Clonage et expression de la protéine CFP10 de Mycobactérium Tuberculosis dans Pichia Pastoris

I.5) Carte de restriction du plasmide recombinant :

Pour vérifier l'intégrité de notre construction, le plasmide recombinant a été digéré par les mêmes enzymes de clonage EcoRI et XbaI, afin de libérer l'insert du plasmide.

Le produit de digestion est contrôlé sur gel d'agarose 0,8%.

2

1

300 pb

Figure 5: Digestion du plasmide recombinant pPICZáA/Rv3874 par EcoRI et XbaI

1 : pPICZáA/Rv3874 digéré par EcoRI et XbaI

2 : Marqueur de poids moléculaires PhiX

La digestion libère un fragment d'ADN de 303 pb qui correspond au gène Rv3874, donc on peut conclure de la réussite du clonage. La construction obtenue est représentée par la figure suivante :

Figure 6 : plasmide recombinant pPICZáA/Rv3874

I.6) Séquençage automatique :

Vu que la Taq polymérase peut introduire des mutations au niveau des séquences amplifiées, l'intégrité de la séquence nucléotidique de notre construction a été vérifiée par séquençage automatique du plasmide recombinant en utilisant l'amorce AOX (F) et CH1 et de séquençage à l'aide d'un séquenceur automatique : ABI PRISM^TM 377 sequencer (PERKIN ELMER Applied Systems).

1

6His

Xba I

myc epitope

Rv3874

EcoR I

Rv3874

á Factor

1

2

**

Figure7 : Résultat de séquençage automatique du plasmide recombinant pPICZáA/Rv3874

Schéma 1 : séquençage par l'amorce AOX (F).

Schéma 2 : séquençage par l'amorce CH1.

Le résultat de séquençage montre bien l'intégrité de notre cassette d'expression, par la présence des séquences du myc épitope, du 6histidine, des deux sites de restriction EcoR I et Xba I, le á factor et aussi notre gène d'intérêt Rv3874 ainsi que les deux bases qui ont été ajouté pour garder le cadre de lecture de l'epitope myc et le 6histidine.

II) Transformation et expression du gène Rv3874 dans la levure Pichia pastoris KM71H :

II.1) Linéarisation de pPICZáA/Rv3874 :

A partir d'une extraction du plasmide recombinant nous avons linéarisé 10ug d'ADN plasmidique par l'enzyme de restriction BstX1

Le produit de digestion a été utilisé après purification pour transformer des levures Pichia pastoris par éléctroporation.

Le produit de purification est contrôlé sur un gel d'agarose 0,8%

1

2

Figure8 : Contrôle du plasmide recombinant pPICZáA/Rv3874  digéré par BstXI et purifié.

Piste 1 : 1ul de plasmide recombinant pPICZáA/Rv3874  digéré par BstXI et purifié.

Piste 2 : 1ul de plasmide recombinant pPICZáA/Rv3874 non digéré.