II.12) Immunoblot et révélation par
ECL : « Enhanced ChemiLuminescence » :
Après migration et révélation de protéines par
le bleu de Coomassie on veut vérifier si la protéine
récupéré dans le surnageant est bien la protéine
recombinante CFP10-myc-6 his.
Pour
cela on procède à la réalisation d'un immunoblot.
Le
système western Blot ECL (AMERSHAM) est une méthode non
radioactive d'émission de lumière pour la détection
d'antigène spécifique immobilisé, conjugués
directement ou indirectement à des anticorps couplés à la
HRP (Horse Radish Peroxydase).
Après
migration sur gel de polyacrylamide les protéines sont
transférées sur une membrane de nitrocellulose.
La
membrane est ensuite mise dans une solution de saturation (PBS 1X, tween 0.2%,
lait écrémé 3%) puis lavée avec une solution de
lavage (PBS 1 X, tween 1%).
Après
incubation avec les anticorps marqués, on lave de nouveau pour
éliminer les fixations non spécifiques des anticorps et on
révèle par autoradiographie en utilisant le kit ECL d'Amersham.
I)
Clonage de gène Rv3874 dans le vecteur pPICZA :
I.1) Stratégie de Clonage :
L'ADNc
du gène Rv3874 dont la séquence en acides nucléiques est
ci-dessous a une taille de 303 pb et a été extrait à
partir du plasmide pcDNA3:
>Mtub_H37RV:|CFP10|Rv3874
atggcagagatgaagaccgatgccgctaccctcgcgcaggaggcaggtaatttcgagcgg
atctccggcgacctgaaaacccagatcgaccaggtggagtcgacggcaggttcgttgcag
ggccagtggcgcggcgcggcggggacggccgcccaggccgcggtggtgcgcttccaagaa
gcagccaataagcagaagcaggaactcgacgagatctcgacgaatattcgtcaggccggc
gtccaatactcgagggccgacgaggagcagcagcaggcgctgtcctcgcaaatgggcttc
tga.
Cette séquence a été analysée par le logiciel
BioEdit® qui nous a fourni la carte de restriction totale du
gène Rv3874 :
BalI
AvaI
EcoRII
Bal
I
HincII
EcoRII
255
250
153
121
101
90
1
pb
300
pb
-Carte
de restriction simplifiée du gène Rv3874-
Pour le clonage nous avons choisi les deux enzymes EcoR I et Xba I, qui
ne coupent pas au niveau de gène Rv3874 et qui coupent au niveau de site
de clonage multiple de plasmide pPICZA qui est un vecteur navette
destiné à la transformation de la levure Pichia
pastoris.
A
fin d'amplifier spécifiquement le gène d'intérêt
nous avons conçu les amorces de telle façon à obtenir les
jonctions suivantes tout en respectant les cadres de lectures de la
protéine d'intérêt et ceux des peptides en aval.
a
/ Jonction Foward avec EcoR I :
5'...GCT
CAA GCT GAA TTC GCA GAG ATG AAG ACC...3'
3'...CGA
GTT CGA CTT AAG CGT CTC TAC TTC TGG...5'
á Factor EcoRI CFP10
b / Jonction Reverse avec Xba I:
5'...CTG
CAA ATG GGC TTC CGT CTA GAA CAA AAA...3'
*
*
3'...GAC
GTT TAC CCG AAG GCA GAT CTT GTT TTT...5'
CFP 10 XbaI myc
épitope
* A fin de respecter le cadre de lecture de l'épitope myc deux bases C
et G ont été ajoutées en s'assurant que l'acide
aminé ajouté soit neutre qui est l'alanine.
Après
cette étude nous avons choisi les amorces de clonage
suivantes :
CH1 :
CCGGAATTCGCAGAGATGAAGACC
Tm=
46°C.
CH2 :
GC TCTAGACGGAAGCCCATTTGCGA
Tm=
54°C.
Les
parties soulignées correspondent aux séquences Rv3874.
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