I.2) PCR :
Les
amorces CH1 et CH2 ont été utilisés pour amplifier le
gène Rv3874 en introduisant les sites de restrictions EcoRI et XbaI pour
le clonage dirigé dans pPICZáA.
Après
optimisation on a amplifié par PCR le gène Rv3874 pour avoir une
quantité d'ADN suffisante pour le clonage.
Le
produit de PCR est contrôlé sur un gel d'agarose 1%.
M
1
2
300 pb
Figure1 :
Produits de PCR de gène Rv3874
M :
marqueur de poids moléculaire PhiX.
1 :
2ul de produit d'amplification de gène Rv3874 par PCR.
2 :
Contrôle négatif de PCR.
La
taille du gène Rv3874 est de 303pb, ce qui correspond bien à la
taille observée au niveau de piste 2.
I.3) Digestion et purification du produit PCR et du plasmide
pPICZáA :
Afin de cloner le gène Rv3874 dans le vecteur
pPICZáA le plasmide ainsi que l'insert ont été
digéré par les deux enzymes de restrictions
EcoRI et XbaI puis purifiés à partir de gel d'agarose
à faible température de fusion (low melting).
M
![]()
2
1
Figure 2 : Digestion totale de
pPICZáA par EcoRI et XbaI.
Gel
d'agarose 0,8%
M :
marqueur de poids moléculaire lambda DNA-HindIII Digest
1 : pPICZáA digéré totalement avec
EcoRI et XbaI.
2 : pPICZáA non digéré.
La
digestion totale du plasmide pPICZáA (piste1) montre une
linéarisation du plasmide d'où la disparition des
différentes formes de plasmide observées au niveau de la piste
2.
Après
digestion, le vecteur pPICZáA et le produit de PCR sont purifiés
en utilisant la technique d'extraction sur gel.
Les
différentes élutions d'ADN purifiés sont
contrôlés sur un gel d'agarose 0,8
3
2
1
M
![]()
300 pb
Figure 3 : Purification de produits de PCR et pPICZáA
digérés par EcoRI et XbaI.
Gel d'agarose 0,8%.
M :
marqueur de poids moléculaire ÖX.
1 :
1,5 ul de produit d'amplification par PCR de gène Rv3874.
2 :
1,5 ul première élution de pPICZáA
digéré.
3 :
1,5 première élution de produits de PCR
digéré.
Les
deux premières élutions contrôlées sont
utilisées pour la ligation.
I.4) Ligation et transformation des bactéries
compétentes E.coli top 10F'.
Le produit de la ligation a été utilisé pour
transformer des bactéries E.coli top 10 F' compétentes
initialement sensibles à la zéocine.
1.5)
Colonie PCR :
Les
colonies qui poussent sur des boites LBLS agar/zéocine sont des
transformants ayant intégré le plasmide recombinant, la
présence de l'insert est en premier lieu vérifiée par
colonie PCR.
Le
produit de colonie PCR est contrôlé sur gel d'agarose 1%.
5
4
3
2
1
M
C
300 pb
Figure 4 : Contrôle de la colonie PCR,
Gel d'agarose 1%. 5ul de dépôt par piste.
C : Contrôle négatif de PCR.
M : marqueur de poids moléculaire ÖX
1 : contrôle positif de PCR, la matrice étant
l'ADN plasmidique pcDNA3/Rv3874.
2, 3, 4, 5 : colonie positives.
Les quatre clones testés montrent une amplification
identique au témoin positif (C+) correspondant à l'amplification
spécifique par PCR du gène Rv3874.
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