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Clonage et expression de la protéine CFP10 de Mycobactérium Tuberculosis dans Pichia Pastoris

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par Bilel Masmoudi
INSAT - Ingénieur 2006
  

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Ministère de l'Enseignement Supérieur

Université du 7 Novembre à Carthage

Institut National des Sciences Appliquées et de Technologie

Projet de Fin d'Etudes

Pour l'obtention du

Diplôme National d'Ingénieur en Sciences Appliquées et en Technologie

Filière : Biologie Industrielle

Sujet :

Clonage et expression de la protéine CFP10 de

Mycobactérium tuberculosis dans Pichia pastoris

Réalisé par : Bilel Masmoudi

Laboratoire d'accueil :

Institut Pasteur de Tunis

Laboratoire d'Immunopathologie, Vaccinologie et Génétique Moléculaire

Responsable laboratoire : Pr. Mohammed Ridha Barbouche

Responsable INSAT : Pr. Mohammed Néjib Marzouki

Année Universitaire : 2005 / 2006

Ce travail a été effectuée au Laboratoire d'Epidémiologie et d'Ecologie Parasitaire de l'Institut Pasteur de Tunis sous la direction scientifique de Dr. Ikram GUIZANI.

Il a bénéficié du soutien financier de l'OMS-EMRO-COMSTECH (programme Applied Biotechnologiy and Genomics in health) et du Ministère de la Recherche Scientifique, de la Technologie et du Développement des Compétences (contrat programme 2004 - 2008).

DEDICACES

Je dédie ce travail

A mes parents,

En témoignage de mon amour et de ma gratitude pour tous les sacrifices et le soutien qu'ils ont consenti pour moi.

A toute ma famille et à tous mes amis.

Remerciements

Si ce Projet de Fin d'Etude peut paraître aujourd'hui, c'est grâce à l'initiative et au soutien de plusieurs personnes qu'il m'est agréable de remercier.

Professeur Mohammed Ridha BARBOUCHE, chef de service à l'institut pasteur de tunis je le remercie profondément pour m'avoir accueilli, permis de réaliser ce travail dans son service et qui a assumé la responsabilité de m'encadrer et de guider mes pas dans le domaine de la recherche. Qu'il trouve ici l'expression de ma grande reconnaissance et mon profond respect.

Professeur Mohammed Néjib MARZOUKI Professeur à l'Institut National des Sciences Appliquées et de Technologie, je le remercie pour ces conseils, son soutien permanent et son attention constante. Je lui témoigne ma profonde gratitude.

Professeur Mokhtar HAMDI, Professeur à l'Institut National des Sciences Appliquées et de Technologie, je le remercie pour avoir eu l'amabilité de présider le jury, qu'il veuille accepter ma profonde gratitude et mon respect.

Professeur Michel ODONOHOU, je le remercie très respectueusement pour avoir bien voulu juger ce travail. Puissent ces quelques lignes lui témoigner ma très grande estime.

Mr. Chaouki BENABDESSELEM, étudiant en thèse de doctorat, à l'Institut Pasteur de Tunis, je le remercie de m'avoir initié à la pratique des techniques de Biologie Moléculaire, de sa compétence de ces précieux conseils et de son assistance pour la réalisation de ce travail. Qu'il veuille accepter mon profond respect.

Melle Meherzia BEN FADHEL, ingénieur que je la remercie pour son aide précieuse dans le séquençage.

Les membres du Laboratoire d'immunopathologie vaccinologie et génétique moléculaire à l'Institut Pasteur de Tunis pour leur grand soutien moral et pour leurs encouragements.

Sommaire

Introduction :

A] Etudes bibliographiques :

I) Les protéines recombinantes.....................................................................10

II) Les critères de choix d'un système d'expression............................................10

II.1) Choix des hôtes cellulaires.....................................................11

II.2) Choix du vecteur d'expression................................................11

III) Les systèmes d'expressions utilisés.............................................................12

III.1) Les hôtes utilisées pour la production des protéines recombinantes.....12

III.1.1) E.Coli..................................................................12

III.1.2) Saccharomyces cerevisiae..........................................12

III.1.3) Les cellules CHO (Chinese Hamster Ovary).....................13

III.1.4) Autres bactéries.......................................................13

III.1.5) Autres levures et champignons filamenteux......................13

III.1.6) Les plantes transgéniques...........................................14

III.1.7) Les animaux transgéniques..........................................14

III.2) Les vecteurs et cassettes d'expression........................................14

IV) Le système d'expression Pichia pastoris.......................................................15

IV.1) Principaux avantages du système.............................................15

IV.2) Le métabolisme du méthanol..................................................17

V) Stratégie d'expression chez Pichia pastoris......................................................17

V.1) Les vecteurs d'expression.......................................................17

V.2) Mode d'intégration du gène d'intérêt..........................................18

V.3) Le nombre de copie de la cassette d'expression..............................19

V.4) Les Modifications post traductionnelles chez Pichia pastoris................19

V.5) Les facteurs agissant sur la cinétique de croissance.........................19

V.6) Les facteurs agissant sur la cinétique de production........................20

VI) La tuberculose...................................................................................20

VI.1) Les bacilles de la tuberculose..................................................21

VI.2) Pouvoir pathogène de Mycobactérium tuberculosis.........................21

VI.3) Diagnostic bactériologique.....................................................22

VI.4)Séquençage de génome de la souche H37Rv.................................22

VI.5) Le gène Rv3874 et l'antigène CFP10.........................................23

B] Matériel et méthodes :

I) Matériels :

I.1) Souches bactériennes et levures utilisées.......................................25

I.2) Vecteur de clonage et d'expression.............................................25

I.2.1) pcDNA3/Rv3874...........................................................25

I.2.2) pPICZáA......................................................................................25

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