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Clonage et expression de la protéine CFP10 de Mycobactérium Tuberculosis dans Pichia Pastoris

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par Bilel Masmoudi
INSAT - Ingénieur 2006
  

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III.1.1) E. coli :

Avantages : sa génétique est très bien connue. De nombreux vecteurs plasmidiques ont été construits et sont donc disponibles afin d'insérer et d'exprimer un gène étranger au sein de la bactérie. Elle est par ailleurs facile à utiliser, se prête très bien à la culture de masse en fermenteur. Enfin, les taux d'expression obtenus sont élevés, c'est-à-dire qu'elle permet de produire des quantités appréciables de protéines (jusqu'à plusieurs grammes par litre).

Inconvénients : sécrétant mal les protéines, il est souvent nécessaire de "casser" la bactérie afin de récupérer la protéine (ce qui pose des problèmes de purification et nécessite parfois des étapes de solubilisation et de renaturation..., quelquefois au détriment des rendements). Autre inconvénient majeur : E. coli n'effectue pas les modifications post-traductionnelles des protéines (en particulier la glycosylation, la carboxylation, etc.), qui constituent souvent une condition nécessaire pour l'activité de la protéine. Enfin, E. coli étant une entérobactérie, il est donc nécessaire de s'assurer de l'absence d'endotoxines dans les protéines purifiées. (17).

III.1.2) Saccharomyces cerevisiae :

Il s'agit de la levure de boulanger, utilisée depuis des millénaires dans l'alimentation humaine.

Avantages : son matériel génétique est simple et elle ne présente aucune toxicité. Bons vecteurs d'expression disponibles aujourd'hui. Les taux d'expression des protéines sont relativement intéressants (de l'ordre de centaines de milligrammes par litre). La levure est capable de fabriquer des protéines complexes et de réaliser des modifications post-traductionnelles (glycosylation, phosphorylation, acylations...).

Inconvénients : le problème majeur pour les protéines synthétisées dans Saccharomyces cerevisiae est l'hyperglycosylation des protéines produites. Les protéines sont souvent obtenues à l'intérieur du cytoplasme nécessitant ainsi de casser la cellule afin de les récupérer. La sécrétion est possible, mais en général au détriment du rendement. Elle fonctionne bien pour des petits polypeptides tels que l'insuline, mais beaucoup moins bien pour de grandes protéines. (17).

III.1.3) Les cellules CHO (Chinese Hamster Ovary)

Avantages : méthode déjà employée dans la production d'un vaccin contre l'hépatite B, les cellules CHO se prêtent très bien à la culture en masse dans le bioréacteur. Un avantage discriminant de ces cellules réside dans leur capacité à synthétiser des protéines complexes de poids moléculaire élevé. Certains vecteurs d'expression (BPV -Bovine Papilloma Virus-, SV40...) permettent d'introduire et de faire exprimer des gènes humains dans ces cellules

Inconvénients : rendement faible (de l'ordre de 10 milligrammes par litre au maximum). Par ailleurs, les cellules CHO s'avèrent fragiles et leur culture est plus onéreuse. (18).

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