I.4.) Les marqueurs de poids
moléculaire :
I.4.1) Marqueurs de poids moléculaire
d'ADN :
2
1
Figure 4 : Marqueurs de poids moléculaire d'ADN
utilisés
1: PhiX-DNA-HaeIII Markers
2: Lambda DNA-HindIII Digest
I.4.2) Marqueur de poids moléculaire de
protéines :
Figure
5 : Marqueurs utilises de poids moléculaire de protéines
RPN 800 (Amersham)
I.5) Les oligonucléotides:
Le couple d'amorces CH1/CH2 (Progligo) : a servi pour l'amplification par
PCR et le clonage du gène Rv3874 dans le plasmide pPICZA entre les sites
de restriction EcoRI et XbaI.
CH1 :
CCGGAATTCGCAGAGATGAAGACC
CH2 :
GC TCTAGACGGAAGCCCATTTGCGA
Le couple d'amorces AOX1F/AOX1R (invitrogen) a servi au
séquençage automatique du gène Rv3874 cloné dans
pPICZA.
I.6) Autres matériels :
-
Les kits :
Kit de purification d'ADN à partir de gel d'agarose : Quiaquick Gel
Extraction Kit (QIAGEN).
Kit de purification d'ADN plasmidique (mini préparation des
plasmides) :QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen).
Kit de purification d'ADN plasmidique (midi préparation des
plasmides) :QIAprep Spin Midiprep Kit (Qiagen).
-
Appareil PCR: Perkin Elmer ,Gene Amp9700.
-
Incubateur agissant thermostaté :INFORS AG , Rittergasse27,
CH-4103 Bottmingen.
-
Séquenceur automatique : ABI PRISMTM 377 sequencer
(PERKIN ELMER Applied Systems).
II)
METHODES:
II.1) PCR :
L'extraction de l'ADNc de Rv3874, à partir du plasmide p CDNA 3, a
été réalisée par PCR. En fait le couple d'amorces
CH1/ CH2 a été utilisé pour amplifier le gène
Rv3874, en introduisant les sites de clonage EcoRI en amont et XbaI en
aval.
Les
conditions de la réaction PCR sont les suivantes :
-
1à10 ng d'ADN/tube.
-
Tampon 10X :5l
-
dNTP(25Mm) :0,5l
-
MgCl2 (25mM) : 2,5 ul
-
Primer forward (20 uM) : 0.5 ul
-
Primer reverse (20 uM) : 0.5 ul
-
Taq poly (5 U/ul) : 0.5 ul.
-
H2O qsp 50 ul.
Les
cycles d'amplification sont comme suit :
-
2 min 94°C
-
30 cycles: - 30 s 94°C
- 30 s 55°C
- 30 s 72°C
-
7 min 72°C.
II.2) Electrophorèse sur gel
d'agarose :
Les profils éléctrophorétiques des produits de PCR, de
digestion, de mini ou midi préparation ont été
analysés après électrophorèse sur gel d'agarose de
0.8 % à 1%, TAE 1 X. Les échantillons ont été
contrôlés sur le gel après avoir été
mélangés avec un tampon d'échantillon (50%
glycérol, 10 mM EDTA et du bleu de bromophénol à 1%)
à une dilution finale de 1/6.
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