VI.5) Le gène Rv3874 et l'antigène
CFP10 :
L'analyse du génome a aussi indiqué la
présence de gènes codant pour des protéines
présentes dans le filtrat de culture de M. tuberculosis et donc
sécrétées. Un de ces protéines est CFP10 (culture
filtrat protein), une petite protéine codée par le gène
Rv3874, c'est un antigène qui est fortement reconnu par les lymphocytes
T humains et provoque une production massive d'IFNã cytokine
nécessaire à l'activité bactéricide du macrophage.
Des études récentes ont montré que cette protéine
est impliquée dans le pouvoir pathogène de M.
tuberculosis. Lors des études de génomique
comparative employant différentes techniques d'hybridation,
plusieurs régions de différence (RD1-RD14), codant pour
environ 140 protéines, ont été trouvées
absentes chez M. bovis BCG, la souche vaccinale, par rapport
à la souche virulente M. tuberculosis H37Rv. Ces
résultats permettent d'étudier de façon
approfondie les différences génétiques potentiellement
impliquées dans la virulence de certains membres du
complexe M. tuberculosis. Par exemple, la région RD1,
qui contient le gène Rv3874, est la seule région absente dans les
souches atténuées M. bovis BCG, et M. microti,
mais elle est présente chez tous les autres membres du complexe M.
tuberculosis. Comme le BCG, la plupart des souches de M. microti
sont inoffensives pour l'homme. Ainsi, M. microti a été
utilisée comme vaccin dans les années 1960 en
Tchécoslovaquie et a fait l'objet de larges essais cliniques au
Royaume-Uni. Lors de la réintroduction de la région RD1 par
complémentation dans le BCG et dans M. microti, la virulence de
ces deux souches vaccinales est partiellement restaurée chez la souris
immunodéprimée. En revanche, la réintroduction de cinq
autres régions de différence (RD3, RD4, RD5, RD7 et RD9),
suspectées d'être impliquées dans la virulence, ne semble
pas avoir d'effet sur le pouvoir pathogène de ces deux souches. Comme la
région RD1 comprend aussi le gène codant pour l'antigène
protéique CFP10, il est maintenant évident que toutes les souches
vaccinales employées à grande échelle dans l'histoire de
la vaccination contre la tuberculose étaient dépourvues de cet
antigène, qui est immunodominant et semble diriger la réponse
immunitaire de l'hôte vers la voie Th1, entraînant la production
d'IFNã. En effet, l'expression de cet antigène dans le contexte
d'un BCG recombinant, ainsi que celle d'autres protéines de la
région RD1 impliquées dans la sécrétion duCFP10,
augmente l'efficacité du BCG vis-à-vis d'une inoculation avec
M. tuberculosis dans différents modèles animaux.
Dès lors, les protéines de la région RD1 sont
considérées comme des cibles potentiellement très
intéressantes dans la prévention (antigène protecteur), le
diagnostic (remplaçant le PPD - épreuve à la tuberculine
-) et la thérapie (cible de médicament). (3).
I) MATERIEL :
I.1) Souches Bactériennes et levures
utilisées :
La souche bactérienne d'Escherichia coli
utilisé est :
- Top10F' : F' [
lacIq Tn10 (TetR) ]
mcrA Ä(mrr-hsdRMS-mcrBC)
80lacZÄM15 ÄlacX74deoR recA1
araD139 Ä(ara-leu) 7697 galU galK
rspL (StrR) endA1 nupG.
- La souche de la levure Pichia pastoris
utilisée est KM71H de phénotype :
arg4 aoxl : ARG4 et de génotype Muts,
Arg+. Elle est fournie par la société Invitrogen.
Cette levure présente plusieurs avantages pour
l'expression de protéines recombinantes par rapport aux systèmes
classiques :
- Un taux d'expression élevé de protéine
de fusion : pouvant aller jusqu'à 12 g/l.
- Un « Scale up » plus facile : le
passage à l'expression en fermenteur est plus facile avec
Pichia qu'avec les bactéries.
- Pichia pastoris s'adapte plus facilement aux
conditions de fermentation que ce soit à des petits volumes (< 1
litre) qu'à des grands volumes (>10 000 litres).
- Un système de sélection simple, varié
et efficace.
Pichia est un système d'expression eucaryote
d'où l'avantage de réaliser des modifications
post-traductionnelles des protéines eucaryotes.
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