors du piégeage des radicaux libres les composés phénoliques interagissent avec les électrons non appariés des radicaux et de cela perturbent leur réactivité.

Ça pourrait expliquer pourquoi avec les deux tests on trouve des pourcentages d'inhibition (Tableau 11 et 12) qui ne sont pas les mêmes. Peut-être que c'est parce que, malgré que DPPH et ABTS sont des radicaux libres, ils n'ont pas tous les mêmes électrons non appariés sur leur couche périphérique. Le DPPH a un seul électron non apparié tandis que l'ABTS renferme deux électrons non appariés. D'où pour inhiber l'ABTS nécessiterait plus de concentration en composés phénoliques qu'inhiber le DPPH.

Les résultats montrent que les bractées de ces deux plantes (plante sauvage et plante cultivée) manifestent des pouvoirs d'inhibition considérables. D'autres auteurs (Ramos et al. 2014) qui ont travaillé sur la partie de la plante d'artichaut ont trouvé que les extraits de feuilles et de capitules présentaient les activités antioxydantes les plus faibles. Cependant, tous les extraits présentaient une activité antioxydante inférieure à celle de l'acide ascorbique (2,29 #177; 0,11 g / ml) et du BHT (16,02 #177; 3,59 g / ml).

Toutes les coagulases qu'elles soient animales, végétales ou microbiennes, sont capables d'hydrolyser la caséine K, provoquant ainsi la coagulation du lait. Toutefois cette condition est suffisante pour l'utilisation de ces enzymes en industrie fromagère (Alais, 1984). Cependant, pour assurer un bon rendement fromager et pour éviter certains défauts de goût et de texture qui peuvent apparaitre sur les fromages, ces coagulases doivent présenter une protéolyse générale faible (Zikiou et Zidoune, 2019).

Les résultats obtenus montrent que l'activité protéolytique de la présure microbienne est supérieure à celle des deux extraits de fleurs. Elle est de 280 ug/ml pour la concentration de 100% tandis que pour les deux extraits des plantes ont une activité protéolytique d'environ 90 ug/ml. Et avec 75% de concentration, on a 250 ug/ml pour la présure, 75 ug/ml pour l'extrait de fleur de la plante sauvage contre 45 ug/ml pour la plante cultivée. Et avec 50%, on a 210 ug/ml, 50 ug/ml et 10ug/ml pour l'extrait de la plante cultivé.

Avec une faible concentration de 25%, seule la présure manifeste une activité protéolytique de presque de 190 ug/ml et presque de 10 ug/ml pour la plante sauvage.

^{4 0 0}

^{3 0 0}

^{Plante sauvage}

^{Plante cultivée}

^{P ré s u re}

^{2 0 0}

^{1 0 0}

⁰

Figure 34. Activité protéolytique de deux extraits des fleurs comparée avec celle de la

Les résultats ont montré que l'activité protéolytique est plus élevée quand la concentration est élevée. Il n'y a pas d'activité pour la concentration de 25% pour l'extrait de fleurs de la plante cultivée et celle de l'extrait de fleurs de plante sauvage est plus petite.

Plusieurs auteurs ont parlé de l'activité excessive de l'extrait floral comparée à celle de la présure animale, (Cordeiro et al., 1994). Ils ont montré que l'extrait des fleurs de cardon a

une activité protéolytique trois fois plus importante que celle de la présure animale. Le même résultat était constaté par (Macedo et al., 1993). Quant à Roseiro et al., 2003) et Claverie-MartÌn et Vega-Hernàndez (2007) ont mentionné que l'activité protéolytique des extraits des fleurs du genre Cynara est environ le double de celle de la présure traditionnelle.

Par contre, nos résultats de l'activité protéolytique d'extrait floral comparée à celle de l'activité de présure microbienne issu du champignon Rhizomucor miehei ont montré que l'activité d'extrait floral reste très inférieure à celle de la présure. Cette contradiction des résultats peuvent être due par le fait que nos extraits sont utilisés à l'état brut ou la méthode d'extraction non appropriée. D'où la nécessité d'optimiser toutes techniques afin d'en déduire les conditions propices.

