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Ministère de l'Enseignement Supérieur
Université du 7 Novembre à Carthage
Institut National des Sciences Appliquées et de
Technologie
Projet de Fin d'Etudes
Pour l'obtention du
Diplôme National d'Ingénieur en Sciences
Appliquées et en Technologie
Filière : Biologie Industrielle
Sujet :
Clonage et expression de la protéine CFP10
de
Mycobactérium tuberculosis dans
Pichia pastoris
Réalisé par : Bilel
Masmoudi
Laboratoire d'accueil :
Institut Pasteur de Tunis
Laboratoire d'Immunopathologie,
Vaccinologie et Génétique Moléculaire
Responsable laboratoire : Pr. Mohammed Ridha
Barbouche
Responsable INSAT : Pr. Mohammed Néjib
Marzouki
Année Universitaire : 2005 / 2006
Ce travail a été effectuée au
Laboratoire d'Epidémiologie et d'Ecologie Parasitaire de l'Institut
Pasteur de Tunis sous la direction scientifique de Dr. Ikram
GUIZANI.
Il a bénéficié du soutien
financier de l'OMS-EMRO-COMSTECH (programme Applied Biotechnologiy and Genomics
in health) et du Ministère de la Recherche Scientifique, de la
Technologie et du Développement des Compétences (contrat
programme 2004 - 2008).
DEDICACES
Je dédie ce travail
A mes parents,
En témoignage de mon amour et de ma gratitude pour
tous les sacrifices et le soutien qu'ils ont consenti pour moi.
A toute ma famille et à tous mes amis.
Remerciements
Si ce Projet de Fin d'Etude peut paraître aujourd'hui,
c'est grâce à l'initiative et au soutien de plusieurs personnes
qu'il m'est agréable de remercier.
Professeur Mohammed Ridha BARBOUCHE, chef de service à
l'institut pasteur de tunis je le remercie profondément pour m'avoir
accueilli, permis de réaliser ce travail dans son service et qui a
assumé la responsabilité de m'encadrer et de guider mes pas dans
le domaine de la recherche. Qu'il trouve ici l'expression de ma grande
reconnaissance et mon profond respect.
Professeur Mohammed Néjib MARZOUKI Professeur à
l'Institut National des Sciences Appliquées et de Technologie, je le
remercie pour ces conseils, son soutien permanent et son attention constante.
Je lui témoigne ma profonde gratitude.
Professeur Mokhtar HAMDI, Professeur à l'Institut
National des Sciences Appliquées et de Technologie, je le remercie pour
avoir eu l'amabilité de présider le jury, qu'il veuille accepter
ma profonde gratitude et mon respect.
Professeur Michel ODONOHOU, je le remercie très
respectueusement pour avoir bien voulu juger ce travail. Puissent ces quelques
lignes lui témoigner ma très grande estime.
Mr. Chaouki BENABDESSELEM, étudiant en thèse de
doctorat, à l'Institut Pasteur de Tunis, je le remercie de m'avoir
initié à la pratique des techniques de Biologie
Moléculaire, de sa compétence de ces précieux conseils et
de son assistance pour la réalisation de ce travail. Qu'il veuille
accepter mon profond respect.
Melle Meherzia BEN FADHEL, ingénieur que je
la remercie pour son aide précieuse dans le séquençage.
Les membres du Laboratoire d'immunopathologie vaccinologie et
génétique moléculaire à l'Institut Pasteur de Tunis
pour leur grand soutien moral et pour leurs encouragements.
Sommaire
Introduction :
A] Etudes bibliographiques :
I) Les protéines
recombinantes.....................................................................10
II) Les critères de choix d'un système
d'expression............................................10
II.1) Choix des hôtes
cellulaires.....................................................11
II.2) Choix du vecteur
d'expression................................................11
III) Les systèmes d'expressions
utilisés.............................................................12
III.1) Les hôtes utilisées pour la
production des protéines recombinantes.....12
III.1.1)
E.Coli..................................................................12
III.1.2) Saccharomyces
cerevisiae..........................................12
III.1.3) Les cellules CHO (Chinese
Hamster Ovary).....................13
III.1.4) Autres
bactéries.......................................................13
III.1.5) Autres levures et
champignons filamenteux......................13
III.1.6) Les plantes
transgéniques...........................................14
III.1.7) Les animaux
transgéniques..........................................14
III.2) Les vecteurs et cassettes
d'expression........................................14
IV) Le système d'expression Pichia
pastoris.......................................................15
IV.1) Principaux avantages du
système.............................................15
IV.2) Le métabolisme du
méthanol..................................................17
V) Stratégie d'expression chez Pichia
pastoris......................................................17
V.1) Les vecteurs
d'expression.......................................................17
V.2) Mode d'intégration du gène
d'intérêt..........................................18
V.3) Le nombre de copie de la cassette
d'expression..............................19
V.4) Les Modifications post traductionnelles
chez Pichia pastoris................19
V.5) Les facteurs agissant sur la
cinétique de croissance.........................19
V.6) Les facteurs agissant sur la
cinétique de production........................20
VI) La
tuberculose...................................................................................20
VI.1) Les bacilles de la
tuberculose..................................................21
VI.2) Pouvoir pathogène de
Mycobactérium tuberculosis.........................21
VI.3) Diagnostic
bactériologique.....................................................22
VI.4)Séquençage de génome
de la souche H37Rv.................................22
VI.5) Le gène Rv3874 et
l'antigène CFP10.........................................23
B] Matériel et méthodes :
I) Matériels :
I.1) Souches bactériennes et
levures utilisées.......................................25
I.2) Vecteur de clonage et
d'expression.............................................25
I.2.1)
pcDNA3/Rv3874...........................................................25
I.2.2)
pPICZáA......................................................................................25
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