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Clonage et expression de la protéine CFP10 de Mycobactérium Tuberculosis dans Pichia Pastoris

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par Bilel Masmoudi
INSAT - Ingénieur 2006
  

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I.3) Digestion et purification du produit PCR et du plasmide pPICZáA........39

I.4) Ligation et transformation des bactéries compétentes E-coli top 10 f'....40

I.5) Colonie PCR........................................................................41

I.6) Carte de restriction de plasmide recombinant.................................41

I.7) Séquençage automatique.........................................................42

II) Transformation et expression du gène Rv3874 dans la levure Pichia pastoris KM71H.............................................................................................43

II.1) Linéarisation de pPICZáA / Rv3874..........................................43

II.2) Transformation par électroporation de la souche KM71H de Pichia pastoris..............................................................................................44

II.3) Production de la protéine recombinante CFP10-myc epitope-6his.........44

II.4) Identification de la protéine recombinante par western blot................45

D] Conclusions et perspectives

Références bibliographiques

Avant propos

Grâce aux avancées scientifiques spectaculaires des vingt dernières années en matière de génie génétique et de biologie moléculaire, il est aujourd'hui envisageable de modifier le patrimoine génétique d'un organisme vivant en lui incorporant un fragment d'ADN provenant d'une espèce différente et de lui faire exprimer cette information génétique étrangère. Ces savoir-faire nouveaux de la génétique ont permis d'ouvrir des voies de recherche et de développement nouvelles aux perspectives considérables. Il devient possible aujourd'hui, en s'appuyant sur ces méthodologies, de reprogrammer le matériel génétique d'un micro-organisme en lui insérant un gène précis, qui lui permettra de produire une protéine recombinante précieuse (à usage médical : interféron, insuline, hormone de croissance... ou industriel : enzymes...).

Cependant, le processus de conversion de l'information génétique en protéine biologiquement active se heurte à plusieurs problèmes aussi bien d'ordre qualitatif que quantitatif tels que le problème de repliement intracellulaire des protéines. En effet de nombreuses protéines recombinantes ne sont pas produites dans leur état natif, et s'agrègent dans un état biologiquement inactif. Pour cette raison, il est souvent souhaitable d'intervenir en amont, sur le système d'expression pour minimiser ces problèmes et donc obtenir une protéine recombinante la plus proche possible de la protéine native.

La tuberculose est une maladie infectieuse chronique, c'est l'un des plus grands fléaux de l'humanité avec plus de dix millions de nouveaux cas et trois millions de décès chaque année.

Cette situation s'aggrave avec l'émergence de souches multirésistantes et le SIDA. Ainsi, la génomique, la protéomique et la transcriptomique ont été rapidement adaptés pour la recherche des gènes à haut potentiel diagnostic ou à intérêt vaccinal.

Mycobactérium. tuberculosis l'agent pathogène de la tuberculose sécrète toute une famille des protéines dites CFP (culture filtrat protéine) dont la protéine CFP10.

Dans ce travail, nous nous sommes donc intéressé au gène Rv3874 qui code pour la protéine CFP10 précocement sécrétée par M.tuberculosis dans le milieu de culture ainsi que dans la première phase de l'infection par ce pathogène. CFP10 est un antigène immunodominant et candidat potentiel pour le diagnostic de la tuberculose.

Dans le but d'obtenir une protéine sous forme recombinante nous avons donc procédé au clonage du gène Rv3874 de M.tuberculosis dans le vecteur pPICZáA destiné à la transformation de la levure méthylotrophique Pichia pastoris que nous avons ensuite transformée par éléctroporation et à la production de cette protéine sous forme recombinante soluble.

I) les protéines recombinantes :

Une protéine recombinante est le résultat d'un transfert du gène d'intérêt qui code pour cette protéine dans une cellule hôte en vue de la produire. L'insuline fut la première protéine recombinante humaine produite au début des années 80 par la technologie de l'ADN recombinant. Cette technologie a bénéficié des avancées scientifiques de ces deux dernières décennies, en matière de génie génétique, de biologie moléculaire ainsi que du développement des techniques de culture des microorganismes à haute densité cellulaire. Au sens large, un système de production adapté à la fabrication d'une protéine recombinante donnée, est un processus biotechnologique qui s'appuie principalement sur :

· L'emploi d'un vecteur d'expression (en général un plasmide ou un virus), jouant le rôle de transporteur génétique du gène d'intérêt codant pour la protéine recherchée.

· L'utilisation d'une cellule hôte, chargée d'exécuter les instructions fournies par le gène d'intérêt qui lui est inséré, dans l'objectif de synthétiser la protéine recherchée.

· Une phase de production proprement dite permettant de fabriquer la protéine souhaitée.

· Enfin, sa purification à partir du milieu de culture.

Au sens restreint, un système de production de protéines recombinantes est caractérisé par un couple constitué d'un vecteur d'expression et d'un hôte (cellules ou organismes entiers tels que des animaux ou des plantes, au quel on a transféré le ou les gènes codant pour ces protéines.).

II) Les critères de choix d'un système d'expression :

Le choix du système d'expression est principalement guidé par les modifications que la protéine doit subir pour être biologiquement active. Bien qu'il existe des techniques permettant le transfert rapide des gènes clonés entre différents systèmes d'expression, le vecteur génétique, utilisé pour exprimer le gène recombinant, doit être adapté à l'hôte choisi. De même, il est important de connaître les compartiments cellulaires dans lesquels la protéine d'intérêt se replie ou exerce son activité biologique naturelle. Selon que cette protéine est cytoplasmique, membranaire ou extracellulaire, le vecteur devra contenir des séquences spécifiques permettant l'adressage correct de la protéine. Pour cela il est nécessaire d'intervenir en amont en optimisant les conditions d'expression de la protéine. Le choix du système d'expression constitue l'une des étapes critiques dans le processus de production des protéines hétérologues. (2).

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