Cette partie est centrée sur la détermination du temps de floculation (Tableau 13) après avoir ajouté 1ml de l'extrait enzymatique brut des fleurs dans 10 ml de lait frais de vache utilisé à une température de 35°C avec un pH de 6,4.

Tableau 13. Temps de floculation différents selon les concentrations de l'extrait et de

	concentration	5 min	10 min	15 min	25 min	40 min	1h
Présure	100%	_	_	_	_	_	+
	75%	_	_	_	_	_	+
	50%	_	_	_	#177;	+	+
	25%	_	_	#177;	+	+	+
Extrait sauvage	100%	#177;	+	+	+	+	+
	75%	#177;	+	+	+	+	+
	50%	_	#177;	+	+	+	+
	25%	_	#177;	#177;	+	+	+
Extrait cultivé	100%	#177;	+	+	+	+	+
	75%	_	+	+	+	+	+
	50%	_	#177;	+	+	+	+
	25%	_	#177;	+	+	+	+

Légende : #177;: première apparition des flocons lors de la coagulation ,
· + : coagulation totale ,
· _ : Absence de coagulation.

Le temps de floculation permet de bien déduire la force coagulante de chaque extrait afin de comparer l'activité coagulante des deux extraits des fleurs avec celle de la présure en fonction des différentes concentrations.

En effet, le temps de floculation diffère selon la nature de l'extrait utilisé (Tableau 13). Il est de 5 min pour l'extrait de fleur de la plante sauvage pour les concentrations de 100% et 75%. Il est de même pour l'extrait de fleur de la plante cultivée mais seulement à 100%. Quant à la présure microbienne, nous constatons que le temps de floculation est très élevé (15 min) avec une concentration moins élevée (25%).

Nous remarquons qu'avec le temps, la coagulation a été très complète (Figure 34) selon la concentration de l'extrait des fleurs et de présure. Ces résultats sont confirmés aussi par (Chazarra et al., 2007; García et al., 2015) attestant que la coagulation du lait dépend également de la concentration d'enzyme. En effet, le temps de coagulation du lait diminue avec l'augmentation de la concentration en enzyme. Elle dépend aussi du pH du substrat autour de 4, sans différence significative du pH étudié entre (3-7) comme l'indiquent Chazarra et al (2007), Zikiou (2013) et Zikiou et Zidoune (2019) .Ces auteurs montrent que pour l'extrait des fleurs de cardon, l'activité passe de 4,16 U.P à pH=5,0 pour se stabiliser à 0,2 U.P. à pH 7,0.

L'activité coagulante pour l'extrait des fleurs (plante sauvage et cultivée) est de 0,333 UP tandis qu'elle est faible pour la présure microbienne utilisée comme témoin (0,111 UP).

Certains auteurs (García et al. 2015) ont trouvé des résultats montrant qu'il y a une différence entre l'activité coagulante avec l'extrait de la fleur sauvage et cultivée : l'activité coagulante de l'extrait d'artichaut (plante cultivée) (46 IMCU ml/1) était

inférieure à celle d'extrait de chardon (plante sauvage) (61 IMCU ml/1) contrairement à ceux qu'on a trouvé où l'activité coagulante de l'extrait de la plante cultivée est la même que pour la plante sauvage mais la différence est remarquable lorsque on dilue les deux extraits. Nos résultats sont aussi inférieurs à ceux trouvés par Zikiou et Zidoune (2019) dont l'activité coagulante est de 3,23 UP pour 1 ml de l'extrait. Cette activité peut être due à d'autres composés contenus dans notre extrait d'où la nécessite de faire une purification pour avoir des résultats similaires.

D'autres études sur les extraits végétaux du même genre Cynara montrent des effets intéressants lors de la fabrication du fromage. Comme l'indique Fernández-Salguero et Sanjuán (1999) que l'hydrolyse de la caséine s'est avérée beaucoup plus étendu et plus rapide dans les fromages fabriqués en utilisant de la présure végétale (la quantité d'azote soluble à 60, 80 et 100 jours d'affinage était supérieur de plus de 28% à celui obtenu avec du fromage produit avec de la présure animale).

CONCLUSION

Les résultats obtenus pour l'analyse quantitative des composés phénoliques des bractées pour les deux plantes, artichaut cultivé (Cynara scolymus) et sauvage (Cynara cardunculus), confirment la présence des composés phénoliques et montre que la plante sauvage est très riche par rapport à celle cultivée. Dans tous les cas, les composés phénoliques du premier stade sont supérieurs à ceux du second stade. Aussi, la plante jeune (premier stade) manifeste des concentrations en composés phénoliques élevés par rapport au second stade.

De même les résultats sur le piégeage des radicaux libres, montrent que l'extrait des bractées de la plante sauvage manifeste un pourcentage d'inhibition élevé à celui de l'extrait de la plante cultivée. Cette différence s'explique par la présence des composés phénoliques élevés chez la plante sauvage.

L'utilisation des protéases végétales pourraient intervenir, en remplacement de certaines protéases d'origine animale ou microbienne importées au prix fort ou d'origine bactérienne susceptible d'être génétiquement modifiée.

L'extrait enzymatique des fleurs étudiées dans notre travail a révélé la présence d'activité coagulante supérieure à celle trouvée pour la présure microbienne. Selon la concentration à 100% de l'extrait enzymatique, seulement à 5 min, on a remarqué l'apparition des flocons

tandis que ça apparaissent à une heure pour la même concentration de présure. Etant donné que la coagulation est l'étape primordiale lors de la fabrication du fromage, cet extrait peut être utilisé par contre l'activité protéolytique de la présure est supérieure à celle de l'extrait de deux plantes. A une concentration de 100%, on a trouvé 280 jig /ml pour la présure, 90 jig /ml pour l'extrait de la plante sauvage et 85 jig /ml de la plante cultivée. A une concentration de 75%, on a trouvé 250 jig /ml pour la présure, 75 jig /ml pour la plante sauvage et 45 jig /ml pour la plante cultivée.

L'activité protéolytique diminue au fur et à mesure que la concentration diminue. En plus l'activité protéolytique de l'extrait de la plante sauvage est supérieure à celle de la plante cultivée.

L'apport de cette étude est non négligeable car les résultats obtenus mettent en évidence la possibilité d'obtention d'un extrait brut coagulant le lait, à partir d'une matière première non exploitée jusque-là au Maroc. Ainsi, et pour des impératifs économiques et technologiques, l'extrait des fleurs de l'artichaut sauvage et cultivé doit être pris en considération.

Les enzymes sont des molécules à forte valeur ajoutée en agroalimentaire. Pour cela, plusieurs études méritent d'être poursuivies pour compléter ce modeste travail et parmi ces études intéressantes nous pouvons citer et proposer les points suivants :

V' Il est nécessaire d'optimiser les méthodes d'extraction pour améliorer le rendement, d'appliquer des méthodes encore plus performantes pour la purification des protéases comme la chromatographie d'affinité

V' La purification de ces derniers par des méthodes chromatographiques dans le but d'éliminer les impuretés et mieux caractériser les enzymes et également pour pouvoir contrôler la cinétique d'hydrolyse.

V' L'utilisation des extraits dans la fabrication des fromages et d'autres fins industrielles

V' L'analyse qualitative de l'extrait final afin de caractériser les métabolites secondaires.

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Annexes

Concentration de	0	20	40	60	80	100	Tyr (jig /ml)
						Solution mère de
0	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5	Tyr (ml)
						T.C.A (ml)
0.5	0.4	0.3	0.2	0.1	0	Na2CO3
2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	Folin-Ciocalteu dilué au 1/2
0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